Name: Conoscere ciò che conta: stereologia Tutti nel settore non umano cervello dei primati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-14T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Scopri la stereologia non distorta per stimare il numero di neuroni nel cervello dei primati non umani. Questo metodo fornisce conteggi cellulari accurati per studiare l'anatomia cerebrale in condizioni normali e patologiche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori desiderano ringraziare Ikiel Ptito per il suo continuo supporto tecnico. NSERC concedere a MP.

Parte 1: Pre-trattamento dei tessuti deve essere fatto secondo Burke et al. (2009) 5. <ol><li> In breve, il tessuto deve essere ben perfusi con paraformaldeide, glutaraldeide, o formalina. Questo può essere raggiunto attraverso standard di perfusione transcardial tipicamente usato per raccogliere altri organi. Nel presente studio il soggetto era profondamente sedato con cloridrato di ketamina (10 mg / kg, im), eutanasia con una dose eccessiva di sodio pentobarbital (25 mg / kg, iv) e perfusi transcardially con 0,1 M PBS fino a completo dissanguato. Questa è seguita da una soluzione di paraformaldeide al 4% in PBS per 5 min (~ 1 litro). Tessuto deve essere ben perfusi con paraformaldeyhde, gluteraldehyde, o formalina. Il cervello deve essere stereotaxically bloccato, rimosso dal cranio, pesato, volume determinato, crioprotetti, e congelati 5. </li></ol> Parte 2: campionamento sistematico del tessuto, secondo Burke et al. (2009) 6. <ol><li> In questo esempio ci siamo concentrati sul lobo frontale del cervello vervet. Lo spazio di riferimento è stato definito per includere tessuto corticale dal solco centrale al polo frontale dell&#39;emisfero sinistro. Per i nostri scopi la serie sono stati fissati a 1 / 10 sezioni in tutta la corteccia, sezionati a 50 micron. Una serie completa era macchiata di violetto cresolo (serie # 1). Serie 2 è stata suddivisa in modo che la metà delle sezioni sono state colorate con cloruro d&#39;oro per la rivelazione della mielina e macchiato altra metà per l&#39;acetilcolina esterasi (per la definizione di talune regioni subcorticali). Tutte le altre serie sono state sopraelevate nel preservare l&#39;antigene come parte dei nostri piani a lungo termine della ricerca. </li></ol> Parte 3: stereologia (per maggiori dettagli, vedere Mouton 2002) 4 <ol><li> La stima totale del numero di cellule (N) è calcolato in base alla seguente equazione: N = -1 x ssf asf -1 x -1 x tsf Σ Q - Dove SSF è la frazione di campionamento sezione, asf è la frazione di campionamento dell&#39;area, TSF se la frazione di campionamento spessore (dove lo spessore del tessuto misurato viene diviso per l&#39;altezza dissettore) e Σ Q - è il numero totale di oggetti di interesse contati all&#39;interno del dissettore. Le sezioni successive di questo protocollo mostrano come determinare la SSF, asf, TSF e Σ Q. </li><li> Sezione Frazione di campionamento (non su computer) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Lo spazio intero riferimento devono essere ben definiti da anteriore a posteriore e dorsale a ventrale. In questo esempio siamo stati interessati al lobo frontale e lo hanno definito come la regione dalla punta del polo frontale (anteriore) al solco centrale (posteriore) e il solco laterale (ventrale) ed esclusa l&#39;insula. </li><li> Per il lobo frontale di questo particolare argomento per un totale di 760 sezioni sono stati sistematicamente raccolti con 76 colorati per violetto cresolo. Dal momento che l&#39;obiettivo era di 10 sezioni in tutto lo spazio di riferimento sezioni viola 1 / 6 cresile macchiati sono stati campionati, portando ad una frazione sezione campione di circa 1 / 60. Siamo a caso iniziato con una delle prime 6 sezioni cresile colorate viola e sistematicamente a campionamento 1 / 6 dopo. Un totale di 13 sezioni sono stati campionati per il soggetto selezionato (Figura 2). </li></ol></li><li> Area Frazione del campione (computer-based) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Uno studio pilota indicherà la dimensione ottimale della griglia, la Frazione di campionamento Zona, per esempio lo spazio di riferimento con circa 100-300 disectors. All&#39;interno del lobo frontale, una dimensione della griglia di 2500 micron 2 prodotto una media di 254 disectors per questo argomento (Figura 2). Le dimensioni del disector dovrebbe portare tra circa 0-5 oggetti contati, in questo caso, i neuroni. </li></ol></li><li> Frazione spessore del campione (computer-based) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> In ogni posto disector, l&#39;altezza del tessuto viene misurata, e una frazione di questa altezza viene campionato, questo è noto come la frazione di campionamento spessore. Per determinare lo spessore misurato, messa a fuoco attraverso il piano z fino alla prima cellula viene messa a fuoco, poi di nuovo leggermente la parte superiore della sezione, cioè fino a quando l&#39;ultimo oggetto appare solo fuori fuoco. Per determinare la parte inferiore del tessuto, messa a fuoco attraverso il piano z fino a quando le cellule sono appena fuori fuoco. </li><li> Messa a fuoco attraverso il piano z, le cellule devono essere colorate ad ogni profondità, altrimenti questo può indicare una penetrazione incompleta del disidratazione macchia o non uniforme del tessuto, nel qual caso le sezioni devono essere ri-colorati. Questa precauzione è particolarmente importante per il tessuto immunostained che richiede la penetrazione di immunoprobes attraverso sezioni di tessuto relativamente spesso. Per questo motivo, il tessuto immunostained devono essere leggermente di contrasto con una macchia basofile (ad esempio, violetto