Name: Focale Ca 2 + Rilevamento transitoria nel muscolo liscio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 41 s
Description: Scopri la tecnica di imaging del calcio nel muscolo liscio utilizzando microscopia confocale ad alta risoluzione. Questo metodo consente di analizzare gli eventi di segnalazione calcica e gli effetti dei neurotrasmettitori.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

La Wellcome Trust ha fornito sostegno finanziario (Premio VIP per JSY e 074128 Research Fellowship a KLB). Medical Research Council Studentship a RJA Leica_SP2_Stacker, un algoritmo utilizzato per importare TIFF per la &#39;ricostruzione&#39; in una serie, si basa su Leica_tiff_sequence, un plugin per leggere Leica TIFF SP2 in ImageJ, sviluppato da Tony Collins e utilizzato con il suo permesso. ( <a href="http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html">http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html</a> ) StackReg e TurboReg, gli algoritmi usati per correggere il movimento del tessuto, si basano su Th venaz e colleghi (1998) 9. Excel_writer.jar è stata scritta da Kurt De Vos (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html). JNCT0.08JoVE.ijm, l&#39;algoritmo di rilevamento delle particelle, si basa su un algoritmo scritto da Brain KL e dettagliata in precedenza 5.

Parte 1: Preparazione del Ca 2 + indicatore (Oregon verde 488 Bapta-1 AM) <ol><li> Oregon verde 488 Bapta AM-1 arriva in 500 fiale microlitri come una piccola quantità (50 mg) di polvere. Aggiungere 40 microlitri Pluronic F-127 la soluzione alla polvere, agitando dolcemente per 30 s, quindi aggiungere 460 microlitri PSS, e agitare delicatamente per 30 s. La soluzione finale, 10 mM Oregon verde 488 Bapta-1 AM, dispone di 4 x 125 microlitri aliquote. Evitare l&#39;esposizione alla luce e conservare a -20 C. </li></ol> Parte 2: Ca 2 + carico <ol><li> Rimuovere l&#39;indicatore di Ca 2 + (Oregon verde 488 Bapta-1 AM) dal (-20 C) freezer e lasciare scongelare a temperatura ambiente. </li><li> Prendere 1 ml di PSS in una provetta e porre in bagnomaria. Bubble con% O 95 2 / 5% di CO 2 a una velocità di circa 1 bolla che appaiono al secondo. Il gorgogliatore ha bisogno di essere fissato alle provetta, ad esempio con un tappo o con Parafilm. </li><li> Sezionare il tessuto dall&#39;animale e, in un Sylgard alberato capsula di Petri, con attenzione rimuovere il tessuto connettivo. Indipendentemente dal tipo di organo muscolo liscio, PSS deve essere sostituito ogni 10 minuti e dei tessuti devono essere lavati bene (per esempio sostituendo il PSS tre volte) dissezione seguente. Per il dotto deferente: considerare l&#39;organo di taglio lunghezza modi per produrre un foglio di tessuto. Per la vescica urinaria: aperta longitudinalmente dal collo della vescica (posteriore) alla sommità della cupola (anteriore). Preparare quattro strisce, 6 - 8 mm di lunghezza e 1 - 2 mm di larghezza, lungo la superficie dorsale del detrusore, tagliando in direzione dei fasci muscolari dominante. </li><li> Luogo sezionato tessuto nel &#39;pre-riscaldato e bolle&#39; PSS. </li><li> Aggiungere 125 ml di 10 micron Oregon verde 488 Bapta-1 AM alla provetta e dare una piccola scossa, a mano, per mescolare. </li><li> Riprendi bolle e lasciare, coperto con un foglio. Il tempo è necessario per il tessuto sufficiente a raccogliere la Ca 2 + indicatore varia con le dimensioni del tessuto e lo spessore dello strato di muscolatura liscia. Per esempio: 70 minuti (mouse detrusore, anococcygeus ratto) a 120 minuti (detrusore ratto, topo vas deferente). </li></ol> Parte 3: Preparazione del &#39;Ca 2 + caricato&#39; dei tessuti per la microscopia Pinning attenta del tessuto è necessaria per ridurre al minimo movimento spontaneo del tessuto (una proprietà di imaging di cellule muscolari lisce dal tessuto relativamente intatto) e per facilitare la posizione di un sito idoneo per l&#39;imaging (come un pezzo di tessuto può essere intervistati in due dimensioni, invece di tre). <ol><li> Lavare il tessuto in PSS bollito per almeno 5 minuti. </li><li> Montare a Sylgard alberati piatto preparazione, l&#39;allungamento dei tessuti (leggermente) per formare una lamiera piana. Evitare di utilizzare lungo &#39;spine&#39;, che potrebbero graffiare l&#39;obiettivo, usare lunghezze invece brevi di 25-50 micron di diametro filo d&#39;argento come &#39;pin&#39; e inserire in un angolo. </li><li> Posizionare il piatto preparato sul palco microscopio, facendo attenzione a garantire che il PSS non sfugge dalla Sylgard alberato zona del piatto (in quanto ciò potrebbe portare ad una vasta area è coperta di PSS, quando il superfusione