Name: Topo cellule epiteliali mammarie forma Mammospheres durante la differenziazione lattogenica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-06T16:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 51 s
Description: Scopri come indurre la differenziazione lattogenica nelle cellule epiteliali mammarie HC11 di topo, monitorando la formazione di mammospheres come marker fenotipico. Questo protocollo fornisce un modello in vitro affidabile per studiare la biologia della ghiandola mammaria.

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Diretto da fondi dal Congresso per la ricerca medica del Fondo di finanziamento (DAMD17-01-0264) di ML Cutler e United States Military Cancer Institute di ML Cutler sostenuto il lavoro.

<ol><li> Il HC11 cellule sono state coltivate a confluenza per 6 giorni in RPMI 1640 medium supplementato con 10% di siero di vitello fetale, insulina 5μg/ml, 10 HEPES mM, 10ng/ml fattore di crescita epidermico (EGF) per stabilire la competenza. </li><li> Le cellule sono state lavate con PBS e mantenuti in terreni di coltura senza FEG per 24 ore. </li><li> Per indurre la differenziazione lattogenica le cellule sono state incubate nei media differenziazione, cioè RPMI con desametasone (10 -6 M), l&#39;insulina (5 mg / ml) e prolattina (5 mg / ml) di cui il DIP. </li><li> A volte affermato post-DIP Inoltre, mammospheres sono stati fotografati ed enumerate mediante microscopia a contrasto di fase utilizzando un microscopio Olympus IX71 con fotocamera digitale. </li></ol> Rappresentante dei risultati: Ingrandimento di bassa potenza normale monostrati di cellule epiteliali mammarie e mammospheres multiple, così come ingrandimento ad alta potenza di una singola mammosphere sono mostrati in figura 1, rispettivamente. <img src="/files/ftp_upload/1265/1265fig1.jpg" alt="" /> Figura 1. Mammospheres. (A) normale monostrati di cellule epiteliali mammarie deve essere visualizzato come uno strato piatto di cellule confluenti. (B) Dopo 3-5 giorni di stimolazione DIP mammospheres più apparire. Fotografia scattata 5 giorni dopo DIP aggiunta. (C) ingrandimento superiore di un singolo campo contenente mammospheres a 5 giorni dopo DIP aggiunta.

<ol><li>Blatchford, D. R., Hendry, K. A., Turner, M. D., Burgoyne, R. D., Wilde, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vectorial+secretion+by+constitutive+and+regulated+secretory+pathways+in+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Epithelial+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vectorial secretion by constitutive and regulated secretory pathways in mammary epithelial cells.</a> Epithelial Cell Biol. 4, 8-16 (1995).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+induced+expression+of+connective+tissue+growth+factor+contributes+to+lactogenic+differentiation+of+mouse+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid induced expression of connective tissue growth factor contributes to lactogenic differentiation of mouse mammary epithelial cells.</a> J Cell Physiol. 214, 38-46 (2008).</li>
</ol>

Affinché questa tecnica per avere successo e di ottima qualità, le cellule epiteliali deve essere mantenuta a confluenza prima di essere indotto con gli ormoni lattogenica. Ci possono essere situazioni in cui ci sono mammospheres numerosi, il che rende difficile la quantificazione. Così, ai fini quantitativa è meglio fotografare la mammospheres in un punto momento in cui il numero di mammospheres è in grado di essere contati. Mentre ci sono diversi marcatori molecolari per determinare il gra...

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>21870076</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Quality Biological, Inc.</td><td>118089060</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera digitale</td><td>QImaging</td><td>Retiga 2000RV Fast 1394</td><td></td></tr></tbody></table>

topo cellule epiteliali mammarie forma mammospheres durante la differenziazione lattogenica

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

Una misura fenotipica comunemente usato per determinare il grado di differenziazione lattogenica nel topo colture di cellule epiteliali mammarie è la formazione di strutture cellulari a forma di cupola denominata mammospheres<sup&gt; 1</sup&gt;. Il HC11 linea cellulare è stata utilizzata come sistema modello per lo studio della regolazione della differenziazione mammaria lattogenica sia<em&gt; In vitro</em&gt; E<em&gt; In vivo</em<sup&gt; 2</sup&gt;. Il HC11 cellule si differenziano e sintetizzare proteine ​​del latte in risposta al trattamento con ormoni lattogenica. In seguito la crescita di HC11 topo cellule epiteliali mammarie di confluenza, differenziazione lattogenica è stata indotta con l&#39;aggiunta di una combinazione di ormoni lattogenica tra desametasone, insulina e prolattina, di cui il DIP. Il HC11 cellule indotte a differenziare sono stati fotografati a volte fino a 120 ore dopo l&#39;induzione della differenziazione e del numero di mammospheres che è apparso in ogni cultura era enumerato. Le dimensioni del mammospheres individuale si correla con il grado di differenziazione e questo è raffigurato nelle immagini delle cellule differenziazione.

