Name: La Porta del Cervello: Dissezione lOcchio Primate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-27T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Scopri la dissezione della retina di primate non umano per studiare neuroscienze e oftalmologia. Questo metodo consente di analizzare l'organizzazione retinica e le sue implicazioni per la salute umana.

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Gli autori desiderano ringraziare Ikiel Ptito per il suo supporto tecnico. Siamo grati a Frank Ervin, Roberta Palmour e il personale del Behavioural Sciences Laboratories Fondazione situato a St Kitts, nelle Indie Occidentali, per il supporto continuo del nostro lavoro primati.

Parte 1: Pre-trattamento dei tessuti <ol><li> Tessuto deve essere ben perfusi con paraformaldeide, glutaraldeide, o formalina. Questo può essere raggiunto attraverso standard di perfusione transcardial tipicamente usato per raccogliere altri organi. Si raccomanda che poco dopo il sacrificio gli occhi da iniettare con fissativo appena sotto la lente e conservate in fissativo. </li><li> Nel presente studio il soggetto era profondamente sedato con cloridrato di ketamina (10 mg / kg, im), eutanasia con una dose eccessiva di sodio pentobarbital (25 mg / kg, iv) e perfusi transcardially con 0,1 M PBS fino a completo dissanguato. Questa è seguita da una soluzione di paraformaldeide al 4% in PBS per 5 min (~ 1 litro). </li></ol> Parte 2: rimozione del bulbo oculare dalla cavità orbitale <ol><li> Per facilitare l&#39;accesso al bulbo oculare, si raccomanda di rimuovere prima il cervello. Una volta che il cervello è stata rimossa la parete sottile osso orbita è evidente. Utilizzare il Rongeurs osso di chip lentamente la parete dell&#39;orbita. Tagliare i muscoli oculari con un bisturi e rimuovere il tessuto connettivo dal bulbo oculare. Tagliare con cautela il nervo ottico, questo può essere usato negli studi di microscopia elettronica. Il bulbo oculare dovrebbe essere rilasciato dalla cavità orbitale. </li></ol> Parte 3: Dissect la retina dalla oculare <ol><li> Posto l&#39;occhio in una piastra di Petri con PBS per mantenere la retina si secchi. Un microscopio da dissezione o tavolo montato ingrandimento stativo è utile nella dissezione, ma non una necessità. Togliere la cornea tagliando la sclera vicino al perimetro della cornea, a livello della serrata con un paio di forbici a molla e rimuovere l&#39;obiettivo con il forcipe. </li><li> Utilizzare un pennello, pinze, forbici e molla per rimuovere la retina dalla sclera. Questo viene fatto separando la retina dalla sclera e poi tagliando la sclera via con le forbici. Si deve svolgere questo processo con piccoli incrementi in modo da non danneggiare o strappare il tessuto retinico. La sclera non è facilmente separato dal resto del nervo ottico con tanta cura tagliare la sclera attorno al nervo ottico. </li><li> A questo punto della retina ha mantenuto la sua forma curva e deve essere appiattito per il campionamento. Prima di appiattimento della retina, il vitreo, che ha la consistenza di gelatina, possono essere rimosse in un grumo. Per appiattire la retina su un vetrino, fare parecchi tagli radiali con una lama di bisturi. Vitreo residuo può essere rimosso con ordinaria carta da filtro e un pennello. La strato di cellule gangliari della retina è esposta a questo punto quindi è imperativo essere gentile quando si rimuove il vitreo. Se il nervo ottico è ancora attaccato al disco ottico, togliere il nervo ottico, senza strappare la retina con un bisturi e un paio di forbici primavera. Questa è ora una retina montaggio flat (figura 1) e la fovea dovrebbe essere evidente come una macchia scura in direzione temporale / ventrale dal disco ottico. </li></ol> Parte 4: Campionamento <ol><li> Ci sono una serie di opzioni per il campionamento della retina. Qui descriveremo la preparazione flatmount e campionamento isodentric. Per entrambe le procedure flatmount la retina con lo strato in fibra ottica di distanza dalla presentazione. Se l&#39;intenzione è di esaminare la retina strato di cellule gangliari nella preparazione flatmount, è necessario rimuovere o candeggina l&#39;epitelio pigmentato. Per rimuovere l&#39;epitelio pigmentato usare un pennello leggermente per togliere una parte di questo livello, questa tende a danneggiare lo strato dei fotorecettori. Sbiancamento coinvolge ammollo la retina in soluzione di permanganato di potassio (0,25%) per 1 ora, il lavaggio in acqua distillata, e di compensazione in acido ossalico (5%) per 5 minuti 2. </li><li> Se l&#39;intenzione è di esaminare la distribuzione cellulare e la morfologia di ogni livello per tutta la retina, quindi si consiglia di campionamento isometrica della retina. La retina deve essere flatmounted su un vetrino e tenuto umido con PBS. Per il campionamento isometrica tagliare piccoli pezzi di tessuto equidistante dal disco ottico nel nasale, indicazioni temporali, inferiore e superiore (Figura 1). Non è necessario candeggina l&#39;epitelio pigmentato in questa preparazione. Questi pezzi possono ora essere sezionato nel piano coronale con un criostato, vibratome o ultramicrotomo a seconda della domanda di ricerca. Per sezionamento criostato, i pezzi devono essere crioprotetti nel 30% di saccarosio durante la notte e congelato nel contesto di un mezzo di montaggio in ghiaccio secco. In alternativa, i campioni possono essere inclusi in agar e fette su un vibratome. Il criostato e preparati vibratome sarà resa affidabile sezioni sottili come 4 m. Se sezioni più sottili sono necessari (ad esempio per la preparazione del microscopio elettronico), è necessario preparare i campioni per i ultramicrotomo. Per fare questo, le sezioni devono essere post-fissati in tetrossido di osmio per 1 ora sotto il fumehood. Ciò è seguita da disidratazione in una serie graduata di etanolo (50, 70, 95, 95, 100, 100%) e ossido di propilene 100%. Il tessutoviene poi incorporato in Epon (embed-812 kit di embedding). </li></ol> Parte 5: Risultati Rappresentante: Nel nostro laboratorio, abbiamo regolarmente eseguire immunoistochimica sulla retina cryosectioned (Figura 2). In questo caso siamo interessati alla isodensità dei recettori dei cannabinoidi (CB1) nella retina dei primati. Abbiamo anche esaminare gli effetti dell&#39;esposizione prenatale dell&#39;etanolo sul sistema visivo dei primati. A tal fine, siamo interessati a densità cellulare e lo spessore del livello nella fovea e nella retina periferica. Per fare questo, abbiamo incorporare pezzi di retina in Epon, fetta a 700 nm su un ultramicrotomo, e colorare con blu di toluidina 1% (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/1261/fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1 Retina Flatmount. Tagli radiali sono utilizzati per appiattire la retina. <img src="/files/ftp_upload/1261/fig2.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2 immunocolorazione. Cryosection della retina periferica immunostained per CB1 dove le cellule gangliari della retina sono pesantemente etichettati con etichette negli strati interni ed esterni nucleare. Lo spessore di questa sezione è di 14 metri e colorato nella diapositiva. RG - strato retinico ganglio; IP - strato plessiforme interno; IN - interno strato nucleare; OP - strato esterno plessiformi; ON - strato esterno nucleare. <img src="/files/ftp_upload/1261/fig3.jpg" alt="figura 3" /> Figura 3 Fovea. Sezione attraverso la fovea che è stato incorporato in Epon e fette su un ultramicrotrome a 700nm. Lo strato dei fotorecettori (PR) è stato utilizzato per allineare le sezioni. Si noti che l&#39;intera estensione dei fotorecettori possono essere identificati indicando un angolo appropriato sul piano coronale. Misure di densità sono stati prelevati a 300 m, 500 m, e 800 m dal centro della fossa foveale utilizzando il sistema Bioquant Imaging. RG - strato retinico ganglio; IP - strato plessiforme interno; IN - interno strato nucleare; OP - strato esterno plessiformi; ON - strato esterno nucleare; barra di scala = 50 m

