In vivo Ca ^{2 +} - Imaging di neuroni Corpo funghi durante l'apprendimento olfattivo nel Honey Bee

Questa procedura inizia fissando l'ape in una camera di registrazione. Viene rimossa una porzione di cuticola dalla capsula cefalica per colorare strutture selezionate del cervello. I segnali di calcio nei neuroni colorati vengono registrati in vivo mediante un apparato di imaging a campo ampio.

Durante l'acquisizione delle immagini, l'ape può essere stimolata con odori o con la somministrazione di saccarosio all'antenna. In questo modo, è possibile condizionare l'ape ad estendere il proboiscide in risposta a un odore. La risposta di estensione del proboiscide viene monitorata mediante registrazioni elettromiografiche del muscolo M 17.

Dopo l'esperimento di imaging, il cervello viene dissezionato per un'analisi più approfondita delle strutture colorate mediante microscopio confocale. Ciao, sono Melanie del Laboratorio di rdo Mansel. Ciao, sono Anya anch'io del Laboratorio Mansel.

Oggi vi mostreremo un procedimento per l'imaging del calcio in vivo nel corpo fungiforme dell'ape mellifera. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare la codifica olfattiva e la plasticità legata all'apprendimento nel cervello dell'ape mellifera. Cominciamo dunque.

Iniziare catturando un'ape bottinatrice all'ingresso dell'alveare, quindi immobilizzarla raffreddandola su del ghiaccio. Successivamente, fissare l'ape in una camera di registrazione in plexiglass. Utilizzare una cera dura a basso punto di fusione per fissare gli occhi e il torace alla parete.

Rompere tutti un capillare di vetro alla punta per ottenere un diametro di 10 micrometri. Coprire la punta del capillare con una pasta costituita da un miscuglio di rapporto 10 a 1 di URA due destrina e destrina fissabile Rodin. Il capillare preparato verrà utilizzato per la colorazione.

Per iniziare la procedura di colorazione, fissare innanzitutto le antenne con una koane. Aprire la capsula cefalica sopra il cervello rimuovendo un frammento di cuticola e spostando lateralmente le ghiandole e le trachee, in modo da accedere al corpo peduncolato. Utilizzare un pezzo di carta per assorbire l'emolinfa all'interno della capsula cefalica.

Per colorare i neuroni del corpo fungiforme, iniettare la capillare nel soma o nella regione dendritica dei neuroni. Successivamente, riposizionare il frammento di cuticola sul capo e allentare l'antenna. Infine, nutrire l'ape con una soluzione di saccarosio al 30% e conservarla in una scatola di polistirolo coperta con un panno da cucina umido per almeno quattro ore o per tutta la notte a 20 gradi Celsius.

Completata la preparazione B, possiamo iniziare l'immagine in vivo. Per iniziare, utilizzare una spugna collegata alla camera di registrazione per impedire alape di muoversi, premendola contro l'addome. Ora fissare le antenne dell'ape con un ioane per impedire al cervello di muoversi a causa del pompaggio dell'esofago.

Praticare un piccola incisione nella cuticola sopra il labro ed estrarre con cura l'esofago e le strutture solide circostanti, coprendole con due componenti di silicone. Successivamente, utilizzare un ago per creare dei fori per l'inserimento di elettrodi a filo utilizzati per registrare elettrogrammi dal muscolo protractore del labio. Rimuovere il frammento di cuticola, la trachea e le ghiandole sovrastanti il cervello.

Utilizzare un pezzo di carta per assorbire l'emolinfa all'interno della capsula cefalica per registrare elettrogrammi dal muscolo 17. Iniettare un filo di rame nel muscolo vicino agli organi boccali. Iniettare un elettrodo di terra nell'occhio.

Ora riempire la capsula cefalica con silicone bicomponente. Assicurarsi che il cervello sia completamente ricoperto. Posizionare l'ape sul palchetto del microscopio e depositare una goccia d'acqua sulla superficie del silicone.

Immergere l'obiettivo ad immersione del microscopio nella goccia, quindi mettere a fuoco i neuroni dello stadio. Una volta completata la preparazione per l'immagine in vivo, possiamo ora descrivere la stimolazione odorosa e la registrazione del segnale. Per somministrare stimoli odorosi all'ape, utilizziamo un olfattometro su misura controllato da computer per diluire gli odoranti in un flusso d'aria costante.

La stimolazione diretta dell'antenna con odore consiste in un impulso di tre secondi di aria satura di odore. Per l'imaging del calcio, utilizziamo un sistema di imaging a fotoni montato su un microscopio fluorescente zes per registrare le immagini a temperatura ambiente con una frequenza di campionamento di cinque hertz. I segnali di calcio vengono registrati attraverso un obiettivo Olympus X 60 0,9 W a immersione in acqua con una telecamera CCD Ango; ogni misurazione dura 10 secondi.

I potenziali muscolari vengono amplificati con un amplificatore Grass e registrati e digitalizzati mediante un convertitore analogico-digitale. Le registrazioni provenienti da M 17 vengono utilizzate per monitorare le risposte comportamentali legate all'apprendimento; una volta completata la registrazione del segnale, possiamo ora passare all'analisi morfologica e alla ricostruzione. Poiché entrambi i coloranti utilizzati durante il backfill hanno lo stesso peso molecolare.

Sono colocalizzati nei neuroni. L'immagine in campo chiaro ha una risoluzione spaziale limitata, quindi utilizziamo la microscopia confocale a scansione per analizzare le strutture colorate. Dopo l'esperimento, dissezionare innanzitutto il cervello e fissarlo per tutta la notte in formaldeide al 4% a quattro gradi Celsius; il giorno successivo, risciacquarlo in PBS e quindi disidratarlo mediante passaggi di etanolo: 10 minuti al 50%, 70%, 90%, 99% e due volte 10 minuti al 100%. Posizionare il cervello su un vetrino con scanalatura con una goccia di salicilato di metile, coprire con un coprioggetto, quindi posizionarlo sul portacampioni del microscopio confocale a scansione.

Scansiona il cervello con un obiettivo a immersione d'aria e uno zoom digitale compreso tra 1,1 e 1,2 in sezioni ottiche di quattro micrometri. Qui osserviamo la risposta dei neuroni estrinseci del corpo fungiforme alla stimolazione odorosa delle antenne, registrata attraverso un obiettivo 60x e visualizzata in falsi colori. Il quadrato rosso a sinistra rappresenta la persistenza dello stimolo odoroso.

Dopo l'esperimento, il cervello viene dissezionato e le strutture colorate vengono analizzate in maggiore dettaglio mediante microscopio confocale a un ingrandimento di 20 x. Abbiamo quindi appena mostrato come ottenere immagini dei neuroni del corpo fungiforme nell'ape mellifera durante l'apprendimento olfattivo. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che esperimenti che coinvolgono coloranti sensibili alla luce devono essere effettuati al buio.

Ecco fatto. Grazie per averci guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti. Ciao ciao.