Focale Ca ^{2 +} Rilevamento transitoria nel muscolo liscio

Innanzitutto, viene preparata, riscaldata e fatta bollire una soluzione di carico di calcio. La vescica urinaria viene sezionata, aperta, appuntata e viene prelevata una striscia di detrusore. La striscia del detrusore viene aggiunta alla soluzione di caricamento, incubata e risciacquata, fissata in piano.

Il piano di calcio quattro all'interno del tessuto viene eccitato dalla luce laser e la luce emessa viene catturata. I filmati costituiti da singoli fotogrammi vengono analizzati confrontando i fotogrammi successivi. Lo sfondo viene sottratto.

La soglia del bordo della cellula determina dove si possono trovare gli eventi e viene preso un rapporto tra i cervelli successivi. Se gli eventi rimanenti corrispondono a criteri predefiniti, vengono evidenziati ed etichettati. Ciao, mi chiamo John Young dei laboratori di Keith Brain e Tom Kinane presso il Dipartimento di Farmacologia dell'Università di Oxford.

Sono Rob Amos, anche lui dei Brain Labs e di Canne Labs e mi chiamo Keith Brain. Oggi, John e Rob vi mostreranno una tecnica di imaging del calcio nella muscolatura liscia. Lo usiamo nel nostro laboratorio per studiare il rilascio di neurotrasmettitore dai nervi autonomi e il suo effetto sulla muscolatura liscia.

Quindi iniziamo. L'organo indicatore di calcio verde, 4 88 BAFTA 1:00 AM è disponibile in fiale da 500 microlitri contenenti 50 microgrammi di polvere. Per preparare l'indicatore di calcio a 40 microlitri di Onic F1 27 soluzione per la polvere e agitare delicatamente per 30 secondi dopodiché a 460 microlitri di soluzione salina fisiologica PSS, e agitare delicatamente per altri 30 secondi.

La soluzione finale, 10 micro molari di organo verde. 4 88 BAFTA 1:00 AM fornisce quattro aliquote da 125 microlitri ciascuna. Evitare l'esposizione alla luce e conservare la soluzione a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius prima di sezionare il tessuto di interesse.

Togliere l'indicatore di calcio dal congelatore e scongelarlo a temperatura ambiente mentre l'indicatore di calcio è sottile. Mettere un millilitro di PSS in una provetta e a bagnomaria a 33 gradi Celsius. Fissa un gorgogliatore nella provetta con un tappo, oppure puoi anche usare il perfil e poi bollare con una miscela di ossigeno al 95% e al 5% di anidride carbonica a una velocità di circa una bolla al secondo.

Sezionare l'organo muscolare liscio dall'animale. In questo caso, è la vescica urinaria di un topo. Posizionare l'organo in circa 50 millimetri di PSS per lavarlo dopo che il tessuto è stato lavato con cura, rimuovere il ciero tessuto adiposo e il tessuto connettivo.

Sezionare in modo aperto in base al tipo di muscolo liscio laureano per la vescica urinaria. Aperto longitudinalmente dal collo della vescica, l'estremità della coccola fino alla sommità della cupola. L'estremità cranica Preparare quattro strisce, lunghe da sei a otto millimetri e larghe da uno a due millimetri lungo la superficie dorsale del resser tagliando in direzione dei fasci muscolari dominanti.

Posizionare il tessuto sezionato e il PSS prebellico e bollato per caricare l'indicatore di calcio a 125 microlitri di 10 micromolari d'organo verde, 4 88 B a 1:00 AM al tessuto nella provetta e dargli una piccola agitazione a mano per mescolare. Rimettere il tubo nel bagnomaria. Riprendete a gorgogliare e coprite il bagnomaria con un foglio di carta stagnola.

Il tempo necessario affinché un tessuto sufficiente assorba l'indicatore di calcio varia in base alle dimensioni del tessuto e allo spessore dello strato muscolare liscio. Ad esempio, per il detrusor del topo e i buoi ratto, sono 70 minuti. Mentre per il detrusore di ratto e i deens di topo, incubiamo per 120 minuti.

Una volta che il tessuto è stato caricato con l'indicatore di calcio, può essere preparato per la microscopia. Per prima cosa, sciacquare il fazzoletto con PSS a bolle per 10 minuti. Quindi, montare il fazzoletto in un piatto di preparazione foderato con protezione a S.

Allungandolo leggermente fino a formare una sfoglia piana. Appuntare il fazzoletto usando lunghezze corte. Ad esempio, due millimetri di filo d'argento da 25 a 50 micrometri di diametro e inserire i perni ad angolo.

