Lens trapianto in Zebrafish e la sua applicazione nell'analisi dei Mutanti Eye

Per iniziare il trapianto della lente, donatori transgenici di zebrafish esprimenti GFP e ospiti ricettori di tipo selvatico vengono prima incubati per 30 minuti in piatti petri separati contenenti soluzione di Ringer per zebrafish priva di calcio. Le larve di pesce vengono quindi incorporate in due linee parallele in agarosio a basso punto di fusione. Una linea A è destinata ai donatori e l'altra B agli ospiti; l'intero occhio del donatore viene rimosso, mentre dall'ospite viene rimossa soltanto la lente.

I tessuti che circondano la lente donatrice vengono rimossi prima di posizionare la lente nell'occhio del ricevente. Dopo il trapianto, i pesci vengono conservati in piastre da 24 pozzetti etichettate. La lente trapiantata dovrebbe mostrare fluorescenza GFP nell'ospite.

Naturalmente, l'occhio controlaterale dell'ospite non è stato sottoposto a intervento e non esprime GFP. Ciao, sono Yj. E io sono Kaya McCullough, e siamo del laboratorio della dottoressa Yma Maki del Dipartimento di Oftalmologia della Harvard Medical School. Oggi vi mostreremo una procedura di trapianto del cristallino in zebrafish di tipo selvatico Daniel Rio.

Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per trapiantare cristallini da animali di tipo selvatico a animali mutanti e viceversa. Ciò ci consente di determinare se i geni mutanti funzionino in modo autonomo o non autonomo all'interno del cristallino. Cominciamo dunque.

I ceppi di pesce zebra sono mantenuti in condizioni standard di allevamento a 28,5 gradi C, con un ciclo di 14 ore di luce e 10 ore di buio. La sera precedente l'esperimento programmato, si introducono maschi e femmine in un serbatoio con un divisorio per separarli l'uno dall'altra. Il genotipo di questi pesci dovrebbe produrre prole con espressione di GFP e qualsiasi mutazione di interesse. Parallelamente, entro un'ora, si utilizza lo stesso procedimento per impostare incroci tra animali selvatici non transgenici.

Dopo l'accensione della luce al mattino, rimuovere le partizioni per consentire ai pesci di accoppiarsi. Dopo 15-30 minuti, versare l'acqua dell'acquario in un colino per raccogliere gli embrioni, quindi lavarli con un getto di acqua per uova da una bottiglia con pipetta in una piastra di Petri da 100 per 15 millimetri. Successivamente, pulire le uova asportando con una pipetta i detriti sugli embrioni fecondati e qualsiasi altra impurità.

Sostituire l'acqua vecchia delle uova con acqua nuova. Gli embrioni possono essere conservati in un incubatore a 28,5 gradi C prima del trapianto del cristallino. Quando si è pronti per procedere con il trapianto, preparare gli embrioni rimuovendo manualmente il corion.

Con una sonda metallica e una paia di pinzette, gli embrioni decorticati devono ora essere incubati in EDTA 0,2% in ZFR priva di calcio per 30 minuti. Durante l'incubazione, possono essere preparati gli aghi necessari per la dissezione. La procedura di trapianto richiede un ago affilato per tagliare i tessuti circostanti il cristallino ed embrioni Woolies da agros.

È inoltre necessario un ago smussato per spostare la lente donatrice e inserirla nell'ospite, realizzando innanzitutto un taglio con l'ago, staccando la punta di una pipetta Pasteur mediante un coltello al diamante. Quindi inserire una capillare di vetro nella punta della pipetta Pasteur in modo che circa metà della sua lunghezza sia all'interno. Inserire con attenzione un sottile filo di tungsteno nell'estremità aperta della capillare utilizzando una fiamma.

Fondere il vetro sul filo metallico tenendo saldamente con una pinzetta l'estremità del vetro mentre si torce l'altro capo dell'ago. Il vetro ammorbidito deve avvolgersi a spirale attorno al metallo, fissandolo in posizione. Questo crea un ago smussato per ottenere un ago affilato.