HC11 differenziazione lattogenica può essere caratterizzata dalla formazione di strutture a cupola denominata mammospheres. Le strutture possono essere elencati mediante microscopia a contrasto di fase per aiutare a quantificare la differenziazione lattogenica.

Topo cellule epiteliali mammarie forma Mammospheres durante la differenziazione lattogenica

Una misura fenotipica comunemente utilizzata per determinare il grado di differenziazione lattogenica nelle colture di cellule epiteliali mammarie di topo è la formazione di ...

Ciao, sono Bethany Morrison del laboratorio della dottoressa Mary Lou Cutler del Dipartimento di Anatomia Patologica dell'Università delle Scienze Sanitarie dei Servizi Uniformati. Oggi vi mostreremo un procedimento per lo sviluppo di mammosfere a partire da cellule epiteliali mammarie di topo HC 11. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare la differenziazione lattogenica.Cominciamo. Per iniziare questo protocollo, le cellule HC 11 vengono coltivate fino a confluenza per sei giorni in mezzo RPMI 1640, integrato con 10% di siero fetale bovino, insulina a 5 microgrammi per millilitro, 10 micromolar di Heiss e 10 nanogrammi per millilitro di fattore di crescita epidermico (EGF), al fine di stabilire la competenza.Queste cellule sono state ampiamente utilizzate nei laboratori di Nancy Hines e Bernard Groner per studiare la regolazione della differenziazione genica all'interno della cappa a flusso laminare. Le cellule vengono quindi lavate con PBS e mantenute in un mezzo di crescita privo di EGF per 24 ore. Dopo questo periodo di incubazione, le cellule vengono incubate in un mezzo di differenziazione costituito da RPMI integrato con dexametasona, insulina e prolattina, al fine di indurre la differenziazione lattogena dopo l'incubazione.Nel mezzo di differenziazione, si utilizza un microscopio Olympus IX 71 dotato di una fotocamera digitale per fotografare e contare le sferoidi mammarie. Mediante microscopia a contrasto di fase, le sferoidi mammarie vengono fotografate e contate più volte nell'arco di 120 ore dopo l'induzione. Questa immagine mostra un ingrandimento a bassa potenza di una memoria normale.Le cellule del monostrato di cellule epiteliali devono essere mantenute a confluenza per circa tre giorni prima della stimolazione con ormoni genici. Ecco un'immagine di nuove sferoidi mammarie formate tre giorni dopo l'induzione, osservate con un ingrandimento a basso potere. Iniziano ad apparire come piccole strutture a cupola distribuite in modo casuale tra le cellule epiteliali.Di nuovo a basso ingrandimento. Ecco un'osservazione di molteplici mammosfere sviluppatesi cinque giorni dopo l'induzione. Le mammosfere sono continuate a crescere sia in dimensioni che in numero; a elevato ingrandimento, la caratteristica a bolla o a cupola della mammosfera può essere chiaramente visibile.Abbiamo appena mostrato come indurre le cellule epiteliali della memoria, affinché formino sferoidi mammari, utilizzati come marcatori della differenziazione genica. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di mantenere le cellule confluenti prima dell'induzione, poiché in questo periodo le cellule producono proteine della matrice con cui devono interagire per essere pienamente in grado di rispondere agli ormoni genici. È inoltre importante ricordare di rimuovere l'EGF dal mezzo prima del trattamento, poiché l'EGF inibirà il processo di differenziazione.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Biologia

Questo metodo viene illustrato come analizzare e valutare lo sviluppo della ghiandola mammaria e la funzione da topi. Escisse ghiandole mammarie sono valutati per il grado di sviluppo utilizzando montare tutto mentre emissione del latte viene valutata utilizzando un ossitocina a base di test contrazione delle cellule mioepiteliali.

Valutazione dello Sviluppo ghiandola mammaria e funzione in modelli murini

Un semplice metodo è descritto per analizzare gli effetti di fibroblasti su tessuti associati cellule epiteliali. La combinazione di questo metodo e tridimensionale coltura tissutale può facilitare l'analisi di cellule dopo l'isolamento da 3D. La tecnica è applicabile a celle di varia potenziale maligno, consentendo studio sistematico di effetti di tumore-associato stroma sulle cellule tumorali.

