Name: Accoppiamento e di separazione Tetrade Chlamydomonas reinhardtii Per lanalisi genetica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Scopri i metodi per gametogenesi, accoppiamento e dissezione di tetradi in Chlamydomonas reinhardtii. Questi protocolli facilitano l'analisi genetica per ricercatori che studiano questo organismo modello.

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Questo protocollo si basa su tecniche apprese nel laboratorio di Francesco-André Wollman presso l&#39;Institut de Biologie fisico-Chimique, Parigi, Francia. Gli autori hanno un debito di gratitudine a Jacqueline Girard-Bascou, che ha originariamente introdotto DBS alle tecniche di Chlamydomonas genetica. Chlamydomonas di ricerca in laboratorio degli autori &#39;è supportato da premio della National Science Foundation MCB-0646350.

Parte 1: Preparazione dei ceppi per gametogenesi Nota: Tutte le manipolazioni devono essere effettuate a temperatura ambiente. Temperature maggiori e minori influenzerà la velocità di germinazione zigote e può influenzare negativamente la vitalità. Considerazione importante: è essenziale che i ceppi di essere accoppiati sono in crescita robusta e sono privi di contaminanti funghi o batteri. Se le tensioni non sono stati trasferiti regolarmente, passaggio in terreno ricco deve precedere la generazione dei gameti. <ol><li> I ceppi di essere accoppiati vengono trasferite su piastre TAP (100 × 15 mm), 1-2 ceppi per piastra. Le cellule devono essere coltivate in una striscia di concentrato di circa 1 cm di larghezza. </li><li> L&#39;incubazione sulle piastre TAP dovrebbe continuare fino a quando una spessa coltre di robusta crescita delle cellule è presente, con i trasferimenti intermedi, se necessario. I ceppi che non sono stati diversi passaggi di recente può richiedere un passaggio e un totale di 1 settimana, mentre i ceppi wild-type in uso regolare può essere effettuato solo pochi giorni e senza passaggi. Mutanti che sono sensibili alla luce può richiedere più tempo. </li><li> Trasferire tutte le cellule dalle piastre TAP per piatti N10, che sono carenti di azoto e inizierà a indurre gametogenesi. Trasferire le cellule come una lastra di spessore, tanto quanto erano presenti sulla piastra TAP. Questo faciliterà la successiva raccolta delle cellule. Dopo 3 giorni di N10, le cellule sono disposti a sottoporsi ad gametogenesi. La divisione cellulare sarà lenta su N10, tuttavia le cellule deve rimanere verde scuro. Qualsiasi ceppi contaminati deve essere scartato come zigoti vitali non si otterrà. </li></ol> Parte 2: accoppiamento <ol><li> Ogni sforzo è trasferito in un beuta da ml 50 e risospeso in circa 2,5 ml di acqua distillata sterile. Questo può essere fatto sia utilizzando un ciclo filo o un bastone sterile, ciò che è importante è che le cellule sono ben sospesa e non in gruppi. Il volume esatto di acqua dovrebbe essere regolato in modo che la concentrazione delle cellule, come misurato ad occhio, è circa lo stesso per ogni ceppo. </li><li> Le cellule sono agitato di una forte luce (E 1,260 μ / m 2 / sec) per 2 ore, durante le quali le cellule diventeranno gameti mobili. Motilità devono essere controllati al microscopio ottico. Se i gameti sono il nuoto male, l&#39;accoppiamento rischia di essere inefficiente. Tuttavia, anche mal ceppi mobili si accoppia una frequenza ridotta. </li><li> Successivamente, volumi uguali di mt + e mt-gameti sono combinati in un unico pallone da ml 50. Gameti sono lasciati di una forte luce (E 1,260 μ / m 2 / sec) senza mescolare. </li><li> L&#39;accoppiamento può essere