Name: La preparazione standardizzata di Single-Cell Sospensioni da tessuto polmonare del mouse utilizzando il dissociatore gentleMACS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Impara a preparare sospensioni di cellule singole da tessuto polmonare di topo utilizzando il dissociatore gentleMACS con collagenasi D e DNase. Questo metodo standardizzato fornisce cellule vitali per studi su leucociti e cellule endoteliali.

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Gli autori sono dipendenti di Miltenyi Biotec GmbH, Germania.

Per lavorare in condizioni sterili, si raccomanda di eseguire tutti i passaggi in una cappa a flusso laminare. 1. Materiale <ol><li> HEPES tampone: 10 mm HEPES-NaOH pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl 2) </li><li> Collagenasi soluzione D: D Collagenasi: 100 mg / ml (Collagenasi D&gt; 0,15 U / mg), in HEPES tampone </li><li> DNasi I soluzione: 20.000 U / mL DNasi I </li><li> Tampone PBS a pH 7,2 </li><li> PEB buffer: 1 parte di soluzione stock BSA in 20 parti autoMACS soluzione di risciacquo </li><li> Tessuto: polmone derivati ​​da 6 / 7 settimana di vita adulto femmina BALB / C del mouse, privo di organi adiacenti. </li><li> Opzionale: microsfere CD11c, MACS Colonne MS, separatore MACS per l'isolamento di cellule dendritiche da polmone del mouse cella singola sospensione </li></ol> 2. Dissociare il tessuto polmonare <ol><li> Lavare il tessuto in una capsula di Petri contenente PBS per rimuovere eritrociti. </li><li> Trasferire un massimo di 450 mg di tessuto polmonare stecca gentleMACS C contenente 4,9 ml di tampone HEPES. </li><li> Aggiungere 100 ul soluzione Collagenasi D per una concentrazione finale di 2 mg / ml Collagenasi D. </li><li> Aggiungere 10 L DNasi soluzione che ho fino a 150 mg di tessuto (concentrazione finale di 40 U / ml DNasi I) o 20 l DNasi I per 150-450 mg di tessuto polmonare (concentrazione finale di 80 U / mL DNasi I). </li><li> Chiudere bene il tubo C e attaccarlo sul dissociatore gentleMACS. Quindi eseguire il programma "m_lung_01". </li><li> Incubare per 30 minuti a 37 ° C con rotazione automatica o manuale trasformando ogni 5 minuti. </li><li> Ritorno del campione al dissociatore gentleMACS ed eseguire il programma "m_lung_02". </li></ol> 3. Filtrazione <ol><li> Preparare una provetta da 50 ml per la raccolta di cellule filtrata sostituendo il tappo con un colino 70 celle mesh micron. </li><li> Una volta che il secondo programma gentleMACS si conclude, a seconda della distribuzione di materiale campione nel tubo, si può centrifugare la provetta brevemente per raccogliere il materiale del campione sul fondo della provetta. </li><li> Rimuovere le cellule attraverso il tappo sigillato setto della metropolitana C con una punta adatta 1000 microlitri pipetta e applicarli al filtro delle cellule. </li><li> Lavare il filtro delle cellule con 5 ml di tampone HEPES a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare le cellule a una pallina in un tubo da 50 ml a 300xg per 10 minuti. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet di cellule nel volume desiderato di tampone PEB. </li></ol> Parte 4: Risultati Rappresentante: <img src="/files/ftp_upload/1266/1266fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1. Polmone dissociazione con l'™ gentleMACS dissociatore portato a 92% cellule vitali. Le cellule morte sono state fluorescenti colorate con ioduro di propidio (PI) (dot plot a destra; dot plot a sinistra: nessuna colorazione PI). <img src="/files/ftp_upload/1266/1266fig2.jpg" alt="Figura 2"> Figura 2. Dissociazione del tessuto polmonare del mouse utilizzando i risultati dissociatore gentleMACS in un'alta percentuale di leucociti vitali e cellule endoteliali. Il derivato cella singola sospensioni sono state colorate con CD45-PE e CD146-CD31-FITC o FITC e analizzate mediante citometria a flusso. <img src="/files/ftp_upload/1266/1266figure2c.png" alt="Figura 2C"> Figura 3. Singola cellula sospensioni derivate da tessuti polmonari del mouse era macchiata di CD11c-FITC e anti-mPDCA-1-APC per rilevare il mouse CD11c bassa m-PDCA-1 + DC plasmacitoidi così come le cellule CD11c alto. <img src="/files/ftp_upload/1266/1266fig4.jpg" alt="Figura 4"> Figura 4. Arricchimento delle cellule dendritiche con microsfere CD11c, un separatore MiniMACS e due colonne MS.