cresolo, Hematoxylin) al fine di determinare con precisione superiore e inferiore della sezione e per confermare la penetrazione degli anticorpi. In questo studio le sezioni sono state fette in un ambiente microtomo di 50 micron. Dopo tutto era completo di lavorazione dei tessuti, lo spessore del tessuto misurato una media di 17.9μm (Figura 2), con una contrazione media di circa il 65%. Si noti che questi risultati rappresentano contrazione tipica dei tessuti trattati per la preparazione di routine istologica 7. </li><li> L&#39;altezza disector di default per lo studio tipico è 10μm. La differenza tra l&#39;altezza e lo spessore disector sezione è misurata l&#39;altezza di guardia, il volume del tessuto dove si contano non caratteristiche biologiche. L&#39;uso di un altezza guardia evita danni ai tessuti alle superfici di sezionamento (ad esempio, ha perso caps). </li></ol></li><li> Il numero totale di oggetti contati, Σ Q - <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Per evitare distorsioni di errori di riconoscimento, è indispensabile che una definizione standard è seguito per la particolare caratteristica di interesse biologico. In questo caso, eravamo interessati a contare i neuroni. Pertanto, un neurone è stato definito come avere un nucleolo visibile in posizione centrale e un citoplasma chiaramente definito, mentre le cellule gliali genere mancava nucleoli visibili e citoplasma. Per questo tema sono stati contati 457 neuroni. </li></ol></li></ol> Parte 4: Stereologer - Un sistema computerizzato stereologia (stereologia Resource Center, Chester, MD) <ol><li> Il sistema Stereologer richiede all&#39;utente di compilare le informazioni necessarie in un passo-passo della moda. Nella sezione &quot;Informazioni di Studio&quot; sezione dei parametri dello studio sono stabiliti. Dal momento che uno spazio di riferimento deve essere definito per lo studio, il parametro volume dovrebbe essere selezionato (per lo spazio di riferimento lo stimatore Cavalieri dovrebbe essere selezionato). Il volume oggetto può anche essere selezionato qui per stimare il numero ponderata volume per la popolazione di oggetti di interesse. Per il nostro esempio, solo il volume dello spazio di riferimento è stato selezionato. Per ogni oggetto, selezionare il numero e definire la funzione di interesse, in questo caso neuroni. </li><li> Inizializzazione caso: In questa sezione le informazioni di campionamento è stabilito. Inserire l&#39;intervallo lastra di campionamento (se separato lastre di tessuto sono stati affettati tassativamente ed ogni sezione si trova in ordine sequenziale quindi immettere 1 qui). Inserire il numero totale delle sezioni prese attraverso lo spazio di riferimento (in questo caso 760). Quindi, immettere l&#39;intervallo di campionamento sezione (in questo caso 59). Il sistema calcola il numero di sezioni da campionare (in questo caso 13). </li><li> Parametri sonda: Questa sezione definisce la griglia e le dimensioni disector. Per il volume, utilizzare un basso ingrandimento 2,5 x-10x per definire la spaziatura della griglia sotto il menu di modifica. Ingrandimento oggetto deve essere eseguita a 100x (NA 1.3 o 1.4). Zona Frame è la dimensione del disector, in questo caso abbiamo utilizzato il 50% dello schermo. L&#39;altezza del telaio è lo spessore del disector; fissato a 10μm qui. La distanza fra le dimensioni della griglia. Nel nostro studio pilota, abbiamo scoperto che 2500μm rendimenti tra 150-200 fotogrammi distanziati in modo sistematico, uniforme modo attraverso uno spazio di riferimento relativamente grande. Per le aree più piccole, una dimensione della griglia più piccola dovrebbe essere usato. Uno studio pilota di identificare i parametri della sonda ottica per ogni studio particolare. </li><li> Una volta che i parametri di studio sono stati stabiliti, il campionamento attraverso il tessuto può procedere. Il programma chiederà di esempio la prima sezione Fase 1:. Il programma richiede all&#39;utente, in basso ingrandimento, per tracciare lo spazio di riferimento per la sezione. Il sistema sarà poi posto una griglia sopra la sezione in base ai parametri della sonda e l&#39;utente dovrà quindi verificare che i punti cadono all&#39;interno dello spazio di riferimento. Se un punto non è all&#39;interno dello spazio di riferimento è sufficiente fare clic sul punto e non sarà calcolata nel volume. Fase 2: Il sistema posto una nuova griglia nello spazio di riferimento, sulla base di parametri spaziatura telaio. Verificare che le intersezioni cadono all&#39;interno dello spazio di riferimento Fase 3:. Il sistema chiederà all&#39;utente di passare all&#39;obiettivo ingrandimenti e spostare il palco per il dissettore prima Fase 4:. A questo punto il sistema richiede all&#39;utente di definire il superiore e inferiore della sezione allora il sistema imposta lo spazio di campionamento l&#39;asse z Passo 5:. L&#39;utente dovrà quindi fare clic su ogni oggetto che rientra nel disector attraverso il piano z. Gli oggetti che toccano le linee rosse o in fondo alla disector non può essere conteggiato. Una volta che ogni oggetto viene contato, fare clic su Avanti. La tappa si sposta alla prossima disector e passaggi 4 e 5 sarà ripetuto. Una volta che tutti i disectors per la sezione sono stati contati, il sistema chiederà all&#39;utente di inserire la sezione successiva sequenziale per essere sondato. Passi 1-5 si ripeterà fino a quando tutte le sezioni sono sequenzialistato campionato. Il sistema fornirà quindi i calcoli per asf, SSF, TSF, e Σ Q. Sulla base di questi parametri, il sistema genererà una N stimato, il volume di riferimento e CE per entrambi il numero stimato e volume. Si darà anche suggerimenti