comincia). </li><li> Accendere la pompa per superfuse la preparazione con PSS. Un tasso di 100 ml per ora è spesso impiegato. </li><li> Accendere l&#39;apparecchio riscaldatore. </li><li> Posizionare i tubi di afflusso e deflusso e sonda di temperatura sul piatto preparato (apposizione ciascuno per la striscia di metallo dal magnete sulla sua base). L&#39;altezza della punta del tubo di efflusso determina la profondità del PSS. Fare attenzione per assicurare che il deflusso è in realtà la rimozione PSS (come a volte non inizialmente). </li><li> Impostare la temperatura dell&#39;unità di riscaldamento per raggiungere la temperatura desiderata, ad es 33-35 C. </li><li> Lasciare che il tessuto si stabilizzi per almeno 10 minuti. </li></ol> Parte 4: Selezione del sito di immagine L&#39;esposizione a luce di eccitazione si photobleach l&#39;indicatore, in modo da evitare di usare per più di pochi secondi alla volta. <ol><li> Con un obiettivo a basso ingrandimento (10x o 20x) l&#39;uso a epifluorescenza, emozionante con una luce blu, per visualizzare la muscolatura liscia e di individuare una zona adatta per il monitoraggio. Provate a prendere un sito basato su: movimento (che dovrebbe essere minima) e il numero di cellule muscolari lisce del settore. Brillante &#39;strutture&#39; potrebbe causare un elevato numero di &#39;falsi positivi&#39; nel algoritmo di rilevamento di immagini, in modo da evitare siti con un gran numero di (ad esempio), le cellule epiteliali intervallati o fibroblasti. </li><li> Passa a un obiettivo di potenza superiore (40x). </li><li> Ruotare il palco o l&#39;asse ottico così la cellula del muscolo liscio (s) è orizzontale (cioè parallela all&#39;asse scansione rapida). </li></ol> Parte 5: microscopia confocale I dettagli di come il microscopio confocale è &#39;set up&#39; sono specifici per ogni tipo di microscopio, male considerazioni chiave sono: velocità (minimo di 5 Hz è necessario per la maggior parte transitori di Ca 2 +), la risoluzione e le dimensioni del campo (due delle quali sono negoziate-off con la velocità). Alcune delle seguente protocollo è specifico per un microscopio confocale Leica SP2 verticale. Un protocollo tipico è: 100 serie telaio, acquisita a 5 Hz (256 x 256 pixel, circa 100 x 100 micron.) O 13,5 Hz (256 x 64 pixel; circa 100 x 25 micron).. La testa di scansione impostato a muoversi in modo bidirezionale (per massimizzare la velocità di acquisizione) e di acquisire a 1000 Hz per riga. <ol><li> Chiudere il foro stenopeico ad un &#39;disco arioso&#39;. </li><li> Impostare la (488 nm) potenza del laser tra il 25 e il 35% sul AOTF, questo valore è un compromesso tra luminosità e photobleaching. (Quest&#39;ultimo è un problema particolare durante lunghe registrazioni.) </li><li> Acquisire sei serie per ogni sito, e 4-6 siti per &#39;trattamento&#39;. E &#39;comune a scopo di monitorare gli stessi sei siti pre-droga (&#39; controllo &#39;, cioè) e post-droga, anche se photobleaching significative potrebbe causare lo sperimentatore di deviare da questa. </li><li> E &#39;essenziale con Ca 2 + imaging che&#39; controlla il tempo &#39;sono eseguite. </li></ol> Parte 6: Preparazione per l&#39;analisi <ol><li> Scaricare e installare J Immagine da: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Scarica la piattaforma versione specifica, e quindi aggiornare alla versione più recente scaricando l&#39;ultimo file imageJ.jar da http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar, sostituendo il vecchio file. Gli utenti Apple Mac: se si fa girare lentamente, assicurarsi di utilizzare l&#39;ultima versione della Java Virtual Machine (JVM) disponibili da Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/). </li><li> Scarica Excel_writer.jar da: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html e installare il plug-in [directory] jar&gt; directory. </li><li> Copiare i seguenti file nella cartella Plugins: Leica_SP2_Stacker.class; JNCT0.08Release.ijm. Installare ognuno di questi script utilizzando il plugin [Menu]&gt; Macro&gt; Installa ... funzione di ImageJ. </li><li> Usiamo un microscopio confocale Leica SP2, il software (Leica LCS) per la quale genera ogni serie come un unico visibile &#39;film&#39; all&#39;interno del software, ma consente di risparmiare come singoli fotogrammi. Per ricostruire fotogrammi in serie: (i) Assicurarsi che tutti i &#39;fotogrammi&#39; essere ricostruito in una singola cartella (ad esempio &#39;DataFolder&gt; TIFF&#39;). (Ii) Selezionare Plugin [Menu]&gt; Macro&gt; Leica_SP2_Stacker. Selezionare la directory radice (ad esempio &#39;DataFolder&#39;). Selezionare la cartella desiderata