controllato immediatamente sotto al microscopio ottico. Coppie di gameti forma rapidamente, e appariranno come le cellule in rapido movimento unito al flagelli. Se l&#39;accoppiamento risulta essere estremamente rapido, i campioni devono essere presa entro h 30 min -1 per la generazione di zigoti. In caso contrario, l&#39;accoppiamento può essere controllata ogni ora, anche se questo è opzionale. Fin dai tempi dando la densità ottimale di zigoti varia notevolmente tra croci, è meglio prendere aliquote della miscela di accoppiamento in tempi diversi, dopo che combina gameti, ad esempio dopo 1 ora, 2 ore, 3 ore e 4 ore. Questo viene fatto con il trasferimento di 300 campioni microlitri di TAP-3% agar difco 60 × 15 tavole mm; punti 3-4 per piastra. Fare attenzione a non agitare la miscela di accoppiamento in quanto ciò potrebbe compromettere le coppie di accoppiamento. Agar Difco viene utilizzato perché ha un minor numero di contaminanti di agar a basso prezzo, e sarà più facile vedere zigoti sotto il microscopio. La miscela di accoppiamento non utilizzati possono essere lasciati nel pallone durante la notte, e la qualità della reazione di accoppiamento sarà evidente il giorno successivo. Quando l&#39;accoppiamento è efficiente, gli zigoti aderirà alla parete o al fondo del pallone ed il mezzo apparirà chiaro. Anche l&#39;agitazione del pallone non riuscirà a rimuovere gli zigoti. Se attacca niente al vetro quando la miscela viene agitata con forza ragionevole, allora l&#39;accoppiamento era inefficiente o non ha luogo. </li><li> Il TAP-difco piastre contenenti miscela di accoppiamento vengono essiccati in una cappa sterile, con le palpebre socchiuse, finchè tutto il liquido di superficie è stata assorbita. Le piastre sono in genere lasciati alla luce (700 NE / m 2 / sec) per 18 ore, poi avvolto in un foglio, dal momento che la maturazione zygospore avverrà solo al buio. I ceppi incrociati, l&#39;accoppiamento ora e la data sono scritti su entrambi i piatti e la pellicola. Le piastre sono memorizzati 5 a 7 giorni e può essere conservato più a lungo, anche se l&#39;efficienza germinazione zigote diminuisce progressivamente. </li></ol> Parte 3: Dissection Tetrade <ol><li> Cellule vegetative dovrebbe essere raschiata macchie secche di miscela di accoppiamento con una lama poco affilata come un bisturi. La lama può essere utilizzata per esporre una superficie di zigoti, che si atterrà strettamente al agar 3%. Questo passo è di solito fatto nel pomeriggio, in modo che gli zigoti sono germinati dalla mattina successiva, ma non hanno subito un secondo, divisione vegetativo cherendimento dell&#39;8 progenie. Chlamydomonas biologi imparano rapidamente a riconoscere zigoti sotto il microscopio, dal momento che sono più grandi delle cellule vegetative, e dispongono di uno spesso muro zygospore che dà un contorno nero. Zygospores spesso di colore giallo, ma può anche essere un po &#39;verde. Il personaggio più importante è che si attaccano di agar-agar, mentre le cellule vegetative sono facilmente spostati da parte. Tuttavia, se i piatti sono troppo secco questo non sarà il caso. Inoltre, se la miscela di accoppiamento era troppo denso, zigoti possono formare un tappeto che renderà il trasferimento di zigoti singoli difficile o impossibile. Densità appropriati sono stabiliti al punto 2.1, e sarà presto imparato con l&#39;esperienza. </li><li> Aghi di vetro sono preparati per la raccolta e la separazione zigoti progenie tetrade. Questi sono preparati tirando 3 canne di vetro mm in una piccola fiamma di generare un lungo filo sottile, che può