per diventare più efficienti o per ridurre il marchio CE (Figura 2). </li></ol> Parte 5: Risultati Rappresentante: Stereologia Tutti fornisce stime efficiente e affidabile di popolazioni di cellule all&#39;interno di uno spazio di riferimento. Ci sono una serie di sistemi basati su computer stereological disponibili, tutte che si basano su un campionamento sistematico e uno spazio di riferimento definito. Abbiamo usato il sistema BioQuant Life Sciences per stimare la popolazione totale dei neuroni della corteccia cerebrale di 2 anni, cercopitechi a oltre 828 milioni (Figura 3) con una media di 0,042 CE. Abbiamo poi utilizzato il sistema Stereologer di stimare che i conti del lobo frontale per circa la metà del numero di neuroni corticali 8. <img src="/files/ftp_upload/1262/1262fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1 Computer sistemi basati stereologia. Il set-up di base dei sistemi stereologia è lo stesso, un microscopio con uno stadio motorizzato (xyz), un controller stadio, videocamera, computer e software. Il sistema che è in definitiva scelta dovrebbe essere basata su efficienza, bisogni e analisi dei costi. <div style="border:1px #000000 solid"><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> STUDIO INFORMAZIONI </td></tr><tr><td> Nome studio </td><td> Corteccia frontale </td></tr><tr><td> Principal Investigator </td><td> MB </td></tr><tr><td> Specie </td><td> AG </td></tr><tr><td> Spazio di riferimento frontale </td><td> Corteccia </td></tr><tr><td colspan="2"> Note </td></tr><tr><td colspan="2"> CASE INFORMAZIONI </td></tr><tr><td> Data Collector </td><td> MB </td></tr><tr><td> Data </td><td> Mercoledì 30 Aprile, 2008 </td></tr><tr><td> Gruppo </td><td> Controllo </td></tr><tr><td> Soggetto </td><td> O26 </td></tr><tr><td colspan="2"> Note </td></tr><tr><td colspan="2"> CAMPIONAMENTO CARATTERISTICHE </td></tr><tr><td> Intervallo di campionamento lastra </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Numero totale delle sezioni </td><td> 760 </td></tr><tr><td> Sezione di campionamento Intervallo </td><td> 59 </td></tr><tr><td> Sezione di partenza </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="2"> FRAZIONI </td></tr><tr><td> ASF </td><td> 0,0002 </td></tr><tr><td> SlabSF </td><td> 1,0000 </td></tr><tr><td> SSF </td><td> 0,0169 </td></tr><tr><td> TSF </td><td> 0,5587 </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="6"> RIEPILOGO RISULTATI </td></tr><tr><td> Parametro </td><td> Sonda </td><td> Nome </td><td> Risultato </td><td> CE </td><td> SD </td></tr><tr><td> Spessore </td><td> --- </td><td> --- </td><td> 17,8996 μ </td><td> --- </td><td> --- </td></tr><tr><td> Numero </td><td> Disector </td><td> neurone </td><td> 243833769.1473 </td><td> 0,0474 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Volume </td><td> Cavalieri Punto Griglia </td><td> volume </td><td> 1719769397954.1284 μ ^ 3 </td><td> 0,0078 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> RACCOMANDAZIONI </td></tr><tr><td> Sonda </td><td> Oggetto Number (neuroni) </td></tr><tr><td> CE </td><td> 0,0474 </td></tr><tr><td> Raccomandazioni </td><td> CE è accettabile. </td></tr></tbody></table&gt; <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Numero di Visto Disectors è troppo alta, aumentare la spaziatura Disector. </td></tr><tr><td> Sonda </td><td> Regione Volume (volume) </td></tr><tr><td> CE </td><td> 0,0078 </td></tr><tr><td> Raccomandazioni </td><td> CE è accettabile. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="3"> SEZIONE RISULTATI </td></tr><tr><td> Sezione </td><td> neurone NumObjects NumCorners neurone </td><td> il volume RegPoints </td></tr><tr><td> 1. 40 </td><td> 48 </td><td> 34 </td></tr><tr><td> 2. 26 </td><td> 52 </td><td> 44 </td></tr><tr><td> 3. 29 </td><td> 56 </td><td> 48 </td></tr><tr><td> 4. 39 </td><td> 100 </td><td> 83 </td></tr><tr><td> 5. 49 </td><td> 112 </td><td> 83 </td></tr><tr><td> 6. 53 </td><td> 156 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 7. 65 </td><td> 128 </td><td> 106 </td></tr><tr><td> 8. 45 </td><td> 108 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 9. 52 </td><td> 100 </td><td> 77 </td></tr><tr><td> 10. 26 </td><td> 64 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> 11. 21 </td><td> 44 </td><td> 44 </td></tr><tr><td> 12. 11 </td><td> 36 </td><td> 32 </td></tr><tr><td> 13. 1 </td><td> 12 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table></div> Figura 2 I risultati del lobo Fontal ottenuti con il sistema Stereologer. Per il lobo frontale, la parte più lunga del processo stereological era nel campionamento sistematico e sezionamento. Stima topografia, il volume e neuronale sono stati completati in circa un giorno per ogni soggetto. L&#39;emisfero sinistro è stato campionato e il numero è raddoppiato nel testo di una stima approssimativa per entrambi gli emisferi. <img src="/files/ftp_upload/1262/1262fig3.jpg" alt="figura 3" /> Figura 3 stima della popolazione neuronale Cortex Ottenuto con BioQuant. BioQuant Il sistema richiede una topografia esatta prima del conteggio delle cellule. Qui una media di 13 sezioni sono state campionate. Topografia corticale e la stima del volume successivo ha preso tra le 15-20 ore per ciascun soggetto. Topografia è stato eseguito in un obiettivo 2,5 x e il conteggio è stato fatto con un obiettivo 100x immersione in olio (NA 1.3). Ogni sezione 100 è stato scelto in tutto l&#39;emisfero sinistro con una media di 180 disectors campionati. Una volta la topografia è stato completato il conteggio neuronale ha richiesto circa un giorno. L&#39;emisfero sinistro è stato campionato e il numero è raddoppiato nel testo di una stima approssimativa per entrambi gli emisferi.