dal menu a tendina (ad esempio &#39;TIFF /&#39;). Selezionare una directory di output o generare una nuova (&#39;DataFolder&gt; Stack&#39;, ad esempio). Lo script sarà poi ricostruire serie di singoli fotogrammi. </li></ol> Parte 7: Correzione per il movimento Anche se il movimento del sito ripreso può essere minimizzato con una buona pinning e tessuti in modo uniforme-allungato, alcuni organi muscolari lisce presentano contrazioni spontanee che non può essere abolito da un&#39;attenta pinning da solo. Qui si descrive l&#39;uso di un algoritmo liberamente disponibile che si allinea o partite frame all&#39;interno di una serie. <ol><li> Download &#39;StackReg&#39; (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) e &#39;TurboReg&#39; (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/). </li><li> Installare ogni plugin nella directory usando il Plugin&gt; Macro&gt; Installa ... </li><li> Caricare una risma da elaborare (File&gt; Apri ...) e poi passare a un fotogramma che mostra chiaramente il campo di interesse. Altri fotogrammi sarà allineato a questo sistema di riferimento. </li><li> Plugins&gt; Stack&gt; StackReg. Provare a ciascuno dei diversi &#39;Trasformazioni&#39; (Traduzione cioè, corpo rigido, in scala di rotazione, affine) per determinare ciò che è più efficace. (Ulteriori dettagli: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) </li></ol> Parte 8: algoritmo di rilevamento delle particelle Per ogni &#39;sito&#39; ripreso, i fattori di varia che influenzano la rilevazione di Ca 2 + transitori. Misurando alcune proprietà di ciascun sito (&#39;parametri delle particelle&#39; - sotto dettagliato), il processo di rilevazione è facilitato. Così per ogni sito, si calcola &#39;soglia per sottratta&#39; &#39;soglia per il rapporto&#39;, e &#39;la soglia limite di cella&#39;. <ol><li> Plugin [Menu]&gt; Macro&gt; Installa ... e selezionare &#39;JNCT0.08Release.ijm&#39;. </li><li> Plugin [Menu]&gt; Macro&gt; pila di carico (scorciatoia: l). Selezionare una serie e calcolare i parametri delle particelle: <ol style="list-style:none;"><li> a. Soglia per la sottratto (sfondo =) </li></ol></li><li> Selezionare un ROI rettangolare su ciò che si crede di essere &#39;background&#39;. </li><li> Misura (scorciatoia: m). Annotare MEDIA. <ol style="list-style:none;"><li> b. Soglia di calcolo per il rapporto </li></ol></li><li> Selezionare una forma rettangolareROI intorno ad una zona otticamente piatto della cella (s). </li><li> Misura (scorciatoia: m). Nota DEVIAZIONE giù media e standard. </li><li> Ripetere altre due volte o è possibile disegnare tre caselle in una sola volta premendo &#39;turno&#39;. </li><li> Calcolare e annotare la soglia per il rapporto = (1 + SD / media) x 32, con una media dei valori delle tre replicazione / siti. <ol style="list-style:none"><li> c. Cellula bordo Soglia </li></ol></li><li> Immagine&gt; Pile&gt; Z progetto ... Scegli il tipo di proiezione: &#39;intensità media&#39; </li><li> Immagine&gt; Regolazioni&gt; Soglia. </li><li> Seleziona bianco e nero. </li><li> Definire &#39;sotto&#39; (cursore superiore) limite e annotare il valore corrispondente (a destra del cursore). Solo gli eventi che si verificano nelle regioni nero saranno conteggiati. </li><li> Fare clic su &#39;reset&#39;. </li><li> Analizzare le pile (scorciatoia: 2) </li><li> Selezionare una sola serie in questa fase, cioè il &#39;primo file&#39; e &#39;ultimo file&#39; dovrebbe essere la stessa. </li><li> Immettere i valori di &#39;soglia per sottratta&#39; &#39;soglia per il rapporto&#39;, e &#39;la soglia limite di cella&#39;. Lasciare le altre impostazioni ai loro valori di default. </li><li> L&#39;algoritmo produce un doppio vetro di una finestra in cui viene mostrata la serie di trattati sulla sinistra e l&#39;originale sulla destra. Attentamente passare attraverso questo per valutare il numero di falsi positivi e le occasioni in cui gli eventi, visibile ad occhio, non sono stati rilevati. Per ottenere una maggiore accuratezza nel rilevamento di Ca 2 + transitori può essere necessario modificare leggermente alcuni &#39;parametri delle particelle&#39;. Mentre il processo può sembrare un po &#39;colpo di fortuna&#39; al primo tentativo, si ha subito una sensazione di ciò che i parametri sono fondamentali. </li><li> Per ogni serie, l&#39;algoritmo produce un file di Excel che le caratteristiche particolari della manifestazione rilevato (come ampiezza, area e posizione). &#39;Falsi positivi&#39; - identificato esaminando i file di immagine che le uscite algoritmo (ad esempio, passo 8.17) - possono essere rimosse, a mano, da questo file di Excel. </li></ol>