<ol><li>Swanson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flt3-Ligand%2C+IL-4%2C+GM-CSF%2C+and+Adherence-Mediated+Isolation+of+Murine+Lung+Dendritic+Cells%3A+Assessment+of+Isolation+Technique+on+Phenotype+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function.</a> J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).</li>
<li>Vermaelen, K., Pauwels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+and+simple+discrimination+of+mouse+pulmonary+dendritic+cell+and+macrophage+populations+by+flow+cytometry%3A+Methodology+and+new+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights.</a> Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).</li>
</ol>

Gli autori sono dipendenti di Miltenyi Biotec GmbH, azienda che produce lo strumento utilizzato in questo articolo.

In questo video, si introduce un nuovo metodo per la dissociazione del tessuto polmonare mouse. Abbiamo dimostrato che una combinazione di trattamento meccanico ed enzimatica del tessuto polmonare ha prodotto un alta percentuale di leucociti vitali e cellule endoteliali. In particolare, la disintegrazione meccanica del tessuto è stato ottenuto il dissociatore gentleMACS. I tubi C gentleMACS includono un rotore - sistema dello statore, che il tessuto si dissocia in modo gentile. La procedura è controllata dalle impostazi...

<table><tbody><tr><td>C Tubi</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Ordine n. 130-093-237</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/it/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/it/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; Kit iniziale</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Ordine n. 130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/it/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/it/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACSmix&amp;#8482; Rotatore per provette</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Ordine n. 130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/it/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/it/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>autoMACS&amp;#8482; Soluzione di risciacquo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Ordine n. 130-091-222</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/it/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/it/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS&amp;#174; Soluzione madre di BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Ordine n. 130-091-376</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/it/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/it/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD11c MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>N. ordine 130-052-001</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/it/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/it/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD11c-FITC, CD11c-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Ordine n. 130-092-026130-091-830</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/it/PG_599_329_CD11c.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/it/PG_599_329_CD11c.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Anti-mPDCA-1-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Ordine n. 130-091-963</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/it/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/it/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD146-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Ordine n. 130-092-026</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/it/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/it/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD45-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Ordine n. 130-091-610</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/it/PG_599_331_CD45.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/it/PG_599_331_CD45.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Soluzione di ioduro di propidio</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Ordine n. 130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/it/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/it/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Punte per pipetta Art 1000 Reach</td><td>Molecular BioProducts</td><td>Ordine n. 2079</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61&quot;&gt;http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html&quot;&gt;http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

la preparazione standardizzata di single-cell sospensioni da tessuto polmonare del mouse utilizzando il dissociatore gentlemacs

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

La preparazione di singole cellule dai tessuti sospensioni è un presupposto importante per molti esperimenti nel campo della ricerca cellulare. Il processo di dissociazione organi interi richiede specifici parametri per ottenere un elevato numero di cellule vitali in modo riproducibile. Il dissociatore gentleMACS ottimizza questa operazione con un semplice protocollo pratico. Lo strumento contiene le impostazioni pre-programmate che sono ottimizzati per la dissociazione efficiente ma gentile di una varietà di tipi di tessuto, tra cui i polmoni del mouse. In questa pubblicazione l&#39;utilizzo del dissociatore gentleMACS sul tessuto polmonare derivati ​​da topi è dimostrata.

Dissociare cellule di tipi di tessuto specifico richiede parametri specifici per l&#39;agitazione dei tessuti per ottenere un elevato volume di vitali, cellule coltivabili. Il Miltenyi gentleMACS dissociatore ottimizza questa operazione con un semplice protocollo pratico. In questa pubblicazione l&#39;utilizzo di questo apparecchio sul tessuto polmonare viene spiegata.

La preparazione standardizzata di Single-Cell Sospensioni da tessuto polmonare del mouse utilizzando il dissociatore gentleMACS

La preparazione di sospensioni di singole cellule a partire da tessuti è un prerequisito fondamentale per molti esperimenti nella ricerca cellulare. Il processo di...

