Name: In vivo Ca 2 + - Imaging di neuroni Corpo funghi durante lapprendimento olfattivo nel Honey Bee (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Impara l'imaging del calcio in vivo nei corpi funghi delle api durante l'apprendimento olfattivo. Questo metodo consente di registrare l'attività neuronale in tempo reale e di studiare i meccanismi neurali della memoria negli insetti.

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Bee Preparazione e Back-riempiono <ol><li> Cattura api bottinatrici in arnia e freddo in ghiaccio per immobilizzazione. </li><li> Montaggio in plexiglass registrazione camere 3. Fissare gli occhi e torace alle pareti della camera di registrazione con la cera a basso punto di fusione dura. </li><li> Tirare in vetro capillari, comunemente usate per elettrofisiologia e rompere alla punta ad ottenere un diametro punta di ca. 10μm. Coprire punta del capillare con pasta colorante. Pasta colorante è costituito da una miscela 10:01 di Fura-2 destrano e lisina risolvibile tetrametilrodamina destrano. </li><li> Per la procedura di colorazione immobilizzare antenne con minuzie o n-eicosane. Rimuovere un pezzo di cuticola al di sopra del cervello e spingere ghiandole e trachea al lato per consentire l&#39;accesso al corpo dei funghi. </li><li> Iniettare capillari in nessuna regione del soma o assonale dei neuroni del corpo funghi. Questo può essere fatto a mano libera o utilizzando un micro-manipolatore. Quindi ripristinare pezzo cuticola sulla capsula testa e allentare antenne. </li><li> Nutrire le api con una soluzione di saccarosio al 30% prima di riporlo in un caso umidificato per almeno quattro ore o per tutta la notte a 20 ° C. </li></ol> Imaging in vivo <ol><li> Prevenire i movimenti dei es. api con un piccolo pezzo di spugna che viene premuto contro l&#39;addome e fissa con una clip o nastro alla camera di registrazione. </li><li> Per impedire il movimento del cervello risultante dal pompaggio dell &#39;esofago, tagliate una piccola incisione nella cuticola sopra il labbro ed estrarre con attenzione l&#39;esofago e le sue solide strutture circostanti per metterla in tensione, senza danneggiare l&#39;esofago 4. Coprire con due componenti in silicone. </li><li> Eseguire fori con un ago ed inserire elettrodi a filo per la registrazione di M17. </li><li> Rimuovere pezzo cuticola, trachea e le ghiandole sopra il cervello. Succhiare heamolymph all&#39;interno della capsula testa con un pezzo di carta. </li><li> Riempire la capsula testa con due componenti in silicone. E &#39;importante che il cervello è completamente coperto. </li><li> Ape posto sul palco microscopio e una goccia d&#39;acqua sulla superficie del silicone per immergere l&#39;obiettivo del microscopio tuffo nella goccia. Focus su neuroni macchiato. </li></ol> Odore stimolazione e registrazione di segnali Olfattometro: Usiamo un controllo del computer, dispositivo di stimolazione personalizzati costruiti o &quot;olfattometro&quot; come descritto in precedenza da Galizia e Vetter 3. Gli odori sono diluiti in un flusso d&#39;aria costante diretto verso le antenne. Ogni stimolo consiste in un impulso 3s odore di aria satura dell&#39;odore 0,2 ml. Il protocollo di stimolazione può essere impostato nel TILLVision software di registrazione. Microscopio Imaging e set-up: Noi usiamo un microscopio a fluorescenza Zeiss. Le immagini vengono registrate a 25 ° C con un tasso di campionamento di 5 Hz utilizzando un AL-Photonics dispositivo di imaging montato sul microscopio. Segnali di calcio sono registrati attraverso un X60, 0,9 W Olympus tuffo obiettivo con una fotocamera CCD Imago (640X480 pixel, 4X cestinate su chip a 160x120 pixel). Fura-2 è eccitato con luce monocromatica di 340 e 380 nm di lunghezza d&#39;onda per misure raziometrico. Fluorescenza viene rilevata attraverso uno specchio dicroico 410nm e 440nm un filtro passaggio lungo. I parametri per la registrazione sono impostate nel software di registrazione. Ogni misura ha una durata di 10 secondi e tempo di esposizione per le due lunghezze d&#39;onda può essere regolata per l&#39;intensità di colorazione in ogni preparazione. M17 registrazione: Il muscolo goniometro del labium (M17) è registrato extracellulare di monitorare le risposte comportamentali legati all&#39;apprendimento, cioè il PER 5, 6. Iniettare un filo di rame nel muscolo vicino al parti