La preparazione standardizzata di Single-Cell Sospensioni da tessuto polmonare del mouse utilizzando il dissociatore gentleMACS

In questo protocollo video, vedrai come dissociare il tessuto polmonare del topo adulto usando un leggero max dopo la dissociazione del tessuto polmonare. In presenza di collagenasi d e DNA, le sospensioni cellulari di una vengono filtrate utilizzando una centrifuga filtrante cellulare da 70 micron e sospese per ulteriori applicazioni. Ciao, sono Melanie Mlu di Mil Biotech in Germania.

Oggi vi mostrerò una procedura riproducibile e automatizzata per la preparazione di una sospensione di una singola cellula da tessuto polmonare di topo utilizzando la dissociazione GenX. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per preparare sospensioni di singole cellule per la preparazione di leucociti o cellule endoteliali. Ok, iniziamo.

Prima di iniziare il protocollo, è necessario preparare e preparare alcune soluzioni standard. Innanzitutto, avremo bisogno del tampone di Hebes. In secondo luogo, una soluzione di collagenasi D contenente 100 milligrammi per millilitro di enzima e tampone hebes.

In terzo luogo, una soluzione di dase one contenente 20.000 unità per millilitro di dase one. Infine, due soluzioni di buffering comuni. Un tipico tampone PBS a pH 7,2 e un tampone PEB derivato dalla soluzione di risciacquo AutoMax e dalla soluzione madre BSA.

Iniziamo il nostro protocollo con un polmone sezionato derivato da un topo femmina di biopsia di sei o sette settimane. Assicurarsi che il polmone sia libero da organi adiacenti come il cuore e il timo, i vasi sanguigni efferenti e afferenti, la trachea e i tessuti connettivi. Sciacquare il tessuto in una capsula di Petri contenente PBS per rimuovere gli eritrociti.

In genere, un polmone di topo a questa età pesa tra i 110 e i 150 milligrammi. Se prevedi di associare polmoni di animali più anziani o altri ceppi di topi, pesa il tessuto e tampona. È possibile dissociare un massimo di 450 milligrammi di tessuto per una provetta.

Trasferire il tessuto polmonare in una provetta delicata max C caricata con 4,9 millilitri di tampone heis. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di collagenasi D a una concentrazione finale di due milligrammi per millilitro al tessuto polmonare e al tampone. Ora 10 microlitri dase.

Una soluzione per più di 150 milligrammi di tessuto. Aggiungere 20 microlitri di dase una soluzione. Assicurarsi che il tubo C sia ben chiuso e posizionarlo capovolto sul delicato max dis.

Assicurarsi che il tessuto si trovi tra il rotore e lo statore. Selezionare il programma polmonare ed eseguirlo premendo il pulsante di avvio al termine del programma. Rimuovere la provetta C dallo strumento e incubare il campione per 30 minuti.

In un'incubatrice a 37 gradi Celsius durante l'incubazione, la provetta deve essere ruotata utilizzando il rotatore per provette max mix o ruotata manualmente ogni cinque minuti. Dopo l'incubazione, rimettere la provetta C nell'associatore max delicato ed eseguire il secondo programma polmonare Mentre il programma è in corso, preparare una provetta da 50 millilitri per la raccolta delle cellule filtrate sostituendo il tappo con un filtro cellulare a maglie da 70 micrometri. Una volta terminato il programma dissociato, a seconda della distribuzione del materiale campione nella provetta, si consiglia di centrifugare brevemente la provetta per concentrare il materiale campione.

Le cellule dissociate possono essere rimosse dalla provetta mediante pipettaggio attraverso il tappo sigillato del setto della provetta C. Utilizzando un puntale per pipetta adatto da 1000 microlitri, la sospensione cellulare viene applicata al filtro cellulare per rimuovere particelle o aggregati più grandi. Una volta che la soluzione è stata drenata, lavare il filtro cellulare aggiungendo altri cinque millilitri di temperatura ambiente e tampone per pellettare le celle filtrate.

Centrifugare la provetta da 50 millilitri a 300 GS per 10 minuti. Ora aspirare il surnatante e risospendere il pellet di cella al volume di temperatura ambiente desiderato. Tampone PEB.

Non decantare il surnatante. A questo punto è possibile procedere all'applicazione a valle. La dissociazione del tessuto polmonare di topo utilizzando questa procedura produrrà un'alta percentuale di leucociti vitali e cellule endoteliali.

Le sospensioni a singola cellula derivate sono state colorate con CD 45 PE come CD 1 46 FITC o CD 31 FITC e analizzate mediante citometria a flusso. Questo grafico mostra l'arricchimento di cellule dendritiche utilizzando microsfere CD 11 C, un separatore minimax e due colonne MS. Ok. Vi ho appena mostrato come preparare sospensioni di singole cellule da tessuto polmonare di topo in modo standardizzato utilizzando la delicata dissociazione e i tubi C.

Questo metodo consente la dissociazione efficiente e genuina dei tessuti. Quando si esegue questa procedura, è importante sezionare correttamente il polmone ed elaborare il tessuto subito dopo la dissezione. Le sospensioni a cellula singola preparate possono quindi essere utilizzate per ulteriori esperimenti.

Ad esempio, la marcatura magnetica delle cellule e quindi la separazione dei leucociti o delle cellule endoteliali. Ok, questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.