essere interrotta. Le punte di questi fini conici vengono smussate o piegati in ganci, da riscaldamento breve in una fiamma bassa (ad esempio alcol o un fiammifero). Preparare 3 o più aghi di vetro, dal momento che si rompono abbastanza facilmente, soprattutto per gli utenti meno esperti. </li><li> Zigoti sono riuniti il ​​3% TAP-difco placca utilizzando un ago di vetro in un mucchio di piccole dimensioni. Un quadrato di agar (fino a 0,5 cm 2) che contiene il zigoti è formato e asportato con un bisturi noioso. Poi, il blocco agar è posto a faccia in giù su un 15 mm 1,5% TAP-Difco piatto, e scivolò lungo una linea orizzontale di circa 1,5 cm dal bordo superiore della piastra, per distribuire gli zigoti. La linea orizzontale superiore e una griglia con circa 1,5 cm ai lati e 0,5 cm Distanza verticale sono incisi sul retro delle lastre. La griglia sarà utilizzato il giorno seguente come guida per separare la progenie tetrade (la griglia può anche essere inciso il giorno della dissezione). Infine, zigoti singoli passare alle intersezioni delle linee orizzontale superiore con ogni linea verticale, con circa 20-30 zigoti per piastra. Anche se solo 12 o giù di lì sarà sezionato, non ogni zigote germina, e alcuni si dividono due volte prima di scoppiare, zigoti così supplementari sono necessari. </li><li> Dopo aver distribuito il zigoti, e le cellule vegetative che sono stati accidentalmente trasferito dalla piastra di agar 3% vengono uccisi esponendo la piastra capovolta per 30 secondi su un piatto di vetro contenente una sottile (1-2 mm) strato di cloroformio. La distanza tra la piastra ed il cloroformio dovrebbero essere di circa 5 cm. Se cloroformio viene usato troppo, o se la distanza è troppo piccolo o grande, si rischia di uccidere sia gli zigoti, o non uccidere le cellule vegetative. Il trattamento cloroformio deve essere fatta subito dopo la zygospores sono stati distribuiti sul piatto germinazione, per garantire la selettività. </li><li> La germinazione dura 16-20 ore per la maggior parte dei ceppi, ma varia a seconda del genotipo e con l&#39;età degli zigoti. Per la germinazione, le piastre sono posti sotto condizioni di scarsa luminosità (239 NE / m 2 / sec), o alla luce grigio medio, coprendo il piatto con un fazzoletto. </li><li> Zigoti germinato possono essere identificati al microscopio le cellule gonfie o, a volte scoppio con cellule figlie al loro interno. Se il zygospore non è rotto, sfiorando con un ago di vetro si rompe il muro se germinazione si è verificato. Cellule figlie vengono delicatamente trascinato i punti di griglia sottostante lo zigote. E &#39;più facile per fare questo catturando la cella in una piccola quantità di liquido rilasciato dal agar dalla pressione del ago di vetro, e trascinando questa &quot;pozzanghera&quot; dietro l&#39;ago. Una forma di &quot;assicurazione&quot; che si ha sezionato uno zigote e non una cellula vegetativa che ha diviso due volte, è che oltre alle cellule figlie quattro, la &quot;pelle&quot; del muro zygospore rimarrà. </li><li> La progenie sezionato vengono coltivate in condizioni appropriate fino clonies visibili possono essere raccolti per successive analisi. Piastre devono essere monitorati ogni giorno per contaminazione. </li></ol> Nota: Generazione di diploidi vegetativo non è coperto qui, ma coinvolge essenzialmente placcatura la miscela di accoppiamento a medio che non sosterrà la crescita di entrambi ceppo parentale, ma sosterrà la crescita del diploide (ad esempio due auxotropic marcatori diversi). Le piastre sono tenuti in luce per evitare la formazione di zigoti.

