Generazione di Single-Cell Sospensioni dal tessuto neurale del mouse
7 luglio 2009
Dissociare cellule di tipi di tessuto specifico richiede parametri specifici per aggitation tessuto per ottenere un elevato volume di vitali, cellule coltivabili. Il Miltenyi gentleMACS dissociatore ottimizza questa operazione con un semplice protocollo pratico. In questa pubblicazione l'utilizzo di questo apparecchio sul tessuto nerual è spiegato.
All'interno del sistema nervoso sono stati descritti centinaia di tipi cellulari neuronali e gliali. Ogni specifico tipo cellulare nel cervello o nel midollo spinale possiede un repertorio di molecole di superficie cellulare o determinanti molecolari attraverso i quali può essere identificato e caratterizzato.
Attualmente, tecnologie robuste di identificazione e separazione cellulare richiedono la generazione di preparati di singole cellule limitando al contempo la morte cellulare e la distruzione delle caratteristiche proteine di superficie. Il max associator delicato, quando utilizzato in combinazione con kit di dissociazione a base di tripsina o pepaini, può dissociare efficacemente e delicatamente il tessuto cerebrale preservando gli epitopi antigenici e minimizzando la perdita cellulare. Una volta ottenute, le sospensioni di singole cellule possono essere trattate con coniugati monoclonali come microbeads anti-prominent one, che identificano i progenitori neuronali, oppure ulteriormente purificate mediante l'uso di microbeads per la rimozione della mielina.
Ciao, mi chiamo Sandra PeNAT. Sono una responsabile di progetto per i prodotti di neuroscienze presso Mil Biotech qui a Bagge Gabert, Germania. Oggi vi mostrerò come preparare una sospensione di singole cellule a partire da tessuto cerebrale di topo utilizzando il dissociazione genix.
Il disassociatore genix è un dispositivo che può dissociare una varietà di tipi di tessuto in un ambiente sterile chiuso, eliminando così la necessità di una laboriosa dissociazione manuale meccanica. Cominciamo dunque. A seconda dell'epitopo dell'antigene di interesse nelle applicazioni successive, utilizzare il kit di dissociazione del tessuto nervoso a base di papaína o il kit di dissociazione del tessuto nervoso a base di tripsina.
Per l'esperimento di oggi, preferiamo il kit di dissociazione del tessuto nervoso P poiché desideriamo isolare cellule positive prominenti utilizzando microbeads anti prominent one. Prominent one non è sensibile né alla pepina né alla tripsina, e in tal caso il kit di dissociazione del tessuto nervoso P rappresenta la scelta migliore. Prima di iniziare il protocollo, è necessario preparare i reagenti e le soluzioni per questo kit.
Preparare in anticipo la propria soluzione madre di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) senza ioni calcio e ioni magnesio, HBSS con ioni calcio e magnesio e beta-mercaptoetanolo. Etanolo: iniziare preparando la soluzione due, la soluzione quattro e successivamente la miscela enzimatica uno. Per prima cosa, aggiungere beta-mercaptoetanolo alla soluzione due fino a una concentrazione finale di 0,067 millimolare.
La soluzione è ora stabile fino a un mese se conservata a quattro gradi Celsius. Successivamente, sciogliere la polvere liofilizzata e una soluzione etichettata in un flaconcino. Quattro. Utilizzare 0,7 millilitri di buffer di conservazione e mescolare delicatamente senza vortexare.
Ora preparare la miscela enzimatica uno pipettando 1900 microlitri della soluzione due e 50 microlitri della soluzione uno in un tubo C. Questa quantità è sufficiente per dissociare 400 milligrammi di tessuto; pertanto, se si intende dissociare una quantità maggiore, preparare ulteriore miscela enzimatica uno. Un massimo di 1600 milligrammi di tessuto cerebrale può essere processato in un tubo C.
Il mix enzimatico uno nel tubo C viene quindi incubato a 37 gradi Celsius per 10-15 minuti. Per iniziare la dissociazione, pipettare un millilitro di HBSS senza ioni calcio e magnesio nel tubo. Posizionare il tubo su una bilancia, aggiungere il tessuto cerebrale e registrarne la massa.
