Name: Isolamento del pancreas umano Islet: Parte II: La purificazione e la cultura di isole umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Scopri la purificazione e la coltura di isole pancreatiche umane mediante gradiente Ficoll per trapianti clinici. Questo metodo automatizzato garantisce isole di alta qualità per il trattamento del diabete.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Supportato da fondazione presso la University of Illinois a Chicago, nonché delle cellule insulari Resource Center NIH di sovvenzione (RFA-RR 05-003), la Fondazione Cristoforo, la Fondazione Efroymson, e la Fondazione Tellabs.

1. Purificazione di isolotti <ol><li> Per avviare la procedura di purificazione isolotto, caricare la borsa COBE, morsetto tutti i tubi, tranne il tubo verde, e impostare la velocità di 1.500 e il super fuori a 0. </li><li> Nel cofano impostare la pompa e bicchieri gradiente e collegare il tubo di raccolta al tubo verde. </li><li> Ora il caricamento del Ficoll 1,100 può iniziare: spingere &quot;spin&quot;, quindi aggiungere 110 ml di Ficoll 1,100 al bicchiere davanti, e avviare la pompa per caricare il sacchetto COBE. Mentre il Ficoll è caricato, premere super-out, fermare la pompa, sbloccaggio la testa della pompa e impostare la super velocità verso 100. </li><li> Quando il Ficoll raggiunge il bicchiere e tutta l&#39;aria viene espulsa dai, tubi ri-clamp a testa della pompa. Impostare la velocità di rotazione a 3.000, e la velocità fuori super 0. </li><li> Ora si preparano a caricare le pendenze versando il gradiente pesante nel becher anteriore. Leggermente rilasciare la pinza tra i due bicchieri per rimuovere l&#39;aria. Versare quindi il gradiente di luce nel becher schiena. </li><li> Accendere l&#39;agitatore magnetico, premere &quot;girare&quot; sulla macchina COBE, rimuovere la pinza dal tubo che collega i due bicchieri, e verificare visivamente che i gradienti pesanti e leggeri sono miscelazione. </li><li> Una volta iniziate le pendenze di miscelazione, accendere la centrifuga. Attendere un minuto, quindi accendere la pompa per caricare il gradienti di miscelazione. </li><li> Per caricare il tessuto lasciare che il gradiente di esaurirsi nel bicchiere davanti, ma non sufficientemente basso per permettere all&#39;aria di entrare nel tubo di carico, poi reclamp il tubo di collegamento alla bicchieri e caricare il tessuto. </li><li> Continuare ad aggiungere il resto del tessuto. Quindi lavare il tubo che tiene il tessuto con 50 ml di soluzione di lavaggio, e utilizzarla per lavare il bicchiere davanti. </li><li> Come l&#39;ultimo del tessuto entra nella borsa, allo stesso tempo fermare la pompa, sbloccaggio alla testa della pompa, pinza e tubo sopra il sacchetto. Continuare a centrifugare per 5 minuti. </li><li> Mentre centrifugazione continua, portare il 12 tubi di raccolta alla cappa e allentare i loro berretti. Collegare il tubo di raccolta al tubo giallo e posizionare la punta sterile raccolta nel tubo conico 1. Poi sbloccaggio del tubo giallo, e bloccare il tubo verde. </li><li> Quando il giro finisce, sollevare lentamente Superout a 100. Raccogliere 150 ml in tubo 1. Poi raccogliere in provette da 30 ml 2-12 (200-230 ml). </li><li> Una volta che la raccolta è completa, premere &quot;STOP&quot; sulla COBE. Ora che la purificazione è finita, le isole possono essere valutati e colto. </li></ol> 2. Campionamento e cultura <ol><li> Dopo aver raccolto le frazioni purificate isolotti, rimuovere un campione da ciascuno dei 12 tubi di raccolta e la macchia con ditizone. La colorazione mostrerà quali sono strati contenenti isolotti di elevata purezza vs strati con isolotti bassa purezza. </li><li> Raccogliere il tessuto ad alta purezza e bassa e la piscina ogni insieme. </li><li> Spin e lavare due volte. Dopo il secondo lavaggio, portare il volume di ciascuna a 250 ml con i media lavaggio finale. </li><li> Per valutare le frazioni in pool inizia prendendo due campioni da 1 ml dall&#39;alto delle frazioni messe in comune e un 1 ml di campione dal basso. Trasferire 1 ml di ogni campione in una provetta conica contenente 9 ml di soluzione di lavaggio. </li><li> Poi trasferire 1 ml da ciascuna provetta 15 ml di un piatto di conteggio. Esaminare e contare le cellule al microscopio. </li><li> Dopo il conteggio delle cellule calcolare il numero di flaconi necessari per cultura gli isolotti con la seguente formula: (EIN totale / purezza di isolotti in decimale) / (30.000 EIN per cilindro). Per esempio, 100.000 isole con il 90% di purezza sono coltivate in 4 fiaschi. </li><li> Trasferire le isolette di T175 fiaschi e cultura in un 37 ˚ C e 5% CO 2 incubatore. </li></ol>