della bocca. Iniettare elettrodo di terra negli occhi. I potenziali muscolari sono amplificate con una generazione personalizzata pre-amplificatore, digitalizzati e archiviati su un computer. Insorgenza stimolo è innescato dal olfattometro. Analisi dei dati <ol><li> Durante l&#39;esperimento: Le registrazioni del segnale calcio sono immessi in un computer e memorizzati. Il TILLVision software di registrazione permette una ispezione iniziale dei segnali, come il calcolo del rapporto tra le lunghezze d&#39;onda (340nm/380nm) e calcolo di deltaF (sottrazione di base). </li><li> L&#39;elaborazione delle immagini viene eseguita con programmi personalizzati scritti in IDL. Calcolare il rapporto di Ca 2 + segnali da 340nm e 380nm misure per ogni pixel. Determinare gli fluorescenza (F) da una media di oltre fotogrammi prima lo stimolo e sottrarre dal segnale raziometrico (deltaF). </li><li> Per definire Regione di interesse (ROI): Calcolare media dei fotogrammi durante lo stimolo e applicare un filtro passa-basso (3X3px). Convertire in scala di grigi a scala di falsi colori. Determinare l&#39;attività in strutture neuronali come macchie attività nelle immagini in falsi colori e definire come il ROI. </li><li> Calcolare la dinamica temporale delle regioni attive facendo la media dei pixel nella ROI su tutti i fotogrammi, senza alcun filtro o correzione. </li></ol> Insieme al Fura-2 destrano riempiamo i neuroni con la risolvibile colorante rodamina destrano (&quot;mini rubino&quot;). Entrambi i coloranti hanno lo stesso peso molecolare, che devono essere co-locati nei neuroni. Grande campo di imaging permette solo la risoluzione spaziale molto limitata, quindi si raccomanda di indagare le strutture macchiate dopo l&#39;esperimento usando la microscopia confocale a scansione. <ol><li> Dopo le misurazioni fisiologiche, sezionare il cervello e fissare. </li><li> Sciacquare in PBS e disidratare in etanolo graduale e chiaro in salycilate metile. </li><li> Per la microscopia confocale incorporare cervello in salycilate metile. </li><li> Usiamo un microscopio Leica TCS SP2. Lunghezza d&#39;onda di eccitazione è 543nm. </li><li> Abbiamo la scansione del cervello con l&#39;aria o l&#39;immersione obiettivo di petrolio e confrontare le strutture colorate con i dati di imaging. </li></ol> Rappresentante dei risultati: Se la colorazione e la preparazione ha avuto successo, il segnale in scala di falsi colori, ad esempio in funghi corpo alfa neuroni del lobo estrinseca, potrebbe apparire come in figura 1. La risposta comportamentale (PER) può essere calcolato come frequenza picco durante lo stimolo meno frequenza di picco prima lo stimolo (Figura 2). Le strutture colorate possono essere studiati in dettaglio utilizzando un microscopio confocale (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/1353/figure1_new.png" alt="Figura 1" /> Figura 1: Rappresentante segnali Imaging di calcio (stimolazione con heptanal). R: Imaged regione del cervello delle api. B: prime immagini fluorescenti, come visto attraverso un tuffo X20 obiettivo alla lunghezza d&#39;onda di eccitazione 380 nm, l&#39;alfa-lobo del corpo dei funghi è delineato in viola. Colorante è stato iniettato nel ventro-laterale bordo della alfa-lobi a macchia neuroni estrinseci. C: immagine a colori falsi derivato dalla media del segnale, deltaF (340/380), durante lo stimolo tre secondi; alfa-lobo delineato in viola, selezionati ROI delineati in nero. D: dinamica temporale del segnale del calcio in risposta alla stimolazione odore, segnale media della regione di interesse, come indicato in C. E: la dinamica temporale del segnale del calcio in risposta alla stimolazione del saccarosio ipsi-e contra-laterali antenna rispettivamente al ROI indicato in C. <img src="/files/ftp_upload/1353/figure2_new.png" alt="" /> Figura 2: Rappresentante M17 risposta. Dopo il condizionamento olfattivo l&#39;ape estende la proboscide, quando l&#39;odore è presentato senza ricompensa. Linea rossa indica stimolo odore. Inset: PER delle api. <img src="/files/ftp_upload/1353/figure3_new.png" alt="" /> Figura 3: serie di immagini Rappresentante. Dopo l&#39;esperimento di imaging del cervello è stato sezionato. Il neurone di figura 1 viene sottoposto a scansione utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo ad immersione olio X20, l&#39;alfa-lobo delineato in viola.