Isolamento di cellule epiteliali mammarie da tridimensionale Mixed-cell Spheroid Co-cultura

Questo video descrive l'isolamento delle cellule staminali tumorali dalle linee cellulari del cancro al seno. Coltiviamo queste cellule staminali tumorali per generare mammosfere primarie per valutare l'auto-rinnovamento e calcolare l'efficienza di formazione delle sfere, consentendo il confronto tra diverse densità di semina.

Generazione di mammosfere primarie: una tecnica per determinare la potenza cellulare

Coltura cellulare primaria utilizzando organoidi tessuto intatto fornisce un sistema modello che simula il microambiente multi-cellulare in vivo. Abbiamo sviluppato un primo modello di coltura di tessuti epitelio mammario senza siero che perpetua linee di colture cellulari miste e mostre differenziati morfologia, senza interruzione del tessuto enzimatico. Organoidi seno rimangono vitali per&gt; 6 mesi.

Non enzimatica, siero-libero Tissue Culture delle lesioni mammarie pre-invasive per la generazione spontanea di mammospheres

I test di mammosfera fluttuante possono studiare il sottogruppo di cellule di cancro al seno staminali che sopravvivono in condizioni di sospensione e mostrano una tumorigenesi migliorata quando impiantate nei topi.  Questo protocollo fornisce una comoda misura in vitro della capacità di formare sfere, un proxy per la tumorigenesi in vivo, facilitando al contempo l'analisi del panorama trascrizionale associato allo stelo.

Mammosphere saggio Formazione di Human Breast Cancer tessuti e linee cellulari

Il protocollo immunofluorescenza indiretta descritto in questo articolo consente il rilevamento e la localizzazione delle proteine ​​nella ghiandola mammaria del mouse. Un metodo completo è dato per la preparazione di campioni della ghiandola mammaria, per eseguire immunoistochimica, per l'immagine delle sezioni di tessuto al microscopio a fluorescenza, e di ricostruire le immagini.

Immunofluorescenza indiretta su sezioni congelate di mouse ghiandola mammaria

Questo protocollo descrive metodi per purificare, quantificare e caratterizzare vescicole extracellulari (EVs) / esosomi da cellule epiteliali mammarie non aderenti / mesenchimali e per usarle per trasferire la capacità di formazione delle ghiandole mammarie alle cellule epiteliali mammarie luminali. EVs / esosomi derivati ​​da cellule epiteliali mammarie simili a stelo possono trasferire questa proprietà cellulare alle cellule che ingeriscono gli EV / esosomi.

Trasferimento di abilità di formazione del ghiandale mammario tra le cellule epiteliali basali del mammifero e le cellule luminescenti mammarie attraverso le vescicole / esosomi extracellulari

Descriviamo tecniche per l'induzione della differenziazione di due linee epiteliali mammarie, HC11 ed EpH4. Mentre entrambi richiedono siero di vitello fetale, insulina e prolattina per produrre proteine del latte, le cellule EpH4 possono differenziarsi completamente in mammosfere in coltura tridimensionale. Questi modelli complementari sono utili per gli studi di trasduzione del segnale di differenziazione e neostrulasia.

Differenziazione delle cellule epiteliali del seno del topo HC11 e EpH4

Qui, descriviamo l'attuazione e l'interpretazione dei risultati di un saggio quantitativo di auto-rinnovamento della mammosfera in vitro.

Quantificazione dell'autorinnovamento nelle colture di Mammosfera Murine

La ghiandola mammaria è una struttura bistrato, che comprende cellule epiteliali mitraeliliali ed interne interne. Presentato è un protocollo per preparare gli organoidi utilizzando la prova differenziale. Questo metodo efficiente consente ai ricercatori di manipolare separatamente questi due tipi di cellule per esplorare le domande riguardanti i loro ruoli nella forma e nella funzione della ghiandola mammaria.

Generazione di organoidi mammari mosaici per provepsinizzazione differenziale

Questo protocollo descrive il metodo per impostare il saggio di formazione della mammosfera per studiare la radiografia tumorale indotta dall'inibitore dell'apoptosi 5 (Api5) nelle cellule epiteliali mammarie non tumariche. I lisati raccolti da mammosfere di generazione primaria vengono analizzati per diversi marcatori di stemino al fine di valutare l'induzione di proprietà simili a quelle delle cellule staminali.

Il saggio sulla mammosfera rivela la steminità indotta da Api5 in linee cellulari epiteliali mammarie non tumorigeniche

Scopri come indurre la differenziazione lattogenica nelle cellule epiteliali mammarie HC11 di topo, monitorando la formazione di mammospheres come marker fenotipico. Questo protocollo fornisce un modello in vitro affidabile per studiare la biologia della ghiandola mammaria.

Topo cellule epiteliali mammarie forma Mammospheres durante la differenziazione lattogenica

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