Evitare l'uso di spilli più lunghi di qualche millimetro in quanto potrebbero graffiare l'obiettivo. Un attento pinning del tessuto è importante per ridurre al minimo la spontaneità del tessuto e per facilitare l'ubicazione di un sito adatto per l'imaging. Dopo che il fazzoletto è stato bloccato, posizionare il piatto di preparazione sul tavolino del microscopio.

Fare attenzione che il PSS non fuoriesca dall'area foderata della parasil del piatto. Poiché ciò potrebbe comportare la copertura di una vasta area di PSS. Quando la superfusione inizierà a scopo dimostrativo, i seguenti passaggi saranno eseguiti alla luce.

Si prega di notare che questi esperimenti vengono normalmente eseguiti al buio. Accendere la pompa in modo da super fondere la preparazione. Con PSS, viene spesso utilizzata una velocità di 100 millilitri all'ora.

Accendere l'unità di riscaldamento, posizionare i tubi di mandata e deflusso e la sonda di temperatura sul piatto di preparazione o fissarli alla striscia metallica tramite il magnete sulla sua base. L'altezza della punta del tubo di deflusso determinerà la profondità del PSS. Fare attenzione a garantire che il deflusso stia effettivamente rimuovendo il PSS, poiché a volte non lo fa.

Inizialmente impostare la temperatura sull'unità di riscaldamento per raggiungere la temperatura desiderata compresa tra 33 e 35 gradi Celsius. Lasciare equilibrare il tessuto per almeno 10 minuti con un obiettivo a bassa potenza. 10 o 20 volte.

Utilizzare l'epifluorescenza o l'eccitazione con una luce blu per visualizzare la muscolatura liscia e identificare una regione adatta da monitorare. Dall'esposizione all'eccitazione, l'illuminazione fotosbianca l'indicatore. Evitare l'uso per più di pochi secondi alla volta.

Evitare di vedere strutture luminose perché possono causare un numero elevato di falsi positivi nell'algoritmo di rilevamento delle immagini. Prova a scegliere un sito con un movimento minimo e un gran numero di cellule muscolari lisce sul campo. Una volta selezionato il sito per l'immagine, passa a un obiettivo di potenza più elevato, ad esempio 40 x.

Ruotare il tavolino o l'asse ottico in modo che la cellula o le cellule muscolari lisce siano orizzontali. Questo è parallelo all'asse di scansione rapida. Le cellule muscolari lisce sono ora pronte per l'imaging mediante microscopia confocale.

In questo protocollo, utilizziamo un microscopio confocale verticale Leica SP two. Chiudere il foro stenopeico a un disco arioso. Impostare la potenza del laser tra il 25 e il 35% sul filtro sintonizzabile dell'ottica personalizzata.

Questo valore è un compromesso tra luminosità e sbiancamento delle foto. Per prepararsi all'analisi dei dati, scaricare e installare l'immagine J.Scaricare la versione specifica della piattaforma, quindi eseguire l'aggiornamento alla versione più recente scaricando il file jar ImageJ più recente per sostituire il file precedente. Quindi, scarica il file jar di Excel Writer e installalo nella directory jar dei plugin.

Copia questi file nella directory dei plugin. Installa ciascuno di questi script utilizzando le macro dei plugin. Installa la funzione dell'immagine J.Il software per il microscopio confocale Leica SP due che utilizziamo chiamato Leica.

LCS salva i singoli fotogrammi di ciascuna serie come file separato. Per ricostruire la serie. Assicurati che tutti i fotogrammi da ricostruire siano in un'unica cartella.

Ad esempio, tiff della cartella dati. Quindi selezionare la macro Leica SP two stacker dal menu delle macro dei plugin. Selezionare la directory principale nella cartella dei dati del caso.

Seleziona la cartella desiderata dall'elenco a discesa. In questo caso, tiffs seleziona una directory di output o ne genera una nuova. Ad esempio, le pile di cartelle di dati.

Lo script ricostruirà quindi le serie dai singoli fotogrammi per correggere il movimento. Utilizziamo un algoritmo disponibile gratuitamente che allinea o abbina i fotogrammi all'interno di una serie di download, stack, rig e turbo reg. Copia i file per ciascuno nella cartella stacks.

Caricare una pila da elaborare e poi spostarsi su un fotogramma che mostri chiaramente il campo di interesse. Gli altri fotogrammi verranno allineati a questo sistema di riferimento. Dopodiché, vai agli stack dei plugin.