<ol><li>Joerges, J., Küttner, A., Galizia, C. G., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representations+of+odors+and+odor+mixtures+visualized+in+the+honeybee+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Representations of odors and odor mixtures visualized in the honeybee brain.</a> Nature. 387 (6630), 285-288 (1997).</li>
<li>Rehder, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+honeybee%27s+proboscis+reflex+by+electromyiographic+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of the honeybee's proboscis reflex by electromyiographic recordings.</a> J. Insect Physiol. 33, 501-507 (1987).</li>
<li>Galizia, C. G., Vetter, R. S. Optical Methods for Analyzing Odor-Evoked Activity in the Insect Brain. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGalizia%2C+CG+%22Methods+in+Insect+Sensory+Neuroscience%22">Methods in Insect Sensory Neuroscience</a>. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 345-388 (2004).</li>
<li>Mauelshagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+correlates+of+olfactory+learning+paradigms+in+an+identified+neuron+in+the+honeybee+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Neural correlates of olfactory learning paradigms in an identified neuron in the honeybee brain.</a> J Neurophysiol. 69 (2), 609-625 (1993).</li>
<li>Kuwabara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bildung+des+bedingten+Reflexes+von+Pavlovs+Typus+bei+der+Honigbiene+Apis+mellifica%2C+Hokaido+Univ%5BTitle%5D)+AND+%22Zool.+J.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bildung des bedingten Reflexes von Pavlovs Typus bei der Honigbiene Apis mellifica, Hokaido Univ.</a> Zool. J. Sci. 13, 458-464 (1957).</li>
<li>Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+conditioning+of+proboscis+extension+in+honeybees+%28Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Psychology%22%5BJournal%5D)">Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera.</a> Journal of Comparative Psychology. 97 (2), 107-119 (1983).</li>
</ol>

In questa presentazione abbiamo vissuto tutti i passaggi per indagare nei segnali di calcio in vivo l&#39;ape. Abbiamo applicato questa tecnica ai neuroni del corpo dei funghi, ma l&#39;imaging può essere fatto su tutti i neuroni per cui una tecnica di colorazione può essere stabilita. Ci siamo concentrati sui neuroni nel percorso olfattivo delle api. Gli esperimenti sono tutti eseguiti in una camera oscura. Il set up è illuminato con una luce onda lunga che si trova fuori dal campo della percezione ot...

<table><tbody><tr><td>paraffina dura a basso punto di fusione Deiberit 502</td><td>Dr. B&amp;#246;hme Sch&amp;#246;ps Dental GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FURA-2 dextrano sale di potassio, 10 000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>F-3029</td><td>Proteggere dalla luce.</td></tr><tr><td>tetrametilrodamina dextrano 10 000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D-3312</td><td>Proteggere dalla luce.</td></tr><tr><td>n-eicosano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21, 927-4</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo Kwik Sil</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>KWIK SIL</td><td></td></tr><tr><td>Impianto per imaging</td><td>TILL Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>camera CCD</td><td>Imago</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CED</td><td>Texas Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo ca 2 + - imaging di neuroni corpo funghi durante l&#39;apprendimento olfattivo nel honey bee

