Generazione di Human CD40 delle cellule B attivate

Ciao, mi chiamo Alexander Shiku Van Hagen. Sono un membro del Laboratorio di Immunologia e Immunologia del Trapianto presso l'Ospedale Universitario di Colonia. In questo video, vi mostreremo come possiamo generare cellule B umane attivate tramite CD40 a partire da cellule mononucleate del sangue periferico.

Uno dei principali interessi del nostro laboratorio è lo studio delle funzioni delle cellule B indipendenti dagli anticorpi. Oltre al loro ruolo di produttrici di anticorpi, le cellule B svolgono un'importante funzione come cellule presentanti l'antigene sia in condizioni fisiologiche sia nelle malattie autoimmuni. Dopo l'attivazione, le cellule B possono acquisire potenti capacità di presentazione dell'antigene e di stimolazione immunitaria, in particolare quando vengono attivate tramite CD40.

CD40. Le cellule B attivate presentano diversi vantaggi rispetto alle cellule dendritiche. Possono essere facilmente espanse a un costo relativamente basso a partire da piccole quantità di sangue periferico, anche da pazienti affetti da cancro.

Ora la nostra studentessa di dottorato, Tanya Leic, e la nostra tecnica LER, vi forniranno un'introduzione passo dopo passo su come generare linfociti B umani attivati tramite CD40 a partire dal sangue periferico. Salve, mi chiamo Tanya Livi. Sono una studentessa di dottorato e vorrei mostrarvi come generare linfociti B umani attivati tramite CD40.

Questa procedura è stata ottimizzata nel nostro laboratorio. I passaggi principali sono, innanzitutto, la preparazione delle cellule feeder. A tale scopo, utilizziamo cellule N IH 33 trasfettate con il ligando umano CD 40, che vengono irradiate con 78 gray e seminate in piastre a sei pozzetti.

In secondo luogo, avviamo la coltura di cellule B umane attivate da CD40, ottenute da PBMC purificati, che vengono trattati con interleuchina-4 umana e ciclosprina A; queste cellule vengono quindi seminate su cellule fetali in piastre a sei pozzetti. Questa procedura viene ripetuta al giorno sette e successivamente ogni tre o quattro giorni fino al giorno 14 della coltura cellulare. Per ottenere cellule B umane attivate da CD40 altamente pure, iniziamo la generazione di cellule B attivate da CD40 partendo da PBMC umani frescamente purificati o adeguatamente conservati.

Prima di tutto, laviamo i PBMC per due volte, quindi risospendiamo le cellule in 50 millilitri di PBS. Centrifugare i PBMC per sette minuti a 1300 giri al minuto, corrispondenti a 260,5 ×g. Rimuovere il soprannatante e risospendere nuovamente le cellule in 50 millilitri di PBS, quindi centrifugare nuovamente per sette minuti a 1100 giri al minuto, corrispondenti a 190 ×g. Recuperare il soprannatante nuovamente per la determinazione del numero di cellule.

Sospendere i PBMC in 20 millilitri di PBS, mescolare accuratamente le cellule mediante vortex e determinare il numero cellulare. Centrifugare la quantità richiesta di PBMC per la coltura di B CD40 per cinque minuti a 1200 giri al minuto, corrispondenti a 220,5 ×g. Utilizzando una piastra a sei pozzetti, sono necessarie quattro volte 10 alla sesta cellule per pozzetto più 24 volte 10 alla sesta cellule per piastra.

Sospendere nuovamente i PBMC a una concentrazione di 1 × 10⁶ cellule per millilitro in mezzo di coltura CD40B. Introdurre nella sospensione cellulare IL-4 umana fresca a una concentrazione di 50 unità per millilitro per la stimolazione e ciclosporina A a una concentrazione di 0,63 µg/mL per inibire la proliferazione delle cellule T. A questo punto, la sospensione di PBMC è pronta per la stimolazione con il ligando CD40.

Per quanto ne sappiamo, al momento non esiste un ligando SOMAL CD40 di grado GMP funzionale disponibile. Pertanto, utilizziamo cellule NIH 3T3 trasfettate con ligando umano CD40 per stimolare la sopravvivenza, la differenziazione e la proliferazione cellulare, poiché la linea cellulare NIH 3T3 può sopravvivere in coltura per diversi mesi. È necessario escludere regolarmente, mediante analisi, la perdita dell'espressione del ligando CD40.

CD40 ligando trasfettato, NIH 3T3 è una linea cellulare aderente coltivata a 37 gradi con 5% CO₂ in mezzo di selezione, integrato con G418 a una concentrazione di 0,7 milligrammi per millilitro. Questa linea cellulare aderente di fibroblasti non deve mai diventare completamente confluenta e deve essere suddivisa due volte alla settimana. Per suddividere le cellule aderenti, aspirare il mezzo, lavare una volta con 10 millilitri di PBS, agitando delicatamente. Aspirare nuovamente il mezzo e aggiungere 4 millilitri di tripsina-EDTA in un fiasco da 75 centimetri quadrati.