In questo protocollo video, vedrai come dissociare il tessuto polmonare di topo adulto utilizzando gentle max dopo la dissociazione del tessuto polmonare. In presenza di collagenasi D e DNAsi, le sospensioni cellulari vengono filtrate mediante un filtro cellulare da 70 micron e una centrifuga, quindi sospese per ulteriori applicazioni. Ciao, sono Melanie Mlu di Mil Biotech in Germania.Oggi vi mostrerò un procedimento riproducibile e automatizzato per la preparazione di una sospensione di singole cellule a partire da tessuto polmonare di topo, utilizzando la dissociazione GenX. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per preparare sospensioni di singole cellule destinate all'isolamento di leucociti o cellule endoteliali. Bene, cominciamo.Prima di iniziare il protocollo, è necessario preparare alcune soluzioni standard e tenerle pronte. In primo luogo, avremo bisogno del buffer di Hebes. In secondo luogo, una soluzione di collagenasi D contenente 100 milligrammi per millilitro di enzima e buffer di Hebes.Terzo, una soluzione di dase one contenente 20.000 unità per millilitro di dase one. Infine, due comuni soluzioni tampone. Un tipico tampone PBS a pH 7,2 e un tampone

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Questo video descrive un semplice, di risparmiare tempo tecnica per la dissociazione dei tessuti automatizzato mediante il dissociatore gentleMACS per preparare cella singola sospensioni di splenociti mouse.

Preparazione di Single-Cell Sospensioni da Spleen mouse con il dissociatore gentleMACS

Dissociare cellule di tipi di tessuto specifico richiede parametri specifici per aggitation tessuto per ottenere un elevato volume di vitali, cellule coltivabili. Il Miltenyi gentleMACS dissociatore ottimizza questa operazione con un semplice protocollo pratico. In questa pubblicazione l'utilizzo di questo apparecchio sul tessuto nerual è spiegato.

Generazione di Single-Cell Sospensioni dal tessuto neurale del mouse

In questo articolo dimostriamo l'isolamento di cellule staminali murine residente polmone mesenchimali (MSC polmone), la loro espansione, caratterizzazione e analisi delle proprietà immunomodulanti.

Isolamento e caratterizzazione di Hoechst Basso CD45 Negativo Mouse cellule staminali mesenchimali del polmone

Una preparazione altamente purificato di cellule dendritiche del polmone del mouse è descritto. Particolare enfasi è data l'isolamento delle tradizionali sottoinsieme delle cellule dendritiche.

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Questo lavoro descrive la standardizzazione di un metodo per ottenere le popolazioni di cellule germinali purificate dal tessuto testicolo di diverse specie di mammiferi. È un protocollo diretto che combina la dissociazione meccanica dei testicoli, la colorazione con Hoechst-33342 e il ioduro di propidium e l'ordinamento FACS, con ampie applicazioni in studi comparativi della biologia riproduttiva maschile.

Un approccio standardizzato per la depurazione multispecie di cellule germinali maschili di mammiferi mediante dissociazione tissutale meccanica e citometria del flusso

Questo studio presenta due tecniche sperimentali cruciali: la costruzione di un modello di ferita murina per valutare la chiusura della ferita e la preparazione di sospensioni unicellulari dalla pelle murina per preservare la vitalità cellulare.

Modelli di ferita nel topo e preparazione di sospensioni a cellula singola

Forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e l'identificazione di rare popolazioni di cellule T antigene-specifiche nei polmoni di topo attraverso l'arricchimento di cellule T basato su biglie magnetiche e i tetrameri peptide:complesso maggiore di istocompatibilità (MHC).

Identificazione di rare cellule T antigene-specifiche da polmoni di topo con tetrameri del complesso peptide:istocompatibilità maggiore

Questo protocollo descrive in dettaglio l'isolamento di popolazioni vive immunitarie e non immuni dal polmone di topo allo stato stazionario e in seguito all'infezione influenzale. Fornisce inoltre strategie di gating per l'identificazione di sottogruppi di cellule epiteliali e mieloidi.

Isolamento di popolazioni di cellule mieloidi ed epiteliali vive dal polmone di topo

Il protocollo descritto di seguito è un modo semplice ed efficace per isolare cellule contenenti retinoidi da popolazioni di cellule polmonari altamente eterogenee utilizzando l'autofluorescenza retinoide specifica e impiegando la selezione cellulare attivata da fluorescenza.

Isolamento di cellule polmonari contenenti retinoidi mediante smistamento cellulare

Questo protocollo presenta un metodo dettagliato per isolare sospensioni monocellulari di alta qualità sia da tessuto polmonare murino sano che da quello con tumori. Questo protocollo può essere applicato a scRNA-seq, analisi della citometria a flusso e isolamento cellulare primario.

Preparazione ottimizzata del tessuto polmonare intero portante di tumori murini per la citometria di flusso e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula

Impara a preparare sospensioni di cellule singole da tessuto polmonare di topo utilizzando il dissociatore gentleMACS con collagenasi D e DNase. Questo metodo standardizzato fornisce cellule vitali per studi su leucociti e cellule endoteliali.

La preparazione standardizzata di Single-Cell Sospensioni da tessuto polmonare del mouse utilizzando il dissociatore gentleMACS

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