<ol><li>Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Nano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+for+allotransplantation%3A+variables+associated+with+successful+islet+yield+and+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function.</a> Diabetologia. 48, 906-912 (2005).</li>
<li>Barbaro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreas+preservation+prior+to+islet+isolation.+Cold+ischemic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance.</a> Transplantation. 59, 689-694 (1995).</li>
<li>Fridell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+and+University+of+Wisconsin+solution+for+organ+preservation+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation.</a> Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).</li>
<li>Potdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+experience+using+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation.</a> Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).</li>
<li>Salehi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+outcomes+from+pancreata+preserved+with+Histidine-Tryptophan+Ketoglutarate+versus+University+of+Wisconsin+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution.</a> Transplantation. 82, 983-985 (2006).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+islet+isolation+from+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated islet isolation from human pancreas.</a> Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).</li>
<li>Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+assessment+in+man+and+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetol+Lat%22%5BJournal%5D)">Islet isolation assessment in man and large animals.</a> Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).</li>
</ol>

Nonostante significativi progressi nelle tecniche di isolamento delle isole umana, resa isolotto rimangono estremamente variabile e imprevedibile. Purificazione del tessuto pancreatico digerito è fondamentale per recuperare una sufficiente massa isola dopo il successo digestione enzimatica per il trapianto. Il metodo di purificazione UIC è raccomandato farlo poiché un recupero superiore di isole umane ad alta purezza è stato dimostrato utilizzando questo metodo. Inoltre, fino a 50 ml di tessuto digerito possono essere c...

<table><tbody><tr><td>Centrifuga</td><td>attrezzatura</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>424803</td><td></td></tr><tr><td>Cobe 2991 Cell Processor</td><td>attrezzatura</td><td>Gambro. BCT</td><td>2556</td><td>purificazione delle isole</td></tr><tr><td>Microscopio invertito MZ6 TLBD4.1</td><td>attrezzatura</td><td>Leica Microsystems</td><td>4103</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari con griglia da 2 mm</td><td>attrezzatura</td><td>Nalge Nunc international</td><td>174926</td><td>conteggio delle isole</td></tr><tr><td>Digital Sight DS L1</td><td>attrezzatura</td><td>Nikon Instruments</td><td>217267</td><td></td></tr><tr><td>Sacca COBE</td><td>attrezzatura monouso</td><td>O.R. Solution</td><td>66707003</td><td></td></tr><tr><td>Flacone da coltura T175</td><td>attrezzatura monouso</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>83.1812.500</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione dell'Università del Wisconsin (UW)</td><td>reagente</td><td>DURAMED</td><td>1000-46-06</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone di Hank&amp;rsquo;s (HBSS)</td><td>reagente</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-597-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 1.100</td><td>reagente</td><td>Bichrom AG</td><td>L6155</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo M199 (soluzione di lavaggio)</td><td>reagente</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-784-CM</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo finale di lavaggio/coltura</td><td>reagente</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-785-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ditizione</td><td>reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento del pancreas umano islet: parte ii: la purificazione e la cultura di isole umane