<ol><li>West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator%5BTitle%5D)+AND+%22Aat+Rec%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> Aat Rec. 231, 482-497 (1991).</li>
<li>Saper, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Any+way+you+cut+it%3A+a+new+journal+policy+for+the+use+of+unbiased+counting+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Any way you cut it: a new journal policy for the use of unbiased counting methods.</a> J Comp Neurol. 364, 5-5 (1996).</li>
<li>Sterio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unbiased+estimation+of+number+and+sizes+of+arbitrary+particles+using+the+disector%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector.</a> J Microsc. 134, 127-136 (1984).</li>
<li>Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMouton%2C+PR+%22Principles+and+Practices+of+Unbiased+Stereology%22">Principles and Practices of Unbiased Stereology</a>. , The Johns Hopkins University Press. Baltimore. (2002).</li>
<li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+non-human+primate+brain+in+stereotaxic+space%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissecting the non-human primate brain in stereotaxic space.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li>
<li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+banking%3A+Making+the+most+of+your+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Brain banking: Making the most of your research.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li>
<li>Manaye, K. F., Wang, P., O'Neil, J., Huafu, S., Tizabi, Y., Thompson, N., Ottinger, M. A., Ingram, D. K., Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathological+Quantification+Of+Dtg+APP%2FPS1%3A+Neuroimaging%2C+Stereology%2C+And+Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22AGE%22%5BJournal%5D)">Neuropathological Quantification Of Dtg APP/PS1: Neuroimaging, Stereology, And Biochemistry.</a> AGE. 29, 87-96 (2009).</li>
<li>Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+reduction+in+frontal+cortex+of+primates+after+prenatal+alcohol+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure.</a> Neuroreport. 20, 13-17 (2009).</li>
<li>Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Batch+immunostaining+for+large-scale+protein+detection+in+the+whole+monkey+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Batch immunostaining for large-scale protein detection in the whole monkey brain.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li>
</ol>