Incubare il matraccio per cinque-dieci minuti a 37 gradi nell'incubatrice. Rimuovere nuovamente il matraccio. Usare dei leggeri colpetti per staccare le cellule dalla plastica.

Quindi aggiungere 10 millilitri di mezzo di tipo selvatico, mescolare delicatamente con movimento rotatorio e trasferire le cellule in un tubo da 50 millilitri. Centrifugare le cellule NA83T3 per cinque minuti a 1200 giri al minuto, corrispondenti a 125 ×g. Risospendere con attenzione le cellule pallide in 10 millimetri di mezzo di tipo selvatico.

Determinare il numero di cellule per il sottocoltura NIH 3T3 e risospendere 1,5 × 10⁶ cellule feeder in 10 millilitri di mezzo wildtype. Trasferirle in un fiasco da 75 cm² e aggiungere G418 a una concentrazione di 0,7 milligrammi per millilitro per selezionare le cellule transfezionate che esprimono resistenza alla neomicina. Infine, incubare le cellule feeder a 37 °C in atmosfera al 5% di CO₂ per la stimolazione delle cellule B CD40.

Prendere il resto delle cellule NI 8 3 3 e irradiarle letalmente con 78 gradi per arrestarne la proliferazione. Diluire le cellule feeder irradiate in mezzo di tipo wire con una densità cellulare di 0,1 volte 10 a 6 cellule per millilitro, piastrando due millilitri per pozzetto in una piastra a sei pozzetti. Lasciare che le cellule nelle piastre a sei pozzetti diventino nuovamente aderenti prima di utilizzarle come cellule feeder, incubandole per 24 ore a 37 gradi e 5% CO2 per la stimolazione dei linfociti B con il ligando CD40.

Verificare al microscopio se le cellule feeder seminate un giorno prima sono aderenti. Se le cellule feeder sono aderenti, rimuovere il SUP natin da ogni pozzetto e lavarle rapidamente due volte. Prima, lavare ogni pozzetto con due millilitri di PBS e successivamente con due millilitri.

Mezzo di lavaggio CD40 B per la stimolazione della sospensione di PBMC. Preparare poco prima utilizzando una densità cellulare di 1 × 10⁶ cellule per millilitro rispetto alle cellule feeder. A tale scopo, trasferire delicatamente quattro millilitri di sospensione cellulare in ciascuna.

Incubare bene la piastra a 37 gradi in 5% CO₂ al settimo giorno. Le cellule B CD40 possono essere sottocoltivate per la prima sottocoltura di CD40. Cellule B attivate al settimo giorno e successive sottocolture ogni tre o quattro giorni.

Raccogliere delicatamente le cellule aggregate dalle sei piastre da 12 mediante risospensione con una pipetta da 10 millilitri. Trasferire le cellule B CD40 in un tubo da 50 millilitri. Centrifugare le cellule B CD40 per sette minuti a 1200 giri al minuto (RPM), corrispondenti a 220,5 ×g, completamente.

Sostituire il mezzo con il mezzo di lavaggio CD40B e determinare il numero di cellule dei linfociti B attivati CD40. Ri-sospendere le cellule B CD40 a una concentrazione di 1 × 10⁶ cellule per millilitro nel mezzo di coltura CD40B.

Quindi, aggiungere nuovamente alla sospensione cellulare interleuchina umana quattro fresca a una concentrazione di 50 unità per millilitro e ciclosporina A a una concentrazione di 0,63 microgrammi per millilitro per la stimolazione. Uc, cellule feeder irradiate preparate un giorno prima. Naturalmente, le cellule feeder irradiate devono essere nuovamente verificate per l'adesione al microscopio immediatamente prima dell'uso.

Se aderenti, lavare rapidamente le cellule feeder due volte, una volta con PBS e un'altra volta con il mezzo di lavaggio CD40B, quindi aggiungere con attenzione quattro millilitri del sospensione CD40B, regolata a un milione di cellule per millilitro, in ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti. Il subcultivo viene ripetuto in modo identico dopo tre o quattro giorni, due volte alla settimana, fino a ottenere ammassi cellulari di cellule B umane CD40 attivate altamente pure al giorno 14 della coltura.

A questo punto, le cellule B CD40 esprimono molecole co-stimolatorie come CD80, CD86, CD83, molecole MHC e la cosiddetta triade di oming ai linfonodi costituita da CD62 ligando, CCR7 e LFA1, che può essere verificata da Fox durante la generazione ai fini di risoluzione dei problemi. Si prega di fare riferimento alla versione testuale di questo protocollo. Speriamo che in futuro le cellule B attivate tramite CD40 possano rappresentare uno strumento importante per l'immunoterapia del cancro.

In bocca al lupo per i tuoi esperimenti.