Tenere il filo di tungsteno sopra una fiamma per uno a 1,5 minuti, bruciando il metallo, in modo da creare una punta molto fine. Verificare la qualità della punta mediante microscopia.

Un buon ago non dovrebbe piegarsi né curvarsi e dovrebbe restringersi uniformemente fino a una punta fine, non superiore a 50 micrometri di diametro. Sterilizzare entrambi gli aghi nella fiamma per alcuni secondi e lasciarli raffreddare prima di iniziare la procedura. In un tubo centrifuga di plastica, preparare dell'agarosio al 1,2% a basso punto di fusione e ZFR privo di calcio preriscaldato a 40 gradi C in un bagno termico alla fase desiderata. Aspirare gli embrioni donatori in una pipetta Pasteur ed espellerli lentamente nel tubo centrifuga contenente l'agarosio. Incubare le uova nell'agarosio per circa cinque secondi.

Rimuovere gli embrioni con la pipetta e disporli in fila su una piastra di Petri in polistirene da cento millimetri, pipettando lentamente e con attenzione; la maggior parte degli embrioni si posizionerà di lato con l'occhio rivolto verso l'alto. Ripetere ora questo procedimento con le uova ospiti e disporle in una fila parallela rispetto alle uova donatrici prima che l'agros si solidifichi. Utilizzare l'ago smussato per ruotare eventuali embrioni con orientamento non corretto, in modo che l'occhio risulti rivolto verso l'alto una volta che l'aros si sarà solidificato.

Aggiungere in sovrapposizione una soluzione di agarosio allo 0,2% a basso punto di fusione. Utilizzando un ago affilato, rimuovere l'agarosio intorno agli occhi e tagliare con molta attenzione l'intero occhio donatore, che galleggerà. Successivamente, liberare il cristallino dall'occhio.

Questo viene fatto trascinando l'ago attraverso il tessuto oculare dal basso verso l'alto. Solo per l'ospite. La lente viene asportata utilizzando piccoli movimenti con un ago affilato, tagliando il più vicino possibile alla lente senza strapparla.

Evitare di rimuovere troppo tessuto dal resto dell'occhio ospite. Una volta libere, le lenti galleggeranno nel mezzo. Utilizzando l'ago smussato, spingere con attenzione la lente donatrice appena sopra la posizione della lente ospite e quindi inserirla nella posizione corretta con l'ago smussato.

La lente dell'ospite può essere scartata. Lasciare gli embrioni donatori e quelli dell'ospite in Aros al 1,2% per 30-60 minuti. Il mezzo per embrioni favorirà la guarigione della ferita.

Quindi rilasciarli dagli agros utilizzando l'ago metallico affilato. Trasferire gli embrioni in una piastra a 24 pozzetti contenente mezzo per embrioni. Ogni embrione deve occupare un pozzetto separato.

Assicurarsi di etichettare correttamente le pozzette in modo da identificare chiaramente quale ospite corrisponde a quale donatore al termine del trasferimento della lente. Lasciare sviluppare gli embrioni a 28,5 °C fino al tempo desiderato. Per l'osservazione fenotipica, di solito esaminiamo la differenziazione della lente entro uno o due giorni.

L'occhio donatore dovrebbe mantenere l'espressione di GFP dopo il trapianto nell'occhio dell'ospite. Se un fenotipo mutante non viene ripristinato in un ambiente di tipo selvatico, ciò indica che il fenotipo è autonomo. Tuttavia, se viene ripristinato, allora il fenotipo è considerato non autonomo.

E ciò ha importanti implicazioni sulla funzione del gene sottostante. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire il trapianto del cristallino nell'embrione di pesce zebra. Quando si esegue questa procedura, è fondamentale prestare molta attenzione alla modellatura degli aghi e al dissezione del cristallino stesso.

Inoltre, gli embrioni devono essere disposti rapidamente prima che l'uovo rotoli nuovamente al termine del trapianto. Ricordarsi di aggiungere l'embrione, portando il mezzo a otto nel legno in via di guarigione. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.