Stereologia Tutti in un cervello dei primati è simile a quella di altri campioni biologici. Tuttavia, date le dimensioni del cervello dei primati, un piano di trattamento è raccomandato un attento quanto un singolo emisfero della scimmia cercopiteco produce più di 1200 sezioni al taglio a 50 micron. In primo luogo si consiglia stereotaxically bloccare il cervello in blocchi 1 cm, che fornisce un piano standard di sezione tra blocchi e soggetti, minimizza le sezioni parziali tra i blocchi, e fornisce gestibile blocchi di...

<table><tbody><tr><td>Stereologer</td><td>Stereology Resource Center (Chester, MD)</td><td>www.disector.com</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Stereology Tool-Kit Stereologer</td><td>BioQuant Life Sciences (Nashville, TN)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StereoInvestigator</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

conoscere ciò che conta: stereologia tutti nel settore non umano cervello dei primati

Knowing What Counts: Unbiased Stereology in the Non-human Primate Brain

Il primate non umano è una specie importante traslazionale per la comprensione dei processi di normale funzione e malattie del cervello umano. Stereologia imparziali, il metodo accettato come state-of-the-art per la quantificazione di oggetti biologici in sezioni di tessuto<sup&gt; 2</sup&gt;, Genera affidabili dati strutturali per le caratteristiche biologiche del cervello dei mammiferi<sup&gt; 3</sup&gt;. I componenti chiave dell&#39;approccio sono obiettive (sistematico-casuale) il campionamento di strutture anatomicamente definito (spazi di riferimento), combinata con la quantificazione del numero di cellule dimensioni e lunghezze, fibre e capillari, superfici, volumi regionali e distribuzione spaziale degli oggetti biologici all&#39;interno del riferimento spazio<sup&gt; 4</sup&gt;. Tra i vantaggi di questi approcci stereological rispetto ai metodi precedenti è quello di evitare tutte le fonti conosciute di errore sistematico (non casuale) derivanti da assunzioni errate e non verificabili modelli. Questo studio documenta una applicazione biologica di stereologia computerizzati per stimare la popolazione neuronale nella corteccia frontale del cervello della scimmia cercopiteco (<em&gt; Chlorocebus aethiops sabeus</em&gt;), Con l&#39;assistenza di due programmi stereologia disponibili in commercio, Scienze della Vita e BioQuant Stereologer (Figura 1). Oltre a contrasto e il confronto dei risultati sia dal BioQuant e<em&gt; Stereologer</em&gt; Sistemi, questo studio fornisce un protocollo dettagliato per la<em&gt; Stereologer</em&gt; Sistema.

L&#39;organizzazione anatomica del cervello dei primati in grado di fornire spunti importanti in condizioni normali e patologiche nell&#39;uomo. Tutti stereologia è un metodo per precisione ed efficienza stimare il numero totale dei neuroni (o tipo di cellula) in uno spazio di riferimento dato<sup&gt; 1</sup&gt;.

Conoscere ciò che conta: stereologia Tutti nel settore non umano cervello dei primati

I primati non umani rappresentano una specie traslazionale fondamentale per comprendere il funzionamento normale e i processi patologici del cervello umano. Analisi non distorte...