<ol><li>Hendrickson, A., Kupfer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histogenesis+of+the+fovea+in+the+macaque+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The histogenesis of the fovea in the macaque monkey.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 15, 746-756 (1976).</li>
<li>Herbin, M., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+distribution+of+retinal+ganglion+cells+in+the+St.+Kitts+green+monkey+%28Cercopithecus+aethiops+sabeus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Size and distribution of retinal ganglion cells in the St. Kitts green monkey (Cercopithecus aethiops sabeus).</a> J Comp Neurol. 383, 459-472 (1997).</li>
<li>Stone, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStone%2C+J+%22The+Wholemount+Handbook%22">The Wholemount Handbook</a>. , Maitland Publishing Pty. Ltd. Sydney. (1981).</li>
<li>Herbin, M., Boire, D., Theoret, H., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transneuronal+degeneration+of+retinal+ganglion+cells+in+early+hemispherectomized+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Transneuronal degeneration of retinal ganglion cells in early hemispherectomized monkeys.</a> Neuroreport. 10, 1447-1452 (1999).</li>
<li>Krebs, W., Krebs, I. Primate Retina and Choroid Atlas of Fine Structure in Man and Monkey. , Springer-Verlag. New York. (1991).</li>
<li>Pow, D., Sullivan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+kinesis%2C+neurite+sprouting+and+abnormal+axonal+projections+of+cone+photoreceptors+in+the+aged+and+AMD-afflicted+human+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Nuclear kinesis, neurite sprouting and abnormal axonal projections of cone photoreceptors in the aged and AMD-afflicted human retina.</a> Exp Eye Res. 84, 850-857 (2007).</li>
</ol>