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

In vivo e semi-in preparazione per l&#39;imaging in vivo di calcio è stato sviluppato nel nostro laboratorio da Joerges, Kuttner e Galizia oltre dieci anni fa, per misurare l&#39;attività odore evocato nel lobo antennale 1. Da allora in poi, è stato continuamente perfezionato e applicato a diversi neuropiles nel cervello delle api. Qui, descriviamo la preparazione attualmente in uso in laboratorio per misurare l&#39;attività nei neuroni del corpo dei funghi con un accoppiato destrano calcio-sensibili colorante (Fura-2). Noi retrogrado macchia neuroni corpo funghi, iniettando colorante nella loro assoni o regione soma. Ci si concentra sulla riduzione della invasività, per ottenere una preparazione in cui è ancora possibile formare l&#39;ape utilizzando PER condizionata. Siamo in grado di monitorare e quantificare la risposta comportamentale di registrazione elettro-myograms dal muscolo che controlla il PER (M17) 2. Dopo l&#39;esperimento fisiologico delle strutture ripreso sono studiati in dettaglio utilizzando la microscopia confocale a scansione per affrontare l&#39;identità dei neuroni.

Le api possono essere condizionate in un paradigma di apprendimento olfattivo appetitivo (PER condizionata). Utilizzando gli odori come stimoli, abbiamo stabilito un metodo in cui il comportamento viene registrato contemporaneamente Imaging calcio è utilizzato per misurare l&#39;attività odore evocato nei neuroni del corpo dei funghi<em&gt; In vivo</em&gt;.

In vivo Ca 2 + - Imaging di neuroni Corpo funghi durante l&#39;apprendimento olfattivo nel Honey Bee

La preparazione in vivo e semi-in vivo per l'imaging del calcio è stata sviluppata nel nostro laboratorio da Joerges, Küttner e Galizia oltre dieci anni fa, per...

Questa procedura inizia fissando l'ape in una camera di registrazione. Viene rimossa una porzione di cuticola dalla capsula cefalica per colorare strutture selezionate del cervello. I segnali di calcio nei neuroni colorati vengono registrati in vivo mediante un sistema di imaging a campo ampio.Durante l'imaging, l'ape può essere stimolata con odori o con la somministrazione di saccarosio all'antenna. In questo modo, è possibile condizionare l'ape ad estendere il proboiscide in risposta a un odore. La risposta di estensione del proboiscide viene monitorata mediante registrazioni elettromiografiche del muscolo M 17.Dopo l'esperimento di imaging, il cervello viene dissezionato per un'analisi più approfondita delle strutture colorate mediante microscopio confocale. Ciao, sono Melanie del Laboratorio di rdo Mansel. Ciao, sono Anya, anch'io del Laboratorio Mansel.Oggi vi mostreremo una procedura per l'imaging del calcio in vivo nel corpo fungiforme dell'ape mellifera. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la codifica olfattiva e la plasticità legata all'apprendimento nel cervello dell'ape mellifera. Cominciamo dunque.Iniziare catturando un'ape foraggiatrice all

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Descriviamo una tecnica consolidata per misurare e analizzare i cattivi odori evocati risposte di calcio nel lobo antennale di...

Imaging di calcio di cattivi odori evocati risposte nel Drosophila Lobe antenne

Questo video descrive l'imaging del calcio in vivo nei neuroni di Drosophila utilizzando GCaMP. La clip del protocollo in primo piano mostra come registrare i cambiamenti nella fluorescenza GCaMP dai neuroni del corpo a fungo durante un esperimento di condizionamento olfattivo.

Drosophila In Vivo Imaging del calcio: un metodo per l'imaging funzionale dell'attività neuronale

Questo video mostra un metodo per l'imaging del calcio in vivo utilizzando sensori di calcio localizzati sinapticamente nei moscerini. Descrive i passaggi per preparare i moscerini per la microscopia, condurre il condizionamento olfattivo e visualizzare l'afflusso di calcio indotto dagli odori.

in vivo Imaging del calcio utilizzando sensori di calcio localizzati sinapticamente in Drosophila melanogaster

Questo video dimostra un protocollo dettagliato di immunocolorazione per visualizzare i difetti fenotipici nei corpi dei funghi dei cervelli mutanti di Drosophila. Il protocollo prevede l'utilizzo di anticorpi contro Fas2, una proteina coinvolta nella guida assonale che facilita il corretto sviluppo morfologico e funzionale del corpo del fungo.

