Name: La Porta del Cervello: Dissezione lOcchio Primate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-27T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Scopri la dissezione della retina di primate non umano per studiare neuroscienze e oftalmologia. Questo metodo consente di analizzare l'organizzazione retinica e le sue implicazioni per la salute umana.

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Gli autori desiderano ringraziare Ikiel Ptito per il suo supporto tecnico. Siamo grati a Frank Ervin, Roberta Palmour e il personale del Behavioural Sciences Laboratories Fondazione situato a St Kitts, nelle Indie Occidentali, per il supporto continuo del nostro lavoro primati.

Parte 1: Pre-trattamento dei tessuti <ol><li> Tessuto deve essere ben perfusi con paraformaldeide, glutaraldeide, o formalina. Questo può essere raggiunto attraverso standard di perfusione transcardial tipicamente usato per raccogliere altri organi. Si raccomanda che poco dopo il sacrificio gli occhi da iniettare con fissativo appena sotto la lente e conservate in fissativo. </li><li> Nel presente studio il soggetto era profondamente sedato con cloridrato di ketamina (10 mg / kg, im), eutanasia con una dose eccessiva di sodio pentobarbital (25 mg / kg, iv) e perfusi transcardially con 0,1 M PBS fino a completo dissanguato. Questa è seguita da una soluzione di paraformaldeide al 4% in PBS per 5 min (~ 1 litro). </li></ol> Parte 2: rimozione del bulbo oculare dalla cavità orbitale <ol><li> Per facilitare l&#39;accesso al bulbo oculare, si raccomanda di rimuovere prima il cervello. Una volta che il cervello è stata rimossa la parete sottile osso orbita è evidente. Utilizzare il Rongeurs osso di chip lentamente la parete dell&#39;orbita. Tagliare i muscoli oculari con un bisturi e rimuovere il tessuto connettivo dal bulbo oculare. Tagliare con cautela il nervo ottico, questo può essere usato negli studi di microscopia elettronica. Il bulbo oculare dovrebbe essere rilasciato dalla cavità orbitale. </li></ol> Parte 3: Dissect la retina dalla oculare <ol><li> Posto l&#39;occhio in una piastra di Petri con PBS per mantenere la retina si secchi. Un microscopio da dissezione o tavolo montato ingrandimento stativo è utile nella dissezione, ma non una necessità. Togliere la cornea tagliando la sclera vicino al perimetro della cornea, a livello della serrata con un paio di forbici a molla e rimuovere l&#39;obiettivo con il forcipe. </li><li> Utilizzare un pennello, pinze, forbici e molla per rimuovere la retina dalla sclera. Questo viene fatto separando la retina dalla sclera e poi tagliando la sclera via con le forbici. Si deve svolgere questo processo con piccoli incrementi in modo da non danneggiare o strappare il tessuto retinico. La sclera non è facilmente separato dal resto del nervo ottico con tanta cura tagliare la sclera attorno al nervo ottico. </li><li> A questo punto della retina ha mantenuto la sua forma curva e deve essere appiattito per il campionamento. Prima di appiattimento della retina, il vitreo, che ha la consistenza di gelatina, possono essere rimosse in un grumo. Per appiattire la retina su un vetrino, fare parecchi tagli radiali con una lama di bisturi. Vitreo residuo può essere rimosso con ordinaria carta da filtro e un pennello. La strato di cellule gangliari della retina è esposta a questo punto quindi è imperativo essere gentile quando si rimuove il vitreo. Se il nervo ottico è ancora attaccato al disco ottico, togliere il nervo ottico, senza strappare la retina con un bisturi e un paio di forbici primavera. Questa è ora una retina montaggio flat (figura 1) e la fovea dovrebbe essere evidente come una macchia scura in direzione temporale / ventrale dal disco ottico. </li></ol> Parte 4: Campionamento <ol><li> Ci sono una serie di opzioni per il campionamento della retina. Qui descriveremo la preparazione flatmount e campionamento isodentric. Per entrambe le procedure flatmount la retina con lo strato in fibra ottica di distanza dalla presentazione. Se l&#39;intenzione è di esaminare la retina strato di cellule gangliari nella preparazione flatmount, è necessario rimuovere o candeggina l&#39;epitelio pigmentato. Per rimuovere l&#39;epitelio pigmentato usare un pennello leggermente per togliere una parte di questo livello, questa tende a danneggiare lo strato dei fotorecettori. Sbiancamento coinvolge ammollo la retina in soluzione di permanganato di potassio (0,25%) per 1 ora, il lavaggio in acqua distillata, e di compensazione in acido ossalico (5%) per 5 minuti 2. </li><li> Se l&#39;intenzione è di esaminare la distribuzione cellulare e la morfologia di ogni livello per tutta la retina, quindi si consiglia di campionamento isometrica della retina. La retina deve essere flatmounted su un vetrino e tenuto umido con PBS. Per il campionamento isometrica tagliare piccoli pezzi di tessuto equidistante dal disco ottico nel nasale, indicazioni temporali, inferiore e superiore (Figura 1). Non è necessario candeggina l&#39;epitelio pigmentato in questa preparazione. Questi pezzi possono ora essere sezionato nel piano coronale con un criostato, vibratome o ultramicrotomo a seconda della domanda di ricerca. Per sezionamento criostato, i pezzi devono essere crioprotetti nel 30% di saccarosio durante la notte e congelato nel contesto di un mezzo di montaggio in ghiaccio secco. In alternativa, i campioni possono essere inclusi in agar e fette su un vibratome. Il criostato e preparati vibratome sarà resa affidabile sezioni sottili come 4 m. Se sezioni più sottili sono necessari (ad esempio per la preparazione del microscopio elettronico), è necessario preparare i campioni per i ultramicrotomo. Per fare questo, le sezioni devono essere post-fissati in tetrossido di osmio per 1 ora sotto il fumehood. Ciò è seguita da disidratazione in una serie graduata di etanolo (50, 70, 95, 95, 100, 100%) e ossido di propilene 100%. Il tessutoviene poi incorporato in Epon (embed-812 kit di embedding). </li></ol> Parte 5: Risultati Rappresentante: Nel nostro laboratorio, abbiamo regolarmente eseguire immunoistochimica sulla retina cryosectioned (Figura 2). In questo caso siamo interessati alla isodensità dei recettori dei cannabinoidi (CB1) nella retina dei primati. Abbiamo anche esaminare gli effetti dell&#39;esposizione prenatale dell&#39;etanolo sul sistema visivo dei primati. A tal fine, siamo interessati a densità cellulare e lo spessore del livello nella fovea e nella retina periferica. Per fare questo, abbiamo incorporare pezzi di retina in Epon, fetta a 700 nm su un ultramicrotomo, e colorare con blu di toluidina 1% (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/1261/fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1 Retina Flatmount. Tagli radiali sono utilizzati per appiattire la retina. <img src="/files/ftp_upload/1261/fig2.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2 immunocolorazione. Cryosection della retina periferica immunostained per CB1 dove le cellule gangliari della retina sono pesantemente etichettati con etichette negli strati interni ed esterni nucleare. Lo spessore di questa sezione è di 14 metri e colorato nella diapositiva. RG - strato retinico ganglio; IP - strato plessiforme interno; IN - interno strato nucleare; OP - strato esterno plessiformi; ON - strato esterno nucleare. <img src="/files/ftp_upload/1261/fig3.jpg" alt="figura 3" /> Figura 3 Fovea. Sezione attraverso la fovea che è stato incorporato in Epon e fette su un ultramicrotrome a 700nm. Lo strato dei fotorecettori (PR) è stato utilizzato per allineare le sezioni. Si noti che l&#39;intera estensione dei fotorecettori possono essere identificati indicando un angolo appropriato sul piano coronale. Misure di densità sono stati prelevati a 300 m, 500 m, e 800 m dal centro della fossa foveale utilizzando il sistema Bioquant Imaging. RG - strato retinico ganglio; IP - strato plessiforme interno; IN - interno strato nucleare; OP - strato esterno plessiformi; ON - strato esterno nucleare; barra di scala = 50 m