<ol><li>Gregory, J. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22Handbook+of+fluorescent+probes+and+research+products%22">Handbook of fluorescent probes and research products</a>. , Molecular Probes. Eugene, Oregon. 771-826 (2002).</li>
<li>Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+force+and+Ca2%2B+in+anococcygeal+and+vas+deferens+smooth+muscle+cells+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse.</a> Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).</li>
<li>Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+propagation+of+spontaneous+excitation+in+smooth+muscle+of+the+guinea-pig+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder.</a> J Physiol. 150, 273-286 (2001).</li>
<li>Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elementary+purinergic+Ca2%2B+transients+evoked+by+nerve+stimulation+in+rat+urinary+bladder+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 564, 201-212 (2005).</li>
<li>Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+ATP+release+from+nerve+terminals+elicits+focal+smooth+muscle+Ca2%2B+transients+in+mouse+vas+deferens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens.</a> J. Physiol. 541, 849-862 (2002).</li>
<li>Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+underlying+carbachol-induced+contraction+of+rat+urinary+bladder+II.+Protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).</li>
<li>Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+purinergic+neurotransmission+in+the+mouse+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder.</a> J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).</li>
<li>Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+calcium+sparks%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks.</a> Science. 270, 633-637 (1995).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).</li>
</ol>

Si è cercato di minimizzare il numero di animali usati e la loro sofferenza; tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con gli animali nel Regno Unito (Scientific Procedure) Act del 1986 e delle Comunità europee la direttiva del Consiglio 86/09/EEC.

Scelta di fluorescente Ca 2 + indicatore Oregon verde 488 Bapta-1 AM è stata scelta come indicatore di Ca 2 + perché (i) è brillante rispetto ad altri indicatori (ad esempio Fluo-4 e Green calcio) 1, (ii) è sensibile ai cambiamenti fisiologici nella concentrazione Ca 2 + con una K d di grandezza simile 1 al intracellulare di Ca 2 + concentrazione [Ca 2 +] i (es. vasi deferenti 2), (iii) i carichi molte cellule muscolari lisce, consentendo cellule della muscolatura liscia accoppiamento da monitorare. Tuttavia, Oregon verde 488 Bapta-1 AM è un non-ratioable Ca 2 + indicatore, e come tale non può essere facilmente utilizzato per determinare l&#39;assoluto [Ca 2 +] i. Inoltre, può anche buffer di Ca 2 + se sono presenti in concentrazioni elevate e si satura con i cambiamenti di ampiezza elevata [Ca 2 +] i. L&#39;inibizione della contrattilità spontaneo La contrattilità spontaneo degli organi muscolo liscio può essere ridotta farmacologicamente, come ad esempio bloccando il movimento di Ca 2 + attraverso la L-type Ca 2 + canali (ad esempio: nifedipina 3; diltiazem 4). Si noti che questi farmaci ridurrà di molto l&#39;ampiezza delle cellule intere Ca 2 + flash / transitori. Contrazione dei vasi deferenti risultati da una combinazione di neurotrasmissione principalmente purinergici e noradrenergico. Focali transitori Ca 2 + in questo tessuto sono, tuttavia, insensibili al blocco dei recettori noradrenergici (ad esempio α 1 adrenergico, da prazosina 5) in modo movimento può essere ridotto senza compromettere focale Ca 2 + transitori. In alternativa, la contrazione può essere prevenuto &#39;a valle&#39; attraverso l&#39;inibizione della chinasi della catena leggera ad esempio miosina da wortmannina 6. Conclusioni Monitoraggio Ca 2 + di fluorescenza a risoluzione di submicron è una tecnica potente per lo studio post-giunzionale effetti rilascio di neurotrasmettitore 5,7 e il rilascio di Ca 2 + dai depositi interni (ad esempio &#39;scintille&#39; 8). L&#39;analisi di Ca 2 + transitori utilizzando il metodo descritto qui è costo-efficace rispetto ai pacchetti di immagini disponibile in commercio e permette l&#39;analisi su misura attraverso l&#39;analisi personalizzata scritta plugin Java per ImageJ.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM</td><td>Invitrogen</td><td>O6807</td><td>10 x 50 &amp;#x03BC;g</td></tr><tr><td>Soluzione Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td>Soluzione al 20% in DMSO</td></tr><tr><td>Microscopio confocale verticale Leica SP2</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tavolo antivibrante (&amp;#8216;workstation isolata dalle vibrazioni&amp;rsquo;)</td><td>Newport Corp.</td><td>M-VW-3046-OPT-012140</td><td></td></tr><tr><td>Elastomero Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