<ol><li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chlamydomonas+Sourcebook%3A+Introduction+to+Chlamydomonas+and+Its+Laboratory+Use%5BTitle%5D)+AND+%22Conf+Proc+IEEE+Eng+Med+Biol+Soc%22%5BJournal%5D)">The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2nd Edition, Academic Press. San Diego, CA. Volume 1 119-273 (2005).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

L&#39;analisi genetica è semplice in Chlamydomonas, ma richiede particolari tecniche per generare gameti e progenie tetrade separati. Con ceppi sani, le tecniche sono facilmente acquisite. Con alcuni ceppi mutanti, diventa più un&#39;arte, e si rimanda Volume 1 del Sourcebook, recentemente pubblicato Chlamydomonas per le note storiche e consigli pratici. Inoltre, va notato che ci sono molte variazioni sul tema di base sopra descritte, che vanno dal metodo per indurre gametogenesi, per il model...

<table><tbody><tr><td>CC-125</td><td>Stirpe di tipo di accoppiamento &lt;em&gt;plus&lt;/em&gt;</td><td>Chlamydomonas Stock Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CC-124</td><td>Stirpe di tipo di accoppiamento &lt;em&gt;minus&lt;/em&gt;</td><td>Chlamydomonas Stock Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-Acetate-Phosphate (TAP)</td><td>Mezzo di crescita</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N10</td><td>Mezzo di crescita</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Difco agar</td><td>Reagente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Stainless-Steel Blades</td><td>Strumenti</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-916-5B</td><td></td></tr><tr><td>BD Surgical Blade Handles</td><td>Strumenti</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-914-5</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Metal Scalpels</td><td>Strumenti</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-920A</td><td></td></tr></tbody></table>

accoppiamento e di separazione tetrade chlamydomonas reinhardtii per l&#39;analisi genetica

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

L&#39;alga verde unicellulare<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em&gt; (<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;) È diventato un organismo popolare per la ricerca in diverse aree della biologia cellulare e della genetica a causa del suo ciclo di vita semplice, la facilità di crescita e di manipolazione per l&#39;analisi genetica, risorse genomiche e trasformabilità del nucleo e due organelli. Ceppi di accoppiamento è una pratica comune quando approcci genetici sono usati in<em&gt; Chlamydomonass</em&gt;, Per creare diploidi vegetativo per l&#39;analisi di posizione dominante, o in seguito a dissezione tetrade di accertare l&#39;eredità nucleare vs organelli, per testare allelism, per analizzare epistasy, o per generare popolazioni allo scopo di carta a base di clonazione. Inoltre, incroci genetici sono abitualmente utilizzati per combinare genotipi organelli con particolari genotipi nucleari. Qui mostriamo metodi standard per gametogenesi, l&#39;accoppiamento, la germinazione dello zigote e separazione tetrade. Questo protocollo consiste in un facile da seguire serie di passi che renderanno approcci genetici suscettibili di scienziati che hanno meno familiarità con<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;. Parametri chiave e punti problematici sono spiegato. Infine, le risorse per ulteriori informazioni e metodi alternativi sono forniti.

L&#39;accoppiamento e separazione tetrade sono necessari per l&#39;analisi genetica in<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em&gt;. Qui mostriamo metodi standard per gametogenesi, l&#39;accoppiamento, la germinazione zigote e dissezione tetrade. Questo protocollo consiste in un facile da seguire serie di passi che renderanno approcci genetici suscettibili di scienziati che hanno meno familiarità con<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;.

Accoppiamento e di separazione Tetrade Chlamydomonas reinhardtii Per l&#39;analisi genetica

L'alga verde unicellulare Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) è diventata un organismo ampiamente utilizzato per la ricerca in diversi ambiti della biologia cellulare e...