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Gestione del diabete di tipo 1 è onerosa, sia per l&#39;individuo e la società, che costano oltre 100 miliardi di dollari all&#39;anno. Nonostante l&#39;uso diffuso di monitoraggio della glicemia e insulina formulazioni nuove, molte persone ancora sviluppare devastanti complicanze secondarie. Trapianto di isole pancreatiche in grado di ripristinare nei pressi di controllo normale del glucosio in pazienti diabetici<sup&gt; 1</sup&gt;, Senza il rischio di gravi episodi di ipoglicemia che sono associati con la terapia insulinica intensiva. Fornire sufficiente massa isolotto è importante per il trapianto di isole pancreatiche di successo. Tuttavia, le caratteristiche del donatore, reperimento di organi e la conservazione influenzare l&#39;esito isolamento<sup&gt; 2</sup&gt;. Presso l&#39;Università dell&#39;Illinois a Chicago (UIC), abbiamo sviluppato un protocollo di successo isolamento con pendenza purificazione migliorato<sup&gt; 3</sup&gt;. Il programma è iniziato nel gennaio 2004 e più di 300 isolamenti sono stati effettuati fino a novembre 2008. Il pancreas sono stati inviati nelle soluzioni di conservazione a freddo (UW, University of Wisconsin o HTK, Istidina, Triptofano chetoglutarato)<sup&gt; 4-7</sup&gt; Al Laboratorio cella d&#39;isolamento a UIC per l&#39;isolamento delle isole. Isole pancreatiche sono stati isolati con il metodo UIC, che è una versione modificata del metodo originariamente descritto da Ricordi<em&gt; Et al</em&gt;<sup&gt; 8</sup&gt;. Come descritto nella Parte I: Digestione e raccolta di tessuto pancreatico, pancreas umano è stato tagliato, cannulata, perfusi e digerito. Dopo la raccolta e almeno 30 minuti di incubazione in soluzione UW, il tessuto è stato caricato nel separatore cellulare (COBE 2991, Cobe, Denver, CO) per la depurazione<sup&gt; 3</sup&gt;. A seguito di purificazione, resa isolotto (espressi come equivalenti isolotto, IEQ), il volume dei tessuti, e la purezza è stato determinato in base ai metodi standard<sup&gt; 9</sup&gt;. Isolette isolate sono state coltivate in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), integrati da 1,5% di albumina umana, 0,1% insulina-transferrina-selenio (ITS), 1 ml di Ciprofloxacina, 5 ml di HEPES 1M, e 14,5 ml di Bicarbonato di Sodio 7,5% nel T175 matracci a 37 ° C durante la notte prima cultura isolotti sono stati trapiantati o utilizzati per la ricerca.

Il raggiungimento di alta qualità e la quantità appropriata di isole umane è uno dei presupposti importanti per il trapianto di isole pancreatiche di successo. In questo video, si descrive passo dopo passo le procedure per l&#39;isolamento delle isole pancreatiche umane (parte II: la purificazione e la cultura di isole umane) utilizzando un metodo modificato automatizzato.

Isolamento del pancreas umano Islet: Parte II: La purificazione e la cultura di isole umane

La gestione del diabete di tipo 1 rappresenta un onere sia per l'individuo che per la società, con costi annuali superiori ai 100 miliardi di dollari. Nonostante l'ampio utilizzo di...

In questo video, un tessuto pancreatico precedentemente isolato e digerito viene sottoposto a una purificazione mediante gradiente di fial, che consentirà di ottenere una frazione purificata di isolotti pancreatici che potranno infine essere coltivati in fiaschi da coltura tissutale fino al trapianto. Ciao, sono American Chief del Laboratorio del Programma Isolotti Umani del Dipartimento di Chirurgia dell'Università dell'Illinois a Chicago. Ciao, mi chiamo Barbara Barbero e faccio anch'io parte del Programma Isolotti Umani.Oggi vi mostreremo un procedimento per l'isolamento di isolotti pancreatici umani. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per raccogliere isolotti umani di alta qualità destinati all'uso clinico. Cominciamo.Per iniziare la procedura di purificazione con eyelet, chiudere con le pinze del sacchetto COBE tutte le tubature tranne quella verde e impostare la velocità a 1500 e la superout a zero all'interno della cappa. Preparare la pompa e i becher per il gradiente e collegare il tubo di raccolta al tubo verde. Ora si può iniziare il caricamento della colonna FI premendo spin.Quindi aggiungere 110 millilitri di fi. Versare nel becher anteriore e avviar

human-pancreatic-islet-isolation-part-ii-purification-culture-human

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Il raggiungimento di alta qualità e la quantità appropriata di isole umane è uno dei presupposti importanti per il trapianto di isole pancreatiche di successo. In questo video, si descrive passo dopo passo le procedure per l'isolamento delle isole pancreatiche umane (I parte: la digestione e la raccolta di tessuto pancreatico) utilizzando un metodo modificato automatizzato.