Prova ciascuna delle diverse trasformazioni per determinare ciò che è più efficace per ogni sito. I fattori che influenzano il rilevamento dei transitori di calcio variano misurando determinate proprietà, parametri delle particelle di ciascun sito.

La sensibilità e la specificità del rilevamento sono aumentate. Pertanto, per ogni sito, calcoleremo la soglia per la soglia sottratta per il rapporto e la soglia del bordo della cella. Per iniziare, vai su plugin, macro, installa e seleziona jn CTO dot oh otto release dot IJM JM. Quindi vai allo stack di caricamento delle macro dei plugin.

Seleziona una serie e calcola i seguenti parametri di particella. Per calcolare la soglia per la sottrazione, selezionare una regione rettangolare di interesse su quella che si ritiene essere la misura di sfondo. Annotare la media Per calcolare la soglia per il rapporto, selezionare una regione rettangolare di interesse attorno a un'area otticamente piatta della cellula o delle cellule muscolari lisce.

Misurare, annotare la media e la deviazione standard. Ripeti il processo altre due volte oppure puoi disegnare tre caselle contemporaneamente premendo Maiusc. Calcola aggiungi nota verso il basso la soglia per il rapporto.

Calcola come la deviazione standard divisa per la media aggiungi uno, quindi moltiplica il risultato per 32. Calcolando la media dei valori delle tre repliche, il fattore di 32 è necessario per tenere conto dell'algoritmo di razionamento in cui nessuna modifica dal frame precedente viene mappata a un valore intero di 32. Ciò fornisce una buona gamma dinamica per rilevare aumenti e diminuzioni del rapporto.

Per un'immagine a otto bit, selezionare la soglia di regolazione dell'immagine. Selezionare il bianco e nero. Definite sotto il limite superiore della diapositiva e annotate il valore corrispondente.

Si trova a destra del dispositivo di scorrimento. Verranno conteggiati solo gli eventi che si verificano nelle regioni nere. Fare clic su Reimposta.

Ora che la soglia per la soglia sottratta per il rapporto e la soglia del bordo di vendita sono state calcolate, possiamo analizzare gli stack di immagini. Determinare la posizione delle pile da analizzare. Seleziona solo una serie in questa fase.

Questo è il primo file e l'ultimo file dovrebbe essere lo stesso. Quindi selezionare una posizione per l'output di file di dati e stack. Ad esempio, l'output della cartella dati.

Immettere i valori della soglia per sottratto la soglia per il rapporto e la soglia del fronte di vendita. Lasciare le altre impostazioni ai valori predefiniti. L'algoritmo produrrà una finestra a doppio riquadro in cui la serie elaborata viene mostrata a sinistra e l'originale a destra.

Aprire questo file dalla cartella di output e analizzarlo attentamente per valutare il numero di falsi positivi e le occasioni in cui gli eventi visibili a occhio nudo non sono stati rilevati. Per ogni serie, l'algoritmo produce un file Excel che descrive in dettaglio le caratteristiche dell'evento rilevato, come l'ampiezza, l'area e la posizione, i falsi positivi identificati esaminando i file di immagine che l'algoritmo emette possono essere rimossi manualmente da questo file Excel. Anche se dovresti avere criteri rigorosi per farlo.

Questo è un film sulla transitorietà del calcio nella muscolatura liscia. In questo esempio, il filmato è composto da 100 singoli fotogrammi acquisiti a cinque hertz. Acquisivamo molti di questi filmati per esperimento quando studiavamo, ad esempio, l'effetto di un particolare farmaco sulla frequenza del transitorio del calcio.

Qui vediamo numerosi transitori spontanei di calcio nelle cellule muscolari lisce. Il risultato dell'algoritmo di rilevamento delle particelle è mostrato qui. Per ogni serie, l'algoritmo produce un file Excel che descrive in dettaglio le caratteristiche dell'evento rilevato, come l'ampiezza, l'area e la posizione.

Quindi abbiamo dimostrato un metodo per l'imaging della trance del calcio negli organi muscolari lisci come la vescica urinaria, e abbiamo dimostrato un modo in cui analizziamo quei transitori di calcio utilizzando un algoritmo che abbiamo prodotto in laboratorio. Le cose importanti da ricordare sono preparare bene il tessuto per l'imaging del calcio. Quindi, nel caso del tessuto che abbiamo dimostrato oggi, si tratta di rimuovere il tessuto connettivo e di rimuovere qualsiasi grasso che possa oscurare il campo.

È anche importante appuntare il fazzoletto in un foglio piatto. Bene, buona fortuna con i tuoi esperimenti e grazie per aver guardato.