Questo cervello di topo P4 pesa circa 0,2 grammi. Un cervello adulto peserebbe circa 0,4 grammi; per tutti i campioni di tessuto inferiori a 400 milligrammi, i volumi di soluzione che utilizzeremo oggi sono adeguati.
Se il tessuto pesa più di 400 milligrammi, aumentare proporzionalmente tutti i volumi dei reagenti; in un singolo tubo C è possibile processare fino a 1600 milligrammi di tessuto. Trasferire il cervello del topo nel tubo C preparato contenente 1.950 microlitri di enzima preriscaldato. Mescolare una volta e chiudere saldamente il cappuccio.
Ora posizionare il tubo C sull'associatore Gen Max con il tappo rivolto verso il basso e assicurarsi che il tessuto si trovi nella zona dello statore. Selezionare il programma MCO brain O uno ed eseguire il programma. Questo è il primo dei tre programmi che verranno eseguiti sulla dissociazione; al termine del programma,
Rimuovere il tubo C e incubare il campione per 15 minuti a 37 gradi Celsius sotto rotazione lenta e continua. Utilizzando il rotatore per tubi max mix, la modalità di funzionamento del dispositivo corrisponde a quattro giri al minuto. Dopo la prima incubazione, riposizionare il tubo sulla dissociazione capovolto ed eseguire il programma M brain O2. Durante la successiva associazione, preparare 30 microlitri di mix enzimatico due per ogni 400 milligrammi di tessuto aggiungendo 20 microlitri della soluzione tre a 10 microlitri della soluzione quattro.
Quando il secondo ciclo di associazione è terminato, aggiungere 30 microlitri della miscela enzimatica due nel tubo C direttamente attraverso l'apertura sigillata con settimo al centro del cappuccio. Per garantire la sterilità, capovolgere delicatamente il tubo C per mescolare e non vortexare. Successivamente, riposizionare il tubo C sul rotatore per tubi max mix e incubare il campione per 10 minuti a 37 gradi Celsius con mescolamento a quattro giri al minuto.
Quindi l'unità CTU viene riposizionata sull'agitatore delicato max dis per la terza e ultima volta, e viene eseguito il programma M brain oh three. Al termine del terzo programma, posizionare i tubi C sul rotatore e incubare per altri 10 minuti a 37 gradi Celsius. A questo punto, centrifugare brevemente il campione per raccogliere le cellule sul fondo del tubo.
Ora siamo pronti a filtrare le cellule. Scegliere un setaccio per cellule in base alle dimensioni del tipo cellulare di interesse. Se le cellule da raccogliere hanno un diametro superiore a 30 micrometri, come le cellule kinji, la dimensione dei pori deve essere sufficientemente ampia da permettere il passaggio dei corpi cellulari di tale diametro.
Per cellule singole positive evidenti, funziona un filtro da 30 micrometri. Rimuovere il tessuto dissociato dal tubo C utilizzando punte di pipetta da 1000 microlitri che passano attraverso l'apertura sigillata da settimo nel tappo del tubo C. Applicare la sospensione cellulare sul filtro di pre-separazione posizionato su un tubo di raccolta da 15 millilitri.
Per campioni di dimensioni maggiori potrebbe essere necessario un tubo da 50 millilitri. Far passare la sospensione cellulare attraverso il filtro. Quindi lavare il filtro aggiungendo 10 millilitri di soluzione HBSS contenente ioni calcio e magnesio.
Quando si lavora con quantità di tessuto superiori a 400 milligrammi, utilizzare fino a 30 millilitri di HBSS contenente ioni calcio e magnesio per il lavaggio del filtro. Ora, centrifugare le cellule nel tubo di raccolta a 300 G per 10 minuti a temperatura ambiente, aspirare completamente il soprannatante e risospendere il pellet cellulare nel tampone o mezzo scelto. A questo punto, è possibile rimuovere eventuali detriti di mielina, poiché possono compromettere l'isolamento cellulare e la colorazione con anticorpi.