focale ca 2 + rilevamento transitoria nel muscolo liscio

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca 2 + immagini della muscolatura liscia permette di comprendere meglio i meccanismi cellulari che non possono tradursi in variazioni del potenziale di membrana, come il rilascio di Ca 2 + dai depositi interni, e permette più celle di monitorare contemporaneamente di valutare, per esempio, giunto a tessuto sinciziale. Subcellulare Ca 2 + transitori sono comuni nella muscolatura liscia, ma sono difficili da misurare con precisione a causa dei problemi causati dal loro verificarsi stocastico, spesso su un campo ampio, in un organo che è soggetta a contratto. Per superare questo problema, abbiamo sviluppato una serie di protocolli di imaging e di routine di analisi per acquisire e poi analizzare, in modo automatico, l&#39;ubicazione, la frequenza e l&#39;ampiezza di tali eventi. Se questo approccio può essere applicato in altri contesti, il nostro lavoro comporta l&#39;individuazione di locali purinergici Ca 2 + transitori per l&#39;individuazione di rilascio del trasmettitore con risoluzione di submicron. ATP è rilasciato come cotransmitter da nervi autonomi, dove si lega a recettori P2X1 sulla muscolatura liscia del detrusore e vasi deferenti. Ca 2 + entra nella muscolatura liscia, con conseguente purinergici neuroeffector Ca 2 + transitori (NCTS). La focale di Ca 2 + transitori permettono il monitoraggio ottico di rilascio dei neurotrasmettitori in un modo che ha molti vantaggi rispetto elettrofisiologia. A parte la risoluzione spaziale molto migliorato, registrazione ottica ha il vantaggio aggiuntivo di permettere la registrazione di rilascio del trasmettitore da molti siti distinguibili contemporaneamente. Inoltre, il piano ottico di messa a fuoco è più facile da mantenere o correggere durante la serie lunga registrazione che è il riposizionamento di un microelettrodo intracellulare taglienti. In sintesi, un metodo per l&#39;imaging di Ca 2 + fluorescenza si delinea che i dettagli della preparazione del tessuto, e l&#39;acquisizione e l&#39;analisi dei dati. Delineiamo l&#39;utilizzo di script diversi per l&#39;analisi di tali Ca 2 + transitori.

Dettagli di metodi ad alta risoluzione Ca<sup&gt; 2 +</supImmagini&gt; della muscolatura liscia all&#39;interno organi isolati, tra cui: la preparazione di acquisto, immagine tessuti e l&#39;analisi dei dati.

Focale Ca 2 + Rilevamento transitoria nel muscolo liscio

L'imaging del Ca2+ della muscolatura liscia fornisce informazioni sui meccanismi cellulari che potrebbero non comportare variazioni del potenziale di membrana, come il rilascio di Ca2+...