Chlamydomonas è un'alga verde unicellulare che si divide asessualmente in condizioni ottimali di crescita. Quando le condizioni peggiorano, l'organismo entra in un ciclo di riproduzione sessuale. La gametogenesi può essere indotta trasferendo ceppi da TAP auger a un mezzo privo di azoto, e 10 auger di cellule vengono risospesi e agitati sotto luce intensa per generare gameti MT più e MT meno, che vengono quindi combinati in un unico flacone per l'accoppiamento; i campioni vengono poi depositati su una piastra TAP auger esposta alla luce e successivamente avvolti nella stagnola per la maturazione zigotica.Dopo cinque a sette giorni, le cellule vegetative vengono raschiate via, esponendo i zigoti, che aderiscono saldamente all'elica. Questi vengono trasferiti su piastre TAP DCO per la germinazione. Sotto luce fioca, i tetradi vengono quindi separati e coltivati in condizioni appropriate.Finché non compaiono colonie visibili, queste possono essere selezionate per analisi successive. Ciao, sono David Stern, presidente del Boyce Thompson Institute for Plant Research. Oggi vi mostreremo le procedure di accoppiamento e dissezione delle tetradi per l'alga verde modello Chlamydomonas reinhardtii.Molti laboratori utilizzano queste tecniche per creare diploidi vegetativi al fine di analizzare la dominanza o dopo la dissezione delle spore per determinare l'eredità nucleare rispetto a quella degli organelli. Per testare alm, analizzare l'epistasi o generare popolazioni ai fini del clonaggio basato sulla mappatura. Inoltre, gli incroci genetici vengono comunemente impiegati per combinare genotipi di organelli con specifici genotipi nucleari.Vorrei presentarvi il mio collaboratore postdottorato Jan, che vi illustrerà nei dettagli le procedure. Cominciamo dunque. Per iniziare l'esperimento, trasferite i ceppi MT più e MT meno su piastre di tris acetato fosfato o piastre TAP. Fate crescere le cellule in una striscia concentrata larga un centimetro.Per le talee più vecchie potrebbe essere necessario un trasferimento intermedio. Una volta comparsa una strato spesso di cellule in crescita, trasferire le cellule sotto forma di una massa compatta in 10 piastre N. Queste piastre sono carenti di azoto.Per indurre la gametogenesi, incubare le cellule per tre giorni. Dopo tre giorni, verificare che le cellule appaiano ancora di un verde scuro ed eliminare ceppi contaminati. Poiché non produrranno zigoti vitali, i ceppi rimanenti sono ora pronti per subire la gametogenesi.Ora che la gametogenesi è stata indotta, iniziare l'accoppiamento preparando due beute da 50 millilitri, ciascuna contenente 2,5 millilitri di acqua distillata sterile. Utilizzando un’ansa di platino, trasferire ciascun ceppo in una beuta separata e risospendere nell'acqua.Assicurarsi che non ci siano grumi. Valutare la concentrazione cellulare ad occhio. Aggiungere acqua per ottenere concentrazioni cellulari uguali.Successivamente, agitare le cellule per due ore sotto una luce intensa in modo che si formino i gameti modal. Verificare la motilità al microscopio ottico. Ricordare che anche ceppi con scarsa formazione di gameti modal possono accoppiarsi.In un altro becher da 50 millilitri, combinare volumi uguali di ceppi vuoti positivi e vuoti negativi per consentire l'accoppiamento. Lasciare i gats sotto una luce intensa, ma non agitare; verificare immediatamente l'accoppiamento al microscopio ottico.Cercare coppie di gameti in rapido movimento. Unite ai flagelli, avendo cura di non agitare la miscela e di non disturbare le coppie in accoppiamento. Prelevare un campione di 300 microlitri ogni ora per le successive quattro ore e depositarlo su una piastra in agar TAP.Lasciare la miscela di accoppiamento non utilizzata nel matraccio fino al giorno successivo. Far asciugare le piastre TAP con l'auger in cappa sterile con i coperchi Aja fino a quando non rimane alcun liquido in superficie. Successivamente, lasciare le piastre alla luce per 18 ore.Avvolgere le piastre nella pellicola poiché la maturazione delle spore CIGA avviene solo al buio e conservare le piastre per una settimana. Infine, agitare il matraccio contenente la miscela di accoppiamento rimanente. Se il mezzo appare limpido, significa che i zigoti sono rimasti attaccati alla superficie del matraccio, indicando un accoppiamento efficiente.Se l'agitazione causa il distacco, l'accoppiamento dei zigoti è stato inefficiente o è fallito durante la settimana successiva, le spore zago si