La preparazione della retina come un wholemount permette l&#39;analisi della topografia e la distribuzione spaziale di uno strato di cellule gangliari o le cellule endoteliali dei vasi sanguigni della retina 3. Quantificazione della densità delle cellule nella periferia della retina dei primati è prontamente realizzato. Tuttavia, nelle regioni perifoveal e della fovea, la sovrapposizione degli strati multipli nello strato delle cellule gangliari ostacola quantificazione. Per aggirare questo pregiudizio potenz...

<table><tbody><tr><td>Scalpello</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Lame per scalpello</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla</td><td>Fine Science Tools</td><td>15020-15</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td>Qualsiasi forbice chirurgica è sufficiente</td></tr><tr><td>Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-924-150</td><td></td></tr><tr><td>Pennello con setole di cammello o martora</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la porta del cervello: dissezione l&#39;occhio primate

The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye

Il sistema visivo nell&#39;uomo è considerata la porta verso il mondo e svolge un ruolo principale nella pletora di sensoriali, i processi percettivi e cognitivi. Non è quindi sorprendente che la qualità della visione è legata alla qualità della vita. Nonostante la diffusa ricerca clinica e di base che circonda le cause dei disturbi visivi, molte forme di disabilità visive, come la retinite pigmentosa e la degenerazione maculare, la mancanza di trattamenti efficaci. I primati non umani hanno la più vicina caratteristiche generali dello sviluppo dell&#39;occhio a quello umano. Non solo hanno un simile anatomia vascolare, ma tra gli altri mammiferi, i primati hanno la caratteristica unica di avere una regione nella retina temporale specializzata di alta acuità visiva, la fovea<sup&gt; 1</sup&gt;. Qui si descrive una tecnica generale per sezionare la retina dei primati per fornire il tessuto per esame istologico della retina, immunoistochimica, microdissezione laser capture, così come la luce e la microscopia elettronica. Con l&#39;ampio uso della primate non umano come modello traslazionale, la nostra speranza è che la migliore comprensione della retina forniranno approfondimenti approcci efficaci per attenuare o invertire gli effetti negativi di disturbi visivi sulla qualità della vita degli individui colpiti.

Il primate non umano è una specie importante traslazionale per la nostra comprensione dello sviluppo e dell&#39;invecchiamento. L&#39;organizzazione anatomica della retina dei primati potrebbe fornire spunti importanti in condizioni normali e patologiche nell&#39;uomo.

La Porta del Cervello: Dissezione l&#39;Occhio Primate

Il sistema visivo nell'essere umano è considerato la porta d'accesso al mondo e svolge un ruolo principale nella pletora di processi sensoriali, percettivi e cognitivi...