Prima di tutto, si prepara una soluzione di carico del calcio, che viene riscaldata e gassata. La vescica urinaria viene dissezionata, aperta, fissata in posizione piatta e da essa si preleva una striscia di detrusore. La striscia di detrusore viene aggiunta alla soluzione di carico, incubata e risciacquata, quindi fissata in posizione piatta.Il calcio nel quarto strato del tessuto viene eccitato da una luce laser e viene catturata la luce emessa in seguito. I filmati, composti da singole immagini, vengono analizzati confrontando frame successivi. Lo sfondo viene sottratto.La soglia del bordo cellulare determina dove possono essere individuati gli eventi e viene calcolato un rapporto tra cervelli successivi. Se gli eventi rimanenti corrispondono a criteri predefiniti, vengono evidenziati e contrassegnati. Ciao, mi chiamo John Young dei laboratori di Keith Brain e Tom Kinane presso il Dipartimento di Farmacologia dell'Università di Oxford.Sono Rob Amos, anch'io dei laboratori Brain e Canne, e il mio nome è Keith Brain. Oggi John e Rob vi mostreranno una tecnica di imaging del calcio nel muscolo liscio. Utilizziamo questa tecnica nel nostro laboratorio per studiare il rilascio di neurotrasmettitori dai nervi autonomi e il loro effetto sul muscolo liscio.Iniziamo. L'indicatore del calcio organ green, 4 88 BAFTA 1:00 AM, è disponibile in fiale da 500 microlitri contenenti 50 microgrammi di polvere. Per preparare l'indicatore del calcio, aggiungere 40 microlitri di soluzione Onic F1 27 alla polvere e agitare delicatamente per 30 secondi; successivamente, aggiungere 460 microlitri di soluzione salina fisiologica (PSS) e agitare delicatamente per altri 30 secondi.La soluzione finale, 10 micro molari di organ green. 4 88 BAFTA 1:00 AM fornisce quattro aliquote da 125 microlitri ciascuna. Evitare l'esposizione alla luce e conservare la soluzione a meno 20 gradi Celsius prima di dissezionare il tessuto di interesse.Rimuovere l'indicatore del calcio dal congelatore e farlo scongelare a temperatura ambiente mentre l'indicatore del calcio è sottile. Versare un millilitro di PSS in un tubo da prova e immergerlo in un bagno d'acqua a 33 gradi Celsius. Fissare un diffusore di gas nel tubo da prova mediante un tappo di gomma, oppure si può utilizzare il perfil, quindi spurgare con una miscela di 95%ossigeno e 5%anidride carbonica a una velocità di circa una bolla al secondo.Dissezionare l'organo del muscolo liscio dall'animale. In questo caso, si tratta della vescica urinaria di un topo. Posizionare l'organo in circa 50 millimetri di PSS per lavarlo; dopo aver accuratamente lavato il tessuto, rimuovere il tessuto adiposo e il tessuto connettivo.Dissezionare secondo il tipo di muscolo liscio laurean per la vescica urinaria. Aprire longitudinalmente dal collo della vescica, dall'estremità coddle fino alla sommità della cupola. All'estremità cranica preparare quattro strisce lunghe sei-otto millimetri e larghe uno-due millimetri lungo la superficie dorsale del resser, tagliando nella direzione dei fasci muscolari predominanti.Posizionare il tessuto dissezionato e la PSS preriscaldata e gassata in un tubo da saggio, aggiungendo 125 microlitri di organ green 10 micromolare, 4 88 B alle 01:00, quindi agitare leggermente a mano per mescolare. Reintrodurre il tubo nel bagnomaria. Riprendere la gassatura e coprire il bagnomaria con un foglio di alluminio.Il tempo necessario affinché un quantitativo sufficiente di tessuto incorpori l'indicatore del calcio varia in base alle dimensioni del tessuto e allo spessore dello strato muscolare liscio. Ad esempio, per il detrusore del topo e gli oxs del ratto, il tempo è di 70 minuti. Per il detrusore del ratto e le VAs deens del topo, invece, l'incubazione dura 120 minuti.Dopo aver caricato il tessuto con l'indicatore del calcio, è possibile procedere con la preparazione per la microscopia. In primo luogo, risciacquare il tessuto in PSS aerato per 10 minuti. Successivamente, montare il tessuto in una piastra di preparazione foderata con una griglia S.Stirarla leggermente per formare un foglio piatto. Fissare il tessuto utilizzando spezzoni corti, ad esempio due millimetri di filo di argento con diametro compreso tra 25 e 50 micrometri, inserendo i perni con un angolo. Evitare l'uso di perni più lunghi di alcuni millimetri poiché potrebbero graffiare l'obiettivo. Un fissaggio accurato del tessuto è importante per ridurre al minimo gli spostamenti spontanei del tessuto e per facilitare l'individuazione di un sito adatto all'acquisizione di immagini. Dopo aver fissato il tessuto, posizionare la preparazione sul piatto del microscopio. Attenzione a non far fuoriuscire il PSS dalla zona del piatto rivestita con sil guard. Ciò potrebbe portare a un'estesa copertura del piatto da parte del PSS. Quando inizierà la sovrafusione a scopo dimostrativo, i seguenti passaggi verranno eseguiti alla luce.Si noti che questi esperimenti vengono normalmente eseguiti al buio. Accendere la pompa per superfusionare il preparato. Con PSS, si utilizza spesso una portata di 100 millilitri all'ora.Accendere l'unità di riscaldamento, posizionare i tubi di ingresso e di uscita e la sonda termica sulla piastra di preparazione fissandoli alla striscia metallica mediante il magnete alla base. L'altezza della punta del tubo di uscita determinerà la profondità della PSS. Prestare attenzione per assicurarsi che il flusso in uscita stia effettivamente rimuovendo la PSS, poiché a volte potrebbe non farlo.Impostare inizialmente la temperatura dell'unità di riscaldamento per raggiungere la temperatura desiderata compresa tra 33 e 35 gradi Celsius. Lasciare che il tessuto raggiunga l'equilibrio per almeno 10 minuti utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento. 10 o 20 volte.Utilizzare la fluorescenza epi o l'eccitazione con luce blu per visualizzare il muscolo liscio e identificare una regione adatta da monitorare. Poiché l'esposizione all'illuminazione di eccitazione provoca il fotoblecemento dell'indicatore, evitare di utilizzarla per più di pochi secondi alla volta.Evitare aree con strutture luminose poiché potrebbero causare un elevato numero di falsi positivi nell'algoritmo di rilevamento delle immagini. Provare a scegliere un sito con movimenti minimi e un elevato numero di cellule muscolari lisce nel campo visivo. Una volta selezionata l'area da acquisire, passare a un obiettivo con maggiore ingrandimento, ad esempio 40 x.Ruotare la piastra o l'asse ottico in modo che la cellula o le cellule muscolari lisce siano orizzontali, ovvero parallele