In vivo Ca ^{2 +} - Imaging di neuroni Corpo funghi durante l'apprendimento olfattivo nel Honey Bee

Le api possono essere condizionate in un paradigma di apprendimento olfattivo appetitivo (PER condizionata). Utilizzando gli odori come stimoli, abbiamo stabilito un metodo in cui il comportamento viene registrato contemporaneamente Imaging calcio è utilizzato per misurare l'attività odore evocato nei neuroni del corpo dei funghi

Questa procedura inizia con il fissaggio dell'ape in una camera di registrazione. Un pezzo di cuticola viene rimosso dalla capsula della testa per colorare strutture selezionate nel cervello. I segnali di calcio nei neuroni colorati vengono registrati in vivo utilizzando una configurazione di imaging ad ampio campo.

Durante l'imaging, l'ape può essere stimolata con odori o con l'erogazione di saccarosio all'antenna. In questo modo, l'ape può essere condizionata ad estendere la proboscide in risposta a un odore. La risposta dell'estensione della proboscide viene monitorata utilizzando registrazioni elettromiografiche dal muscolo M 17.

Dopo l'esperimento di imaging, il cervello viene sezionato per un'indagine più approfondita delle strutture colorate utilizzando un microscopio confocale. Ciao, sono Melanie del laboratorio di rdo Mansel. Ciao, sono Anya e vengo dal Mansel Lab.

Oggi vi mostreremo una procedura per l'imaging in vivo del calcio e del corpo del fungo delle api. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la codifica olfattiva e la plasticità correlata all'apprendimento nel cervello delle api. Quindi iniziamo.

Inizia catturando una raccoglitrice di api all'ingresso dell'alveare, quindi immobilizzala raffreddandola sul ghiaccio. Quindi, monta l'ape su una camera di registrazione in plexiglass. Usa cera dura a basso punto di fusione per fissare gli occhi e il torace al muro.

Tutti rompono un capillare di vetro in punta per ottenere un diametro di 10 micron. Coprire la punta del capillare con pasta d costituita da una miscela 10 a uno di URA, due destrine e destrina Rodin fissabile. Il capillare preparato verrà utilizzato per la colorazione.

Per iniziare la procedura di colorazione, immobilizzare prima le antenne con un koane. Apri la capsula della testa sopra il cervello rimuovendo un pezzo di cuticola e spingendo le ghiandole e la trachea ai lati, consentendo l'accesso al corpo del fungo. Usa un pezzo di carta per assorbire l'emolinfa all'interno della capsula della testa.

Per colorare i neuroni del corpo a fungo, iniettare il capillare nel soma o nella regione dendritica dei neuroni. Quindi ripristinare il pezzo di cuticola sulla capsula della testa e allentare l'antenna. Infine, nutri l'ape con una soluzione di saccarosio al 30% e conservala in una scatola di polistirolo coperta con un canovaccio umido per almeno quattro ore o durante la notte a 20 gradi Celsius.

Una volta completata la preparazione B, possiamo iniziare l'imaging in vivo. Per iniziare, usa una spugna attaccata alla camera di registrazione per evitare che l'ape si muova, premendola contro l'addome. Ora fissa le antenne dell'ape con uno ioano per evitare che il cervello si muova a causa del pompaggio dell'esofago.

Praticare una piccola incisione nella cuticola sopra il labbro ed estrarre con cura l'esofago e le strutture solide circostanti e coprirle con silicone bicomponente. Successivamente, utilizzare un ago per praticare i fori per l'inserimento degli elettrodi a filo utilizzati per registrare gli elettrogrammi dal muscolo goniometro del labbro. Rimuovere il pezzo di cuticola, la trachea e le ghiandole sopra il cervello.

Usa un pezzo di carta per assorbire l'emo all'interno della capsula della testa per registrare gli elettrogrammi da M 17. Iniettare un filo di rame nel muscolo vicino alle parti della bocca. Iniettare un elettrodo di terra nell'occhio.

Ora riempi la capsula della testa con silicone bicomponente. Assicurati che il cervello sia completamente coperto. Posiziona l'ape sul tavolino del microscopio e posiziona una goccia d'acqua sulla superficie del silicone.

Immergere l'obiettivo a immersione del microscopio nella gocciolina, quindi mettere a fuoco i neuroni dello stadio. Una volta completata la preparazione per l'imaging in vivo, possiamo ora descrivere la stimolazione degli odori e la registrazione del segnale. Per fornire stimoli olfattivi all'ape, utilizziamo un olfattometro computerizzato su misura per diluire gli odori in un flusso d'aria costante.

Diretta verso l'antenna, la stimolazione degli odori consiste in un impulso di tre secondi di aria satura di odore. Per l'imaging del calcio, utilizziamo una configurazione di imaging til photonics montata su un microscopio fluorescente zes per registrare immagini a temperatura ambiente con una frequenza di campionamento di cinque hertz. I segnali di calcio vengono registrati attraverso un obiettivo Olympus dip X 60 da 0,9 W con telecamera CCD Ango, ogni misurazione dura 10 secondi.

I potenziali muscolari vengono amplificati con un amplificatore per erba e registrati e digitalizzati con un convertitore analogico digitale. Le registrazioni di M 17 vengono utilizzate per monitorare le risposte comportamentali relative all'apprendimento con la registrazione del segnale completa, ora possiamo passare all'analisi morfologica e alla ricostruzione. Perché entrambi i coloranti utilizzati durante il riempimento hanno lo stesso peso molecolare.

Sono co-localizzati nei neuroni. L'imaging a campo largo ha una risoluzione spaziale limitata, quindi utilizziamo la microscopia a scansione confocale per studiare le strutture colorate. Dopo l'esperimento, sezionare prima il cervello e fissarlo per una notte in formaldeide al 4% a quattro gradi Celsius il giorno successivo, sciacquarlo in PBS e poi disidratarlo in fasi di etanolo 10 minuti al 50% 70% 90% 99% e due volte 10 minuti al 100% Posizionare il cervello su un vetrino per oggetti scanalati con una goccia di copertura di salicilato di metile, Infilarlo e poi posizionarlo sul tavolino del microscopio di un microscopio a scansione confocale.

Scansiona il cervello con un obiettivo ad aria e uno zoom digitale da 1,1 a 1,2 con sezioni ottiche di quattro micrometri. Qui vediamo la risposta dei neuroni estrinseci del corpo del fungo alla stimolazione olfattiva delle antenne registrata attraverso un obiettivo 60x e visualizzata in falsi colori. Il quadrato rosso a sinistra rappresenta la persistenza dello stimolo olfattivo.

Dopo l'esperimento, il cervello viene sezionato e le strutture colorate vengono studiate in modo più dettagliato utilizzando un microscopio confocale con ingrandimento 20x. Quindi ti abbiamo appena mostrato come visualizzare i neuroni del corpo a fungo nell'ape durante l'apprendimento olfattivo. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che gli esperimenti che coinvolgono coloranti sensibili alla luce devono essere eseguiti al buio.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti. Ciao ciao.