Per rimuovere i detriti di mielina, si consiglia l'uso di microsferette per la rimozione della mielina. In caso contrario, le cellule sono pronte per ulteriori applicazioni. Questo dot plot basato sulla colorazione con ioduro di propidio indica che il 97% delle cellule presenti in una sospensione di singole cellule ottenuta da topo domestico, simile alla sospensione generata in questo video, è vitale.
Queste cellule possono essere ulteriormente purificate utilizzando microbeads anti prominent per ottenere progenitori neuronali, che, quando coltivati in mezzo max neuro integrato con B 27 plus, possono formare neurosfere in questi grafici a punti. Si osserva il vantaggio del trattamento delle sospensioni con microbeads per la rimozione della mielina. Una percentuale significativamente più elevata di progenitori neuronali esprimenti prominent uno viene ottenuta mediante separazione max dopo l'eliminazione della mielina da una sospensione di singole cellule.
Vi ho appena mostrato come preparare una sospensione di singole cellule a partire dal tessuto cerebrale di topo utilizzando la dissociazione Genix e il kit per la dissociazione del tessuto nervoso. Durante questa procedura, è importante avere tutte le soluzioni preparate correttamente in base alla scelta appropriata del kit per la dissociazione del tessuto nervoso, T o P. Si prega di consultare la nota applicativa o la scheda tecnica del NDK. Utilizzando questo metodo, sezioni di tessuto di embrione o di giorno D, oppure l'intero cervello, possono essere processate in condizioni sterili in modo rapido e standardizzato.
Grazie per aver guardato e buona fortuna per i vostri esperimenti.
Panoramica
In questo articolo si discute l'uso dello strumento Miltenyi gentleMACS Dissociator per ottenere cellule vitali e coltivabili da tessuto nervoso. Il protocollo sottolinea l'importanza di specifici parametri di dissociazione per preservare la vitalità cellulare e le proteine di superficie.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Biologia Cellulare
- Tecniche di Dissociazione dei Tessuti
Sfondo
- I tipi cellulari neuronali e gliali nel sistema nervoso sono caratterizzati da molecole superficiali uniche.
- Le preparazioni di singole cellule sono essenziali per l'identificazione e la separazione accurata delle cellule.
- È fondamentale preservare la vitalità cellulare e le proteine di superficie durante la dissociazione.
- Il Dissociatore gentleMACS offre un ambiente chiuso e sterile per la dissociazione dei tessuti.
Scopo dello studio
- Dimostrare un protocollo efficace per la dissociazione del tessuto cerebrale murino.
- Evidenziare i vantaggi dell'utilizzo del Dissociatore gentleMACS nel preservare gli epitopi antigenici.
- Fornire una guida passo dopo passo per i ricercatori nel campo delle neuroscienze.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di miscele enzimatiche per la dissociazione dei tessuti.
- Utilizzo del Dissociatore gentleMACS per la dissociazione meccanica.
- Incubazione dei campioni di tessuto in condizioni controllate.
- Filtrazione delle cellule dissociate per isolare tipi cellulari specifici.
Risultati principali
- Il protocollo dissocia con successo il tessuto cerebrale del topo mantenendo la vitalità cellulare.
- Kit enzimatici specifici migliorano la conservazione delle proteine di superficie.
- Le sospensioni di singole cellule possono essere filtrate efficacemente per ulteriori analisi.
- Il Dissociatore gentleMACS semplifica il processo di dissociazione rispetto ai metodi manuali.
Conclusioni
- Il dissociatore gentleMACS è uno strumento prezioso per la ricerca in neuroscienze.
- Protocolli di dissociazione ottimizzati possono portare a un migliore recupero e caratterizzazione delle cellule.