formeranno sulle piastre e i tetra saranno pronti per la dissezione. Dopo cinque giorni, i zigoti accoppiati avranno formato spore zago. Pertanto, la dissezione dei tetra può iniziare utilizzando un bisturi smussato.Staccare le cellule vegetative, esponendo i zigoti che aderiscono saldamente alla coclea. Osservare al microscopio per distinguere i zigoti dalle cellule vegetative. I zigoti sono più grandi, generalmente gialli e presentano un contorno nero.Successivamente, preparare aghi di vetro per la manipolazione delle cellule. Tirare delle bacchette di vetro di tre millimetri con una fiamma ad alcol per generare un sottile filamento lungo. Spezzare il filamento lungo.Riscaldare brevemente l'incavo conico del filamento di vetro per piegarlo a forma di gancio. Utilizzare ora l'ago di vetro per raccogliere i zigoti in un piccolo mucchio sulla piastra di agar TAP. Formare un quadrato di agar contenente i zigoti ed escinderlo utilizzando un bisturi prima di trasferire i zigoti.Per dissezionare le tetradi, segnare la parte inferiore di una piastra in agar al 1,5% TAP. Tracciare una linea orizzontale a 1,5 centimetri dal bordo superiore della piastra. Inoltre, disegnare una griglia con spaziatura orizzontale di circa 1,5 centimetri e verticale di 0,5 centimetri.Quindi posizionare il blocco dell'elica capovolto sulla linea orizzontale superiore tracciata sulla piastra dell'elica 1,5%TAP. Far scorrere il blocco dell'elica lungo la linea orizzontale superiore per distribuire gli zigoti. Infine, spostare singoli zigoti alle intersezioni tra le linee orizzontali superiori e ciascuna linea verticale, ottenendo circa 20-30 zigoti per piastra.Immediatamente dopo aver distribuito gli zigoti, capovolgere le piastre per 30 secondi su un piatto di vetro contenente uno strato sottile di cloroformio. Assicurarsi che la distanza tra la piastra e il cloroformio sia di cinque centimetri e non utilizzare troppo cloroformio.Questo trattamento eliminerà qualsiasi cellula vegetativa trasferita accidentalmente. Posizionare le piastre in condizioni di luce tenue per 16 ore per consentire la germinazione. Il passaggio successivo sarà la dissezione dei tetradi.Ora che l'incubazione delle cellule è terminata, cercare zigoti germinati. Si tratta di cellule ingrossate che a volte si sono rotte, con cellule figlie al loro interno. Se la germinazione è avvenuta ma la spora zigo non si è ancora rotta, toccarla delicatamente con un ago di vetro per rompere la parete.Ora inizia a separare le tetradi. Premi l'elica accanto alle cellule figlie con l'ago di vetro. Le cellule figlie vengono raccolte nel liquido rilasciato.Trascinare le cellule figlie nella pozza dietro l'ago fino ai punti della griglia situati al di sotto dello zigote. Ora che il tetra è separato, cercare un involucro residuo rimanente. Dopo aver rimosso le cellule figlie per verificare che sia stato dissezionato uno zigote e non una cellula vegetativa che si è divisa due volte, coltivare la progenie dissezionata fino a quando saranno visibili colonie che potranno essere isolate per analisi successive.Monitorare le piastre quotidianamente per verificare la contaminazione. Quando il protocollo viene eseguito correttamente, i quattro progenitori ottenuti dalla dissezione di ciascun zigote si sviluppano in clone visibili. Due dei progenitori sono vuoti più e due sono vuoti meno; tutti i progenitori ereditano il DNA del cloroplasto del genitore MT più.Abbiamo appena illustrato i metodi standard per la gametogenesi, l'accoppiamento, la germinazione delle zigoti e la dissezione delle trappole per clam dms. Quando si utilizzano queste tecniche, è importante assicurarsi che le cellule siano sane e prive di infezioni. È noto che ceppi adattati in laboratorio, che non sono stati incrociati per lunghi periodi, potrebbero accoppiarsi male e la qualità dell'acqua potrebbe influenzare anche la mutagenesi am.Prestando attenzione a questi dettagli e ad altri dettagli tecnici menzionati in precedenza, dovreste ottenere ottimi risultati con la genetica del vostro climbing demon. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Scopri i metodi per gametogenesi, accoppiamento e dissezione di tetradi in Chlamydomonas reinhardtii. Questi protocolli facilitano l'analisi genetica per ricercatori che studiano questo organismo modello.

Accoppiamento e di separazione Tetrade Chlamydomonas reinhardtii Per l'analisi genetica

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