all'asse di scansione rapida. Le cellule muscolari lisce sono ora pronte per l'acquisizione mediante microscopia confocale.In questo protocollo, utilizziamo un microscopio confocale verticale Leica SP due. Chiudere il diaframma fino a raggiungere un disco di Airy. Impostare la potenza del laser tra il 25 e il 35% sul filtro ottico regolabile personalizzato.Questo valore rappresenta un compromesso tra luminosità e fotodegradazione. Per prepararsi all'analisi dei dati, scaricare e installare ImageJ. Scaricare la versione specifica per la piattaforma e quindi aggiornarla all'ultima versione scaricando l'ultimo file jar di ImageJ per sostituire il file precedente. Successivamente, scaricare il file jar di Excel Writer e installarlo nella directory dei plugin jar.Copiare questi file nella directory dei plugin. Installare ciascuno di questi script utilizzando le macro dei plugin. Installare la funzione di ImageJ. Il software per il microscopio confocale Leica SP due che utilizziamo si chiama Leica.LCS salva singoli fotogrammi di ogni serie come file separati. Per ricostruire la serie, assicurarsi che tutti i fotogrammi da ricostruire siano in una singola cartella.Ad esempio, la cartella dati tiffs. Quindi selezionare la macro Leica SP two stacker dal menu plugin macros. Selezionare la directory principale, in questo caso la cartella dati.Selezionare la cartella desiderata dall'elenco a discesa. In questo caso, tiffs selezionare una directory di output o crearne una nuova. Ad esempio, cartella dati stacks.Lo script ricostruirà quindi la serie a partire dai singoli fotogrammi per correggere i movimenti. Utilizziamo un algoritmo disponibile gratuitamente che allinea o confronta i fotogrammi all'interno di un pacchetto di serie scaricato, rig e turbo reg. Copiare i file per ciascuno nella cartella stacks.Caricare uno stack da elaborare, quindi passare a un fotogramma che mostri chiaramente il campo di interesse. Tutti gli altri fotogrammi verranno allineati a questo fotogramma di riferimento. Successivamente, andare su plugin stack.Prova ciascuna delle diverse trasformazioni per determinare quale sia la più efficace per ciascun sito. I fattori immagine che influenzano il rilevamento dei transitori di calcio varieranno in base alla misurazione di determinate proprietà e ai parametri delle particelle di ciascun sito.La sensibilità e la specificità della rilevazione aumentano. Pertanto, per ogni sito calcoleremo la soglia sottratta alla soglia del rapporto e la soglia del bordo cellulare. Per iniziare, andare su plugin, macro, installa e seleziona jn CTO dot oh eight release dot IJM JM. Quindi andare su plugin macro carica stack.Selezionare una serie e calcolare i seguenti parametri delle particelle. Per calcolare la soglia per la sottrazione, selezionare una regione rettangolare di interesse su quella che si ritiene essere l'area di fondo da misurare. Prendere nota della media. Per calcolare la soglia del rapporto, selezionare una regione rettangolare di interesse intorno a un'area otticamente piatta della cellula o delle cellule muscolari lisce.Misurare la nota media e la deviazione standard. Ripetere il processo altre due volte, oppure è possibile disegnare tre riquadri contemporaneamente premendo Maiusc. Calcolare e annotare la soglia per il rapporto.Calcolare come la deviazione standard divisa per la media, aggiungere uno e quindi moltiplicare il risultato per 32. Mediando i valori delle tre repliche, il fattore 32 è necessario per tenere conto dell'algoritmo di rapporto, in cui nessuna variazione rispetto al fotogramma precedente viene mappata su un valore intero pari a 32. Ciò fornisce un'adeguata gamma dinamica per rilevare aumenti e diminuzioni del rapporto.Per un'immagine a otto bit, selezionare l'opzione "adjust threshold" nell'immagine. Scegliere nero e bianco. Definire al di sotto del limite superiore della slide e annotare il valore corrispondente.Questo si trova a destra del cursore. Verranno conteggiati solo gli eventi che si verificano nelle regioni nere. Fare clic su ripristina.Ora che sono stati calcolati i valori soglia per il rapporto e per il bordo della cellula, possiamo analizzare gli stack di immagini. Determinare la posizione degli stack da analizzare. A questo stadio, selezionare una sola serie.Questo è il primo file e l'ultimo file deve essere lo stesso. Quindi selezionare una posizione per l'output dei file di dati e degli stack. Ad esempio, la cartella di output dei dati.Inserire i valori della soglia per sottrarre la soglia del rapporto e la soglia del bordo della cellula. Lasciare le altre impostazioni ai valori predefiniti. L'algoritmo produrrà una finestra a due riquadri in cui la serie elaborata viene mostrata a sinistra e l'originale a destra.Aprire questo file dalla cartella di output ed esaminarlo attentamente per valutare il numero di falsi positivi e i casi in cui eventi visibili ad occhio nudo non sono stati rilevati. Per ogni serie, l'algoritmo genera un file Excel che riporta le caratteristiche degli eventi rilevati, come ampiezza, area e posizione; i falsi positivi identificati esaminando i file immagine prodotti dall'algoritmo possono essere rimossi manualmente da questo file Excel, anche se si dovrebbero adottare criteri rigorosi per farlo.Questo è un filmato del transitorio del calcio nel muscolo liscio. In questo esempio, il filmato è composto da 100 singole immagini acquisite a cinque hertz. Acquisiremmo molti di questi filmati per ogni esperimento durante lo studio, ad esempio, dell'effetto di un particolare farmaco sulla frequenza del transitorio del calcio.Qui osserviamo numerosi transitori spontanei del calcio nelle cellule muscolari lisce. Qui viene mostrato il risultato dell'algoritmo di rilevamento delle particelle. Per ogni serie, l'algoritmo produce un file Excel che dettaglia le caratteristiche dell'evento rilevato, come ampiezza, area e posizione.Abbiamo quindi dimostrato un metodo per l'acquisizione di immagini dei transitori del calcio in organi muscolari lisci come la vescica urinaria, e abbiamo illustrato un approccio per analizzare tali transitori del calcio mediante un algoritmo sviluppato in laboratorio. È fondamentale ricordare di preparare adeguatamente il tessuto per l'acquisizione delle immagini del calcio. Nel caso del tessuto mostrato oggi, ciò consiste nel rimuovere il tessuto connettivo e qualsiasi accumulo adiposo che potrebbe ostacolare il campo visivo.È inoltre importante fissare il tessuto in un foglio piatto. Bene, buona fortuna con i vostri esperimenti e grazie per averci seguito.