- Applicazioni future potrebbero estendersi ad altri tipi di tessuto e aree di ricerca.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
La generazione standardizzata di sospensioni cellulari singole da tessuto neurale consente un'analisi affidabile dei marcatori di superficie cellulare e flussi di lavoro di purificazione successivi. Questo approccio supporta la validazione degli obiettivi mantenendo gli epitopi antigenici e riducendo al minimo la perdita cellulare, influenzando direttamente la riproducibilità dei saggi nei percorsi di scoperta. Il metodo fornisce una soluzione scalabile e a sistema chiuso per preparare popolazioni cellulari neurali rilevanti per la malattia, finalizzate all'interrogazione di target terapeutici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche preservando le molecole della superficie cellulare fondamentali per l'identificazione del bersaglio.
- Valore operativo: Riduce l'ambiguità meccanicistica mantenendo le proteine di superficie caratteristiche durante la dissociazione.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio generando sospensioni monocellulari vitali adatte a saggi di validazione funzionale.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per applicazioni successive come l'etichettatura con coniugati monoclonali e la separazione basata su microsferette.
- Valore operativo: Garantisce la standardizzazione dei saggi attraverso programmi preset di gentleMACS e la preparazione standardizzata della C Tube.
- Valore di scalabilità: Permette una valutazione affidabile di composti grazie a un'uscita consistente di sospensioni cellulari singole, indipendentemente dalla quantità di tessuto fino a 1600 mg.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore traslazionale: Mantiene la rilevanza per la patologia generando sospensioni da tessuto nervoso murino adatte all'isolamento di cellule progenitrici.
- Valore di continuità: Supporta l'allineamento traslazionale dei biomarcatori attraverso la conservazione di marcatori di superficie come Prominin-1 per l'identificazione dei progenitori neuronali.
- Avanzamento con valutazione del rischio: Facilita la continuità preclinica consentendo la rimozione dei detriti mielinici per migliorare l'efficienza di purificazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dal test iniziale dell'ipotesi sul bersaglio fino all'identificazione del composto guida, fornendo preparazioni standardizzate di cellule neurali per applicazioni a valle.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la generazione di sospensioni vitali che mantengono i determinanti molecolari sulla superficie cellulare.
- Screening: Garantisce la prontezza per i saggi attraverso passaggi riproducibili di dissociazione e filtrazione, compatibili con la separazione basata su filtri cellulari.
- Analisi: Permette misurazioni quantitative mediante sospensioni monocellulari compatibili con la citometria a flusso, per l’analisi della vitalità e dell’espressione dei marcatori.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta al lavoro preclinico preservando marcatori di superficie come Prominin-1 per l’arricchimento di progenitori neuronali.
- Riutilizzo aziendale: Offre una capacità riutilizzabile per l’elaborazione di tessuti neurali su campioni embrionali, postnatali e adulti in condizioni sterili.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva grazie al mantenimento degli epitopi antigenici e all'elevata vitalità cellulare (97% come dimostrato).
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante programmi di dissociazione preimpostati e selezione di kit specifici per il reagente (P o T).
- Valore strategico: Decisioni più accurate su prosecuzione o interruzione del progetto grazie all'isolamento affidabile di progenitori neurali mediante MicroBeads anti-Prominin-1 dopo la rimozione della mielina.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione corretta in base al rischio grazie a un processo scalabile di sezioni di tessuto nervoso o di cervello intero in ambienti chiusi e sterili.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nella manipolazione dei tessuti neurali e nella selezione del kit di dissociazione in base alla sensibilità dell'epitopo bersaglio.
- Necessita del Dissociatore gentleMACS, delle C Tubes e dei kit di dissociazione per tessuto nervoso appropriati (a base di papaína o tripsina).
- Impone la standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro nella preparazione delle soluzioni (varianti di HBSS, miscele enzimatiche) e nei protocolli di incubazione.
- Comporta considerazioni di adattamento per quantità di tessuto superiori a 400 mg, richiedendo una scala di aumento dei reagenti fino ai limiti di 1600 mg.
- Include limitazioni pratiche, come la necessità di utilizzare microsfera per la rimozione della mielina al fine di migliorare il rendimento di purificazione delle popolazioni bersaglio.