Questa procedura inizia definendo lo spazio di riferimento. Un atlante stereotassico può essere utile per determinare i confini dell'area di interesse. Successivamente, organizzare i vetrini e stabilire la frequenza di campionamento delle sezioni.Inserire la prima sezione da campionare nel microscopio e compilare i parametri di campionamento. Nel sistema tologico, verrà posizionata una griglia sullo spazio di riferimento e in ogni intersezione verrà effettuato un campionamento mediante dissezione ottica. Una volta campionati tutti i dissector ottici su ciascuna sezione, il sistema stereologico fornirà i risultati dello studio.Ciao, sono il dottor Mark Burke del Laboratorio di Neuroscienze Visive della Scuola di Ottometria dell'Università di Montreal. Ciao, sono la dottoressa Shaheen Zur, anch'io del Laboratorio di Neuroscienze Visive della Scuola di Ottometria dell'Università di Montreal. Salve, sono il dottor Morris Petto, direttore del Laboratorio di Neuroscienze Visive della Scuola di Ottometria, Università di Montreal.Oggi vi mostreremo un procedimento per eseguire una radiologia senza bias nella scimmia non umana. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per stimare le popolazioni neuronali totali in diverse aree cerebrali. Cominciamo dunque.Iniziare questo protocollo con un cervello che è stato precedentemente perfuso. Dopo la fissazione con un agente fissativo come il paraformaldeide, il cervello deve essere bloccato nello spazio stereotassico, protetto criogenicamente e congelato. Per visualizzare questi protocolli in dettaglio, consultare il nostro recente articolo su JoVE, dedicato alla dissezione del cervello di primati non umani.Nello spazio stereotassico, il cervello deve essere sezionato sistematicamente in modo da comprendere l'intero spazio di riferimento. Per visualizzare questo protocollo in dettaglio, consultare il nostro recente articolo su JoVE, brain Banking, making the most of your research specimens. In questo esperimento, utilizziamo il lobo frontale del cervello del vervet.La serie è impostata su una sezione ogni 10 lungo tutta la corteccia e sezionata a 50 micrometri. Per calcolare il numero stimato di cellule N, utilizziamo la seguente equazione in cui SSF è la frazione di campionamento delle sezioni e A SF è la frazione di campionamento dell'area.TSF è la frazione di campionamento dello spessore, in cui lo spessore misurato del tessuto viene diviso per l'altezza del dissecatore, e un cubo rappresenta il numero totale di oggetti di interesse conteggiati all'interno del dissecatore. Per determinare la frazione di campionamento della sezione, l'intero spazio di riferimento deve essere ben definito da anteriore a posteriore e da dorsale a ventrale. In questo caso siamo interessati al lobo frontale, che definiamo come la regione che va dalla punta del polo frontale alla scissura centrale e alla scissura laterale.Escludendo l'insula per il lobo frontale di questo soggetto, sono state raccolte sistematicamente un totale di 760 sezioni, di cui 76 colorate con violetto di cresta. Poiché l'obiettivo era ottenere 10 sezioni lungo tutto lo spazio di riferimento, è stata campionata una sezione ogni sei di quelle colorate con violetto di cresta. Ciò porta a una frazione di campionamento delle sezioni, o SSF, di circa una ogni 60.Iniziamo in modo casuale con una delle prime sezioni di colorazione violetta crestale ed esaminiamo sistematicamente il resto di una ogni sei. Successivamente, per il soggetto selezionato vengono analizzate un totale di 13 sezioni. Per evitare bias derivanti da errori di riconoscimento, è fondamentale seguire una definizione standard per la caratteristica biologica di interesse specifica.Qui eravamo interessati al conteggio dei neuroni e abbiamo definito un neurone come una cellula con un nucleo visibile, situato centralmente, e un citoplasma chiaramente definito. Per questo studio, utilizziamo stereo, un sistema informatico di teologia. Il sistema guida l'utente a compilare le informazioni necessarie in modo passo dopo passo.Nella sezione informazioni dello studio, vengono stabiliti i parametri dello studio. Il parametro relativo al volume deve essere selezionato per definire uno spazio di riferimento per lo studio. Può essere inoltre selezionato il volume dell'oggetto per stimare il volume pesato per numero nella popolazione di oggetti di interesse.In questo caso, è stato selezionato solo il volume dello spazio di riferimento. Per ogni oggetto, selezionare il numero e definire la caratteristica di interesse, in questo caso i neuroni. Per impostare le informazioni sul campionamento, inserire l'intervallo di campionamento della sezione.Se vengono tagliate in modo esaustivo sezioni separate di tessuto e ogni sezione viene posizionata in ordine sequenziale, inserire qui il numero uno. Successivamente, inserire il numero totale di sezioni ottenute attraverso il riferimento e quindi inserire l'intervallo