Isolamento delle isole pancreatiche umane: Parte I: Digestione e Collezione di tessuto pancreatico

La fornitura di diabete di tipo 2 isolotti per la ricerca è insufficiente. Qui condividiamo il nostro protocollo per isolare isolotti da pazienti sottoposti a pancreatectomia parziale. Questo approccio rappresenta un luogo unico per l'ottenimento di isolotti da diabete di tipo 2 e clinicamente abbinati soggetti non diabetici ed in numero sufficiente per gli studi di base e clinica.

Isolamento di isole umane da pazienti parzialmente Pancreatectomized

Le isole pancreatiche, chiamate anche isole di Langerhans, sono un gruppo di cellule endocrine che producono ormoni per la regolazione del glucosio e altre importanti funzioni biologiche. Questo protocollo spiega un metodo per isolare le isole pancreatiche mediante prima perfusione di collagenasi tramite l'ampolla di Vater per digerire il tessuto pancreatico esocrino e una centrifugazione semplificata in gradiente di densità per purificare le isole dai topi.

Isolamento delle isole pancreatiche attraverso la perfusione di collagenasi: un metodo enzimatico per isolare le cellule delle isole pancreatiche

sfide critiche per il campo di ricerca sul diabete sono di comprendere i meccanismi molecolari che regolano la replicazione isolotto β-cellule e di sviluppare metodi per stimolando la rigenerazione delle cellule β-. Qui un metodo ad alto contenuto di screening per identificare e valutare l'attività di replica di promozione β-cellule di piccole molecole è presentato.

A High-contenuti<em&gt; In Vitro</em&gt; La replica della piattaforma Discovery isole pancreatiche β-cellule

Qui, descriviamo le impostazioni per monitorare in parallelo la bioluminescenza circadiana e l'attività secretoria delle cellule insulari umane e dei miotubi primari. Per questo, abbiamo impiegato la somministrazione genica lentivirale di un reporter di clock con nucleo di luciferasi, seguita dalla sincronizzazione in vitro e dalla raccolta del terreno di deflusso mediante perifusione cellulare continua.

Misura parallela di circadiano Clock espressione genica e la secrezione dell&#39;ormone in colture cellulari primarie umane

Descriviamo qui un protocollo per isolare isolotti intatti da topi neonati. Pancreas sono stati parzialmente digerito con collagenasi, seguita da lavaggio e raccolta manuale. 20 - 80 clusters insule possono essere ottenuti per pancreas da topi appena nati, che sono adatti per diversi studi insulari.

Efficace isolamento di isole funzionali da neonatali mouse Pancreas

Questo protocollo di isolamento dell'isolotto ha descritto una nuova via di iniezione di collagenasi per digerire il tessuto esocrino e una procedura di gradiente semplificata per purificare le isole dai topi. Si tratta di digestione ezimatica, separazione/purificazione del gradiente e raccolta a mano dell'isolotto. Il successo dell'isolamento può produrre 250-350 isolotti di alta qualità e completamente funzionali per mouse.

Un semplice protocollo ad alta efficienza per l'isolamento delle isolozioni pancreatiche dai topi

Qui, presentiamo un protocollo per generare dati trascrittomi su larga scala di alta qualità e su larga scala di singole cellule da isole pancreatiche umane isolate utilizzando una tecnologia di sequenziamento di RNA microfluidico a celle a goccia.

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula e analisi delle isole pancreatiche umane

Questo protocollo fornisce una guida passo passo per l'approvvigionamento di un pancreas suino per l'isolamento e la purificazione delle isole.

Perfusione chirurgica e isolamento del pancreas suino per l'isolamento delle isole

Questo protocollo descrive un metodo standardizzato per il prelievo chirurgico, la digestione enzimatica e la purificazione con gradiente di densità degli isolotti pancreatici del ratto Lewis, consentendo preparazioni ad alta resa e alta purezza per l'uso diretto in studi di trapianto o in vitro .

Isolamento e purificazione degli isoli pancreatici da ratti Lewis tramite digestione enzimatica e separazione tra densità e gradiente

Scopri la purificazione e la coltura di isole pancreatiche umane mediante gradiente Ficoll per trapianti clinici. Questo metodo automatizzato garantisce isole di alta qualità per il trattamento del diabete.

Isolamento del pancreas umano Islet: Parte II: La purificazione e la cultura di isole umane

Esplora altri video