<ol><li>Hendrickson, A., Kupfer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histogenesis+of+the+fovea+in+the+macaque+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The histogenesis of the fovea in the macaque monkey.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 15, 746-756 (1976).</li>
<li>Herbin, M., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+distribution+of+retinal+ganglion+cells+in+the+St.+Kitts+green+monkey+%28Cercopithecus+aethiops+sabeus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Size and distribution of retinal ganglion cells in the St. Kitts green monkey (Cercopithecus aethiops sabeus).</a> J Comp Neurol. 383, 459-472 (1997).</li>
<li>Stone, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStone%2C+J+%22The+Wholemount+Handbook%22">The Wholemount Handbook</a>. , Maitland Publishing Pty. Ltd. Sydney. (1981).</li>
<li>Herbin, M., Boire, D., Theoret, H., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transneuronal+degeneration+of+retinal+ganglion+cells+in+early+hemispherectomized+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Transneuronal degeneration of retinal ganglion cells in early hemispherectomized monkeys.</a> Neuroreport. 10, 1447-1452 (1999).</li>
<li>Krebs, W., Krebs, I. Primate Retina and Choroid Atlas of Fine Structure in Man and Monkey. , Springer-Verlag. New York. (1991).</li>
<li>Pow, D., Sullivan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+kinesis%2C+neurite+sprouting+and+abnormal+axonal+projections+of+cone+photoreceptors+in+the+aged+and+AMD-afflicted+human+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Nuclear kinesis, neurite sprouting and abnormal axonal projections of cone photoreceptors in the aged and AMD-afflicted human retina.</a> Exp Eye Res. 84, 850-857 (2007).</li>
</ol>