di campionamento delle sezioni. Il sistema calcolerà quindi il numero di sezioni da campionare.Per definire la griglia e sezionare una dimensione, utilizzare un ingrandimento basso compreso tra 2,5 e 10x. Per definire l'intervallo della griglia nel menu modifica per il volume, l'ingrandimento dell'oggetto deve essere eseguito a 100x. L'area del telaio corrisponde alle dimensioni del dissezionatore.In questo caso, abbiamo utilizzato uno screen al 50%. L'altezza del fotogramma corrisponde allo spessore del dissezionatore. Qui è impostata a 10 micrometri e determinerà la frazione di campionamento del tessuto.La distanza tra i riquadri corrisponde alle dimensioni della griglia. Per aree più piccole, si dovrebbe utilizzare una dimensione della griglia più ridotta per questo soggetto e, all'interno del lobo frontale, una dimensione della griglia di 2.500 micrometri fornisce una media di 254 dissezionatori. Le dimensioni del dissezionatore dovrebbero consentire di contare da zero a cinque oggetti.In questo caso, nei neuroni, sia la dimensione del dissecatore che quella della griglia vengono utilizzate per calcolare la frazione di campionamento dell'area. Una volta stabiliti i parametri dello studio, si può iniziare il campionamento del tessuto a basso ingrandimento. Il programma chiederà all'utente di tracciare lo spazio di riferimento sulla sezione.Il sistema posizionerà quindi una griglia sulla sezione in base ai parametri pro. Questa griglia viene utilizzata per calcolare il volume. Successivamente, l'utente verificherà che i punti siano all'interno dello spazio di riferimento.Se un punto non si trova all'interno dello spazio di riferimento, è sufficiente fare clic sul punto perché non venga calcolato nel volume. Successivamente, il sistema posizionerà una nuova griglia sopra lo spazio di riferimento in base ai parametri di spaziatura del telaio. Le intersezioni di questa griglia determinano la posizione in cui verrà collocato ciascun dissecatore.Ora, verificare che le intersezioni cadano all'interno dello spazio di riferimento. Il sistema chiederà all'utente di passare all'obiettivo con ingrandimento maggiore e di spostare il tavolino sul primo dissecatore. A questo punto, il sistema chiederà all'utente di definire il limite superiore e inferiore della sezione.Questo viene fatto per determinare la TSF, la frazione di campionamento dello spessore, e verrà ripetuto in ogni posizione del dissecatore. Per determinare lo spessore misurato, mettere a fuoco attraverso il piano Z finché la prima cellula non entra a fuoco. Quindi arretrare leggermente fino alla sommità della sezione, fino a quando l'ultimo oggetto appare appena fuori fuoco.Quindi, per individuare il fondo del tessuto, mettere a fuoco attraverso il piano Z finché le cellule risultino appena sfocate durante lo spostamento nel piano Z. Si noti che le cellule devono essere colorate a ogni profondità. In caso contrario, ciò potrebbe indicare una penetrazione incompleta del colorante o una disidratazione non uniforme del tessuto, e in tal caso le sezioni dovrebbero essere nuovamente trattate.L'altezza predefinita del dissecatore per questo studio è di 10 micrometri. La differenza tra l'altezza del dissecatore e lo spessore della sezione misurato corrisponde all'altezza di protezione, ovvero al volume di tessuto in cui non vengono conteggiate caratteristiche biologiche. Il sistema imposta quindi lo spazio di campionamento sull'asse Z.L'utente dovrà quindi fare clic su ciascun oggetto che rientra nel dissecatore attraverso il piano Z. Gli oggetti che toccano le linee rosse o il fondo del dissecatore non vengono conteggiati. Dopo aver contato ciascun oggetto, fare clic su avanti.Viene utilizzato per calcolare il numero totale di oggetti. Il palco si sposterà al dissecatore successivo e ripeterà i passaggi precedenti. Una volta contati tutti i disseccatori della sezione, il sistema chiederà all'utente di inserire la sezione successiva in ordine sequenziale da analizzare.I passaggi verranno ripetuti fino a quando tutte le sezioni sequenziali non saranno state campionate. Al termine, il sistema fornirà i calcoli relativi al campionamento dell'area, al campionamento della frazione delle sezioni, al campionamento della frazione del tessuto e al numero totale di oggetti. Sulla base di questi parametri, il sistema genererà un volume di riferimento n stimato e i coefficienti di errore sia per il numero stimato che per il volume.Fornirà inoltre raccomandazioni per diventare più efficienti o per ridurre il coefficiente di errore. Ti abbiamo appena mostrato come eseguire una stereologia imparziale in un campione biologico. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di campionare sistematicamente in tutto lo spazio di riferimento, misurare con attenzione lo spessore del tessuto in ciascun dissecatore ottico e definire chiaramente l'oggetto di interesse.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