Questa procedura inizia con una testa di scimmia ben perfusa. Dopo aver rimosso il cervello, si estraggono e collegano i bulbi oculari. Successivamente si elimina il tessuto circostante, quindi si rimuovono con attenzione la cornea, il cristallino, la sclera e l'umor vitreo, liberando così la retina.La retina viene posizionata piatta su un vetrino e il resto dell'umor vitreo viene eliminato. Successivamente si prelevano campioni di Iso Dentrix e si procede alla crioprotezione. Salve, sono il dottor Mark Burke del Laboratorio di Neuroscienze Visive della Scuola di Ottometria dell'Università di Montreal.Ciao, sono la dottoressa Shaheen Zur, anch'io del Laboratorio di Neuroscienze Visive della Scuola di Ottometria dell'Università di Montreal. Salve, sono il dottor Tito, direttore del Laboratorio di Neuroscienze Visive della Scuola di Ottometria, Università di Montreal. Oggi vi mostreremo una procedura per dissezionare una retina di primato non umano.Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare diversi aspetti dell'organizzazione retinica nello sviluppo normale e in risposta a interferenze nello sviluppo. Cominciamo dunque. Iniziare questo protocollo con la testa di primate, che è stata precedentemente perfusa.Bene, utilizzando un fissativo come il paraformaldeide, la retina da dissezionare viene prelevata da una scimmia vervet. Per garantire la conservazione dell'occhio, è possibile iniettare un fissativo come il paraformaldeide appena al di sotto del cristallino. La testa deve essere conservata nel fissativo o nel PBS prima di procedere al recupero dei bulbi oculari, per ottenere un accesso più agevole al bulbo oculare.Per prima cosa, rimuovere il cervello. Per visualizzare questa procedura, consultare il nostro recente articolo di JoVE sulla dissezione del cervello di primato non umano nello spazio stereotassico. Una volta rimosso il cervello, l'osso orbitario sottile diventa chiaramente visibile.Utilizzare le pinze da osso per rimuovere lentamente la parete dell'orbita. Usare un bisturi per tagliare i muscoli oculari ed eliminare il tessuto connettivo dal bulbo oculare. Infine, tagliare con attenzione il nervo ottico per staccare il bulbo oculare dalla cavità orbitaria.Ora che l'occhio è stato rilasciato, si può rimuovere la retina. Per rimuovere la retina, posizionare innanzitutto l'occhio in una piastra di Petri contenente PBS per evitare che la retina si secchi. Iniziare rimuovendo la cornea. Utilizzare un paio di forbici a molla e tagliare la sclera vicino al perimetro della cornea, al livello dell'ora serrata.Utilizzando pinzette, rimuovere la lente. Infine, per rimuovere la retina dalla sclera, utilizzare un pennello, pinzette e forbici a molla.Separare la retina dalla sclera e quindi tagliare la sclera con le forbici. Questo processo deve essere eseguito a piccoli incrementi per evitare di danneggiare o lacerare il tessuto retinico. La sclera non si separa facilmente dal nervo ottico residuo.Tagliare con attenzione la sclera intorno al nervo ottico. La retina mantiene la sua forma curva. Rimuovere l'umor vitreo di consistenza gelatinosa in un unico pezzo.La retina è ora pronta per essere montata e campionata. Per appiattire la retina su un vetrino, effettuare diverse incisioni radiali con una lama di bisturi. Utilizzare carta filtrante ordinaria e un pennello per rimuovere l'umore vitreo residuo.È fondamentale essere delicati durante l'esecuzione di questo passaggio, poiché espone il livello delle cellule gangliari retiniche. Verificare se il nervo ottico è ancora attaccato al disco ottico. Utilizzare una lama di bisturi e un paio di forbici a molla per rimuovere il nervo ottico senza strappare la retina.Ora montare in piano la retina su un vetrino microscopico di dimensioni due per tre pollici, con il livello dei gangli retinici rivolto lontano dal vetrino. La fovea è ora visibile come una zona scura in direzione temporale ventrale rispetto al disco ottico. Per esaminare lo strato delle cellule gangliari della retina, potrebbe essere necessario rimuovere o sbiancare l'epitelio pigmentato.Utilizzare un pennello per rimuovere delicatamente parte dell'epitelio pigmentato. Si noti che questo metodo tende a danneggiare lo strato dei fotorecettori. Per esaminare la distribuzione cellulare e la morfologia di ciascuno strato in tutta la retina, è necessario un campionamento isometrico della retina.Iniziare montando in piano la retina su un vetrino e aggiungere PBS per mantenere la retina umida. Quindi tagliare piccoli pezzi di tessuto equidistanti dal disco ottico nelle direzioni nasale, temporale, superiore e inferiore. Questi frammenti possono ora essere sezionati nel piano coronale con un criostato vibratome o un ultramicrotomo.A seconda della domanda di ricerca. Per la sezione al criostato, i pezzi devono essere protetti mediante crioprotezione in una soluzione di saccarosio al 30% in tampone fosfato, incubati tutta la notte a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione notturna, congelare i pezzi retinici in un mezzo di montaggio su ghiaccio secco.Utilizzare il criostato per ottenere sezioni sottili fino a quattro micron. Nel nostro laboratorio, eseguiamo regolarmente immunohistochemia su sezioni criostatiche di retina. In questo caso, siamo interessati all'isodensità dei recettori cannabinoidi nella retina dei primati.Esaminiamo inoltre gli effetti dell'esposizione prenatale all'etanolo sul sistema visivo dei primati. A tal fine, siamo interessati alla densità cellulare e allo spessore dei strati nella fovea e nella retina periferica. Per raggiungere questo obiettivo, inseriamo frammenti di retina in epon e li tagliamo a 700 nanometri mediante un ultramicrotomo, quindi li coloriamo con 1% toluidina blu.Abbiamo appena mostrato come dissezionare una retina di primate. Durante questa procedura, è importante ricordarsi di non danneggiare i gangli retinici, lo strato cellulare o gli strati dei fotorecettori. Questo è tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Il primate non umano è una specie importante traslazionale per la nostra comprensione della normale elaborazione del cervello. L'organizzazione anatomica del cervello dei primati in grado di fornire spunti importanti in condizioni normali e patologiche nell'uomo.

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