La preparazione della retina come un wholemount permette l&#39;analisi della topografia e la distribuzione spaziale di uno strato di cellule gangliari o le cellule endoteliali dei vasi sanguigni della retina 3. Quantificazione della densità delle cellule nella periferia della retina dei primati è prontamente realizzato. Tuttavia, nelle regioni perifoveal e della fovea, la sovrapposizione degli strati multipli nello strato delle cellule gangliari ostacola quantificazione. Per aggirare questo pregiudizio potenz...

<table><tbody><tr><td>Scalpello</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Lame per scalpello</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla</td><td>Fine Science Tools</td><td>15020-15</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td>Qualsiasi forbice chirurgica è sufficiente</td></tr><tr><td>Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-924-150</td><td></td></tr><tr><td>Pennello con setole di cammello o martora</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la porta del cervello: dissezione l&#39;occhio primate

The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye

Il sistema visivo nell&#39;uomo è considerata la porta verso il mondo e svolge un ruolo principale nella pletora di sensoriali, i processi percettivi e cognitivi. Non è quindi sorprendente che la qualità della visione è legata alla qualità della vita. Nonostante la diffusa ricerca clinica e di base che circonda le cause dei disturbi visivi, molte forme di disabilità visive, come la retinite pigmentosa e la degenerazione maculare, la mancanza di trattamenti efficaci. I primati non umani hanno la più vicina caratteristiche generali dello sviluppo dell&#39;occhio a quello umano. Non solo hanno un simile anatomia vascolare, ma tra gli altri mammiferi, i primati hanno la caratteristica unica di avere una regione nella retina temporale specializzata di alta acuità visiva, la fovea<sup&gt; 1</sup&gt;. Qui si descrive una tecnica generale per sezionare la retina dei primati per fornire il tessuto per esame istologico della retina, immunoistochimica, microdissezione laser capture, così come la luce e la microscopia elettronica. Con l&#39;ampio uso della primate non umano come modello traslazionale, la nostra speranza è che la migliore comprensione della retina forniranno approfondimenti approcci efficaci per attenuare o invertire gli effetti negativi di disturbi visivi sulla qualità della vita degli individui colpiti.

Il primate non umano è una specie importante traslazionale per la nostra comprensione dello sviluppo e dell&#39;invecchiamento. L&#39;organizzazione anatomica della retina dei primati potrebbe fornire spunti importanti in condizioni normali e patologiche nell&#39;uomo.

La Porta del Cervello: Dissezione l&#39;Occhio Primate

Il sistema visivo nell'essere umano è considerato la porta d'accesso al mondo e svolge un ruolo principale nella pletora di processi sensoriali, percettivi e cognitivi...

Questa procedura inizia con una testa di scimmia ben perfusa. Dopo aver rimosso il cervello, si estraggono e collegano i bulbi oculari. Successivamente si elimina il tessuto circostante, quindi si rimuovono con attenzione la cornea, il cristallino, la sclera e l'umor vitreo, liberando così la retina.La retina viene posizionata piatta su un vetrino e il resto dell'umor vitreo viene eliminato. Successivamente si prelevano campioni di Iso Dentrix e si procede alla crioprotezione. Salve, sono il dottor Mark Burke del Laboratorio di Neuroscienze Visive della Scuola di Ottometria dell'Università di Montreal.Ciao, sono la dottoressa Shaheen Zur, anch'io del Laboratorio di Neuroscienze Visive della Scuola di Ottometria dell'Università di Montreal. Salve, sono il dottor Tito, direttore del Laboratorio di Neuroscienze Visive della Scuola di Ottometria, Università di Montreal. Oggi vi mostreremo una procedura per dissezionare una retina di primato non umano.Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare diversi aspetti dell'organizzazione retinica nello sviluppo normale e in risposta a interferenze nello sviluppo. Cominciamo dunque. Iniziare questo protocollo con la testa

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Il primate non umano è una specie importante traslazionale per la nostra comprensione della normale elaborazione del cervello. L'organizzazione anatomica del cervello dei primati in grado di fornire spunti importanti in condizioni normali e patologiche nell'uomo.

Dissezione di non-umano cervello dei primati nello spazio Stereotassica

Una dimostrazione formale della dissezione di un occhio del mouse, per un monte di tutto l'epitelio pigmentato retinico.