focal-ca2-transient-detection-in-smooth-muscle

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica

Vi presentiamo un metodo per isolare rapido (microsecondi) eventi di calcio da più lenti flussi nelle cellule viventi mediante microscopia confocale a scansione laser. Il metodo di misura fluttuazioni di intensità di fluorescenza di indicatori di calcio da scansioni di registrazione linea di diverse centinaia di pixel in una cella. Analisi istogramma permette di isolare la scale temporali dei flussi di calcio diverse.

Misurare flussi di calcio veloce in cardiomiociti

La funzione delle cellule vascolari dipende dall'attività dei messaggeri intracellulari.  Qui descritto è un metodo di imaging ex vivo a due fotoni che consente la misurazione dei livelli intracellulari di calcio e ossido nitrico in risposta a stimoli fisiologici e farmacologici in singole cellule endoteliali e muscolari lisce di un'aorta isolata.

A due fotoni Imaging di Intracellulare Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Manipolazione e l&#39;ossido nitrico Produzione in endoteliale e della muscolatura liscia cellule di un isolato Rat Aorta

Attualmente, la maggior parte degli indicatori di calcio disponibili vengono utilizzati per quantificare i transitori citoplasmatici del calcio come misure indirette del calcio rilasciato dal reticolo sarcoplasmatico in cellule muscolari lisce in coltura. Questo protocollo descrive l'uso di uno specifico indicatore basato su FRET che consente la misurazione diretta dei segnali di calcio all'interno del lume del reticolo sarcoplasmatico.

Misura di fluttuazioni calcio all&#39;interno del reticolo sarcoplasmatico di coltura cellule muscolari lisce Uso FRET-based Imaging confocale

Questo articolo descrive un protocollo che valuta i cambiamenti della sensibilità del miofilamento Ca2+ durante la contrazione in miociti cardiaci isolati dal cuore di ratto. Insieme all'elettrofisiologia cardiaca, ai livelli di citosol sistolico/diastolico Ca2+ e alla contrazione/rilassamento, questa misurazione è fondamentale per sostenere i meccanismi che mediano l'accoppiamento eccitazione-contrazione cardiaca nei cuori sani e malati.

Valutazione della myofilament Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensibilità Alla base Cardiac eccitazione-contrazione Accoppiamento

Qui presentiamo un protocollo di segnalazione in popolazioni di tipi delle cellule individuali alla giunzione neuromuscolare murino di calcio di immagine.

Ex Vivo Formazione immagine di segnalazione alla sinapsi tripartita del diaframma del Mouse cellula-specifico calcio

Questo protocollo presenta una raccolta di dati geometrici sarcomere, calcio e macroscopici da una trabecola cardiaca attivamente contratta ex vivo. Queste misurazioni simultanee sono rese possibili dall'integrazione di tre modalità di imaging.

Imaging tomografico simultaneo a campo luminoso, fluorescenza e coerenza ottica di trabecole cardiache contraenti ex vivo

Il protocollo descrive il metodo di caricamento di un colorante di calcio fluorescente attraverso il nervo tagliato nei terminali nervosi motori del topo. Inoltre, viene presentato un metodo unico per registrare i transitori di calcio veloci nelle terminazioni nervose periferiche utilizzando la microscopia confocale.

Registrazione di transitori di calcio nella giunzione neuromuscolare di topo ad alta risoluzione temporale mediante microscopia confocale

Il presente protocollo descrive la preparazione e l'utilizzo di fette polmonari tagliate con precisione dal topo per valutare la contrattilità delle vie aeree e della muscolatura liscia arteriosa intrapolmonare in un ambiente quasi in vivo .

Utilizzo della fetta polmonare tagliata con precisione per studiare la regolazione contrattile delle vie aeree e della muscolatura liscia arteriosa intrapolmonare

La fluorometria funzionale sito-diretta è un metodo per studiare i movimenti del dominio proteico in tempo reale. La modifica di questa tecnica per la sua applicazione nelle cellule native consente ora il rilevamento e il tracciamento dei movimenti di singoli sensori di tensione dai canali Ca2+ voltaggio-dipendenti nelle fibre muscolari scheletriche isolate murine.

Fluorometria funzionale sito-diretta in cellule native per studiare l'eccitabilità del muscolo scheletrico

Questo articolo presenta un metodo per il monitoraggio quantitativo in tempo reale delle concentrazioni di ioni calcio (Ca2+) nelle cellule utilizzando l'imaging Ca2+ a singola cellula con il colorante Fura-2/AM. Questa tecnica consente un caricamento efficiente del colorante e un calcolo accurato dei livelli di Ca2+ attraverso i rapporti di intensità della fluorescenza, rendendola un approccio semplice e rapido per le applicazioni di ricerca.

Imaging del calcio a singola cellula per lo studio dell'attivazione dei canali ionici del calcio

Scopri la tecnica di imaging del calcio nel muscolo liscio utilizzando microscopia confocale ad alta risoluzione. Questo metodo consente di analizzare gli eventi di segnalazione calcica e gli effetti dei neurotrasmettitori.

Focale Ca^{2 +} Rilevamento transitoria nel muscolo liscio

Esplora altri video