Visualizzazione dei neuroni del corpo a fungo nel cervello di Drosophila tramite immunocolorazione

Registrazioni simultanee extracellulari lungo termine provenienti da due diversi neuropiles cerebrali o due diversi tratti anatomici sono stati stabiliti nelle api. Queste registrazioni permettono lo studio di aspetti temporali del trattamento neuronale attraverso diverse aree cerebrali del singolo neurone, così come a livello di complesso in un animale comportarsi.

Registrazioni simultanee a lungo termine in due fasi neuronale Processing in Comportarsi api

Qui vi presentiamo un romanzo di Ca 2+ approccio -imaging utilizzando un reporter bioluminescente. Questo approccio viene utilizzato un costrutto fuso GFP-equorina che si lega al Ca 2+ ed emette luce, eliminando la necessità di luce di eccitazione. Significativamente questo metodo permette di imaging lungo continuo, l'accesso alle strutture cerebrali profonde e alta risoluzione temporale.

In Vivo cervello Imaging funzionale approccio basato sul calcio bioluminescente Indicatore GFP-equorina

Per verificare gli effetti inibitori di agenti farmacologici sulla fosfolipasi C (PLC) in diverse regioni del cervello dell'ape mellifica, presentiamo un'analisi biochimica per misurare l'attività del PLC in quelle regioni. Questo test potrebbe essere utile per confrontare attività PLC tra tessuti, così come tra le API che esibiscono comportamenti diversi.

Rilevamento di attività della fosfolipasi C in omogeneato del cervello dall'ape

Qui presentiamo un protocollo con il quale il calcio pre e/o postsinaptico può essere visualizzato nel contesto dell'apprendimento e della memoria della Drosophila. L'imaging di calcio in vivo che utilizza sensori di calcio localizzati sinapricamente viene combinato con un classico paradigma di condizionamento olfattivo in modo tale che la plasticità sinaptica alla base di questo tipo di apprendimento associativo può essere determinata.

In Vivo Optical Calcium Imaging della plasticità sinaptica indotta dall'apprendimento in Drosophila melanogaster

Descriviamo qui i metodi per indurre e analizzare il rimodellamento olfattivo dipendente dall'esperienza dei glomeruli sinaptici del lobo antennale nel cervello giovanile di Drosophila .

Rimodellamento dipendente dall'esperienza del cervello giovanile, neurone sensoriale olfattivo, connettività sinaptica in un periodo critico della prima infanzia

Un ostacolo significativo allo studio dell'attività cellulare durante i processi cognitivi come l'apprendimento e la memoria è l'uso di anestetici per la preparazione dell'imaging in vivo . L'anestesia compromette la memoria a breve termine e la cognizione in più modelli, tra cui la Drosophila. Questo studio presenta un metodo unico per preparare la Drosophila adulta per l'imaging in vivo senza anestesia.

In vivo Imaging dell'attività neurale nelle mosche adulte di Drosophila non anestetizzate

Presentiamo i protocolli di imaging del calcio per un neurone olfattivo larvale di Drosophila , utilizzando un adesivo tissutale topico per l'immobilizzazione. Questo metodo migliora la stabilità, facilitando esperimenti affidabili in vivo ed ex-vivo . Gli script R personalizzati analizzano i segnali del calcio, fornendo una piattaforma efficiente per la ricerca neurofisiologica dettagliata.

Imaging del calcio in vivo ed ex-vivo di un neurone del circuito olfattivo nella larva di Drosophila melanogaster di terzo stadio

Impara l'imaging del calcio in vivo nei corpi funghi delle api durante l'apprendimento olfattivo. Questo metodo consente di registrare l'attività neuronale in tempo reale e di studiare i meccanismi neurali della memoria negli insetti.

In vivo Ca ^{2 +} - Imaging di neuroni Corpo funghi durante l'apprendimento olfattivo nel Honey Bee

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