Dissezione di un occhio mouse per un monte intero di dell&#39;epitelio pigmentato retinico

Questa presentazione video mostra un metodo di raccolta delle due più importanti strutture altamente vascolari che supportano la funzione proencefalo. Essi sono la superficie cerebrale (superficiale) vascolare con meningi associati (MAV) e la coroide plesso che sono necessari per il flusso sanguigno cerebrale e nel liquido cerebrospinale (CSF) omeostasi.

Una descrizione visiva della dissezione del sistema vascolare di superficie cerebrale e Meningi associate, e del plesso coroide da cervello di ratto

Questo video descrive come sezionare e isolare il cervello adulto di Drosophila, una procedura necessaria per visualizzare l'organo, che altrimenti è oscurato dalla cuticola, dall'occhio e dal tessuto tracheale. Il protocollo di esempio mostra una dimostrazione dettagliata che produce preparati di alta qualità che possono essere utilizzati per l'immunocolorazione e i metodi di imaging nella neurobiologia della Drosophila.

drosofila Dissezione cerebrale adulta: un metodo nella neurobiologia delle mosche

Questo video descrive come sezionare e isolare il complesso occhio-cervello dalle pupe di Drosophila. Il protocollo presentato dimostra che la procedura produce tessuto di alta qualità, compatibile, ad esempio, con l'immunocolorazione e con altri esperimenti di espressione genica.

Dissezione del complesso occhio-cervello da pupe di mosca: un metodo per isolare il tessuto retinico

La rimozione degli occhi, chiamato anche enucleazione, fornisce una strategia utile per studiare gli aspetti di visual, cross-modale, e la plasticità dello sviluppo lungo il sistema visivo dei mammiferi poiché induce irreversibile parziale (monoculare) o completa (binoculare) perdita della vista. Qui si descrive un approccio altamente riproducibile e semplice da eseguire in vivo enucleazione.

Un metodo altamente riproducibile e semplice da eseguire In Vivo Oculare enucleazione del mouse dopo apertura degli occhi

L'obiettivo di questo documento e video didattico è quello di descrivere come esporre e rimuovere il post-mortem del cervello di maiale e ghiandola pituitaria in uno stato integro, adatto per la successiva analisi macroscopica e istologica.

L&#39;esposizione del Maiale CNS per l&#39;analisi istologica: Un manuale per la decapitazione, Teschio di apertura, e Cervello di rimozione

Le espressioni facciali sono una modalità di comunicazione visiva prodotta dai muscoli mimetici. Qui, presentiamo i protocolli per le nuove tecniche della dissezione inversa e DiceCT completamente visualizzare e valutare i muscoli mimetici. Queste tecniche combinate possono esaminare aspetti sia morfologici e fisiologici della muscolatura mimetico per determinare gli aspetti funzionali.

Invertire la dissezione e dati DiceCT Reveal altrimenti nascosti nell'evoluzione del Primate viso

Questo protocollo descrive l'esecuzione di una craniectomia utilizzando un trapano pneumatico ad alta velocità su un maiale Landrace danese di 3 mesi. L'accesso avviene attraverso l'osso frontale e rivela la dura madre ventrale e gli emisferi cerebrali sottostanti. Questa procedura consente l'accesso a gran parte del cervello del maiale.

Accesso al cervello suino tramite craniectomia pneumatica ad alta velocità

L'accurata macroscopia e il sezionamento standardizzato di globi non neoplastici sono importanti per ottenere sezioni istopatologiche riproducibili di alta qualità. Le linee guida per una distribuzione standardizzata di globi adulti e fetali non neoplastici sono fornite qui. Vengono dimostrate e discusse diverse opzioni per il sezionamento del globo, compresi i criteri per il processo decisionale basato sui casi.

Grossificazione di globi non neoplastici, compresi gli occhi fetali

La retina mostra una complessa organizzazione spaziale attraverso la sua struttura laminare. Le moderne tecniche di trascrittomica spaziale e sequenziamento richiedono sezioni di tessuto &lt; 20 μm di spessore, limitandone l'applicabilità nella ricerca retinica. Questo metodo di criosezione appena congelato produce sottili sezioni en face della retina di topo preservando le relazioni spaziali planari, consentendo una mappatura molecolare completa tra le lamine.

En face Criosezione della retina di topo per analisi molecolare spaziale ad alta dimensione

Scopri la dissezione della retina di primate non umano per studiare neuroscienze e oftalmologia. Questo metodo consente di analizzare l'organizzazione retinica e le sue implicazioni per la salute umana.

La Porta del Cervello: Dissezione l'Occhio Primate

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