knowing-what-counts-unbiased-stereology-in-the-non-human-primate-brain

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Il primate non umano è una specie importante traslazionale per la nostra comprensione della normale elaborazione del cervello. L'organizzazione anatomica del cervello dei primati in grado di fornire spunti importanti in condizioni normali e patologiche nell'uomo.

Dissezione di non-umano cervello dei primati nello spazio Stereotassica

Banche del cervello e campionatura sistematica di materiale biologico costituisce la base per stereologia imparziale e massimizza il potenziale dei dati ottenuti da ogni campione.

Cervello Banking: Utilizzare al meglio il vostro campioni di ricerca

Fonte: Olesen, M. V., et al. La tecnica del frazionamento ottico per stimare il numero di cellule in un modello di ratto di terapia elettroconvulsivante. J. Vis. Exp. (2017).  Il video mostra la tecnica per quantificare i neuroni appena generati nel tessuto cerebrale. Fette di tessuto ippocampale contenenti neuroni marcati con Bromodeossiuridina (BrdU) sono state colorate utilizzando l'immunoistochimica e successivamente quantificate attraverso lo spessore del tessuto utilizzando la tecnica del...

Quantificazione dei neuroni appena generati nel tessuto cerebrale di ratto utilizzando la tecnica del frazionamento ottico

procedure di taglio del cervello organizzati sono necessarie per correlare fenomeni neuropsichiatrici specifici con diagnosi neuropathologic definitive. talee cervello vengono eseguiti in modo diverso in base a varie contingenze clinico-accademico. Questo protocollo descrive una procedura simmetrica bihemispheric taglio del cervello per indagare le differenze emisferiche nelle patologie del cervello umano e per massimizzare le tecniche biomolecolari / neuroimaging attuali e future.

Simmetrica Bihemispheric Postmortem cervello taglio per studiare sano e patologico del cervello Condizioni di esseri umani

Questo protocollo descrive ricostruzioni su larga scala di popolazioni neuronali selettivi, etichettati dopo l'infezione retrograda con esprimendo un virus della rabbia modificato marcatori fluorescenti, e le analisi di cluster indipendente, imparziale che consentono la caratterizzazione completa delle metriche morfologiche tra sottoclassi neuronali distinti.

Ricostruzioni su larga scala e indipendente, imparziale Clustering Sulla base morfologici metrica per classificare i neuroni in selettivi Popolazioni

Qui presentiamo un metodo stereologico, il frazionatore ottico, usato per quantificare la formazione di nuovi neuroni e la loro sopravvivenza nell'ippocampo del ratto dopo la stimolazione elettro-convulsiva. Quando viene correttamente implementata, la sensibilità e l'efficienza dei metodi stereologici garantiscono accurati stimi con una precisione fissa e predeterminata.

La tecnica del frazionatore ottico per stimare i numeri di cella in un modello di ratto della terapia elettroconvulsiva

Questo lavoro presenta un protocollo passo-passo per la valutazione imparziale stereologiche dei numeri di un neurone delle cellule dopaminergiche nel nigra di substantia del mouse utilizzando attrezzature di microscopia standard (cioè, un microscopio ottico, una tabella di oggetto motorizzato (x, y, z aereo) e software di pubblico dominio per analisi digitale delle immagini.

Stereologiche stima del numero di neuroni dopaminergici nel Nigra di Substantia del Mouse utilizzando il frazionatore ottica e microscopia Standard attrezzature

Il metodo descritto di seguito mira a fornire un protocollo completo per la preparazione della neurochirurgia dei primati non umani (NHP) utilizzando una nuova combinazione di metodi di stampa tridimensionali (3D) ed estrazione di dati MRI.

Una cassetta degli attrezzi basata sulla risonanza testurtica per la pianificazione neurochirurgica in primati non umani

Questo protocollo descrive i metodi per condurre la risonanza magnetica, la pulizia e l'immunomarcatura di cervelli di topo intatti utilizzando iDISCO +, seguita da una descrizione dettagliata dell'imaging utilizzando la microscopia a foglio di luce e analisi a valle utilizzando NuMorph.

Imaging a singola cellula dell'intero cervello e analisi di cervelli di topo neonatale intatti mediante risonanza magnetica, pulizia dei tessuti e microscopia a foglio luminoso

L'imaging con tomografia seriale a due fotoni (STPT) è una tecnica per visualizzare una massa di tessuto nella sua forma tridimensionale combinando l'imaging a due fotoni con il controllo automatico dello stadio e lo slicing del microtomo. Qui descriviamo un protocollo per implementarlo per i cervelli degli uistitì per comprendere meglio le loro caratteristiche strutturali.

Tomografia seriale a due fotoni dell'intero cervello dell'uistitì per analisi neuroanatomiche

Le neuroscienze moderne devono esplorare le differenze tra molte specie, inclusi roditori da laboratorio e umani. Tuttavia, emergono difficoltà tecniche quando sono coinvolti mammiferi con cervello grande. Questo approccio affronta la variazione interspecie delle popolazioni neuronali in mammiferi molto diversi, producendo risultati comparabili da mappare per rivelare modelli evolutivi.

Un approccio comparativo per studi quantitativi di conteggio cellulare in cervelli di mammiferi molto diversi

Scopri la stereologia non distorta per stimare il numero di neuroni nel cervello dei primati non umani. Questo metodo fornisce conteggi cellulari accurati per studiare l'anatomia cerebrale in condizioni normali e patologiche.

Conoscere ciò che conta: stereologia Tutti nel settore non umano cervello dei primati

Esplora altri video