Generazione di Human CD40 delle cellule B attivate

Ciao, mi chiamo Alexander Shiku Van Hagen. Sono membro del Laboratorio di Immunologia e Immunologia dei Trasporti presso l'Ospedale Universitario di Colonia. In questo video, ti mostreremo come possiamo generare cellule B attivate CD 40 umane da cellule mononucleate del sangue periferico.

Uno dei principali interessi del nostro laboratorio è lo studio delle funzioni anticorpali indipendenti delle cellule BB. Oltre al loro ruolo di produttori di anticorpi, le cellule B hanno un ruolo importante come cellule presentanti l'antigene sia in condizioni fisiologiche che nelle malattie autoimmuni. Dopo l'attivazione, le cellule B possono acquisire potenti capacità di presentazione dell'antigene e immunostimolatorie, specialmente se attivate tramite CD 40.

CD 40. Le cellule B attivate hanno diversi vantaggi rispetto alle cellule dendritiche. Possono essere facilmente espansi a un costo relativamente basso da piccole quantità di sangue periferico, anche da pazienti oncologici.

Ora la nostra dottoranda, Tanya Leic e il nostro tecnico LER, vi forniranno un'introduzione passo dopo passo su come generare cellule B attivate da CD 40 umane dal sangue periferico. Ciao, mi chiamo Tanya Livi. Sono uno studente di dottorato e voglio dimostrarvi come generare cellule B umane attivate da CD 40.

Questa procedura è stata ottimizzata nel nostro laboratorio. Le fasi principali sono, in primo luogo, la preparazione delle celle di alimentazione. Pertanto, utilizziamo cellule N IH 33 trasfettate con ligando CD 40 umano, che vengono irradiate con 78 gray e piastrate su piastre a sei pozzetti.

In secondo luogo, iniziamo la coltura di CD 40 umano, cellule B attivate da PBMC purificate, che vengono trattate con interleuchina umana quattro e ciclosporina aim, tali cellule vengono poi piastrate su cellule di feta su piastre a sei pozzetti. Questa procedura viene ripetuta il settimo giorno e poi ogni tre o quattro giorni fino al giorno 14 della coltura cellulare. Per ottenere cellule B attivate CD 40 umane altamente pure, iniziamo la generazione di cellule B attivate CD 40 con PBMC umano appena purificato o adeguatamente pensato.

Per prima cosa, laviamo il pbmc per due volte, quindi sospendiamo nuovamente le cellule in 50 millilitri di PBS. Gira il PBMC per sette minuti a 1300 giri/min corrispondenti a 260 5G. Questa macchina, il supinato e il grasso, sospendono le celle di nuovo in 50 millilitri di PBS girato di nuovo per sette minuti a 1100 giri/min corrispondenti a 190 G.Questa carta il supinato di nuovo per la determinazione del numero di cellule reus.

Sospendi il PBMC in 20 millilitri di PBS, mescola accuratamente le cellule mediante vorticing e determina la conta cellulare. Ridurre la quantità richiesta di PBMC per la coltura CD 40 B per cinque minuti a 1200 RPM corrispondenti a 220 5G. Utilizzando una piastra a sei pozzetti, sono necessarie quattro volte 10 per le sei celle per pozzetto più 24 volte 10 per le sei celle per piastra.

Quindi risospendere la PBMC una volta da 10 a sei cellule per millilitro nel terreno di coltura CD 40 B. Integrare la sospensione cellulare con IL 4 umano fresco in una concentrazione di 50 unità per millilitro per la stimolazione e ciclosporina A in una concentrazione di 63 microgrammi per millilitro per inibire la crescita delle cellule T. Ora la sospensione di PBMC è pronta per la stimolazione con il ligando CD 40.

Per quanto ne sappiamo, attualmente non è disponibile alcun ligando funzionale GMP CD 40 SOMAL. Pertanto, utilizziamo tre cellule T tre NIH trasfettate con ligando CD 40 umano per stimolare la differenziazione e la proliferazione cellulare poiché la linea cellulare NIH tre T può sopravvivere in coltura per diversi mesi. La perdita dell'espressione del ligando CD 40 deve essere esclusa regolarmente dai fatti.

Il ligando CD 40 trasfettato, NIH three three è una linea cellulare di aderenza e coltivata a 37 gradi con il 5% di CO2 nel terreno di selezione, che è integrato con G 4 1 8 in una concentrazione di oh 0,7 milligrammi per millilitro. Questa linea cellulare di fibroblasti aderenti non dovrebbe mai diventare completamente confluente e dovrebbe essere divisa due volte alla settimana Per dividere le cellule di aderenza, aspirare una volta il lavaggio medio con 10 millilitri di PBS delicatamente girevole. Aspirare nuovamente il terreno e aggiungere quattro millilitri di tripsin EDTA in un pallone da 75 centimetri quadrati.

Incubare il pallone per cinque-10 minuti a 37 gradi nell'incubatrice. Estrarre nuovamente il pallone. Picchiettare delicatamente per staccare le celle dalla plastica.

Quindi aggiungere 10 millilitri di terreno wild type, ruotare delicatamente e trasferire le cellule in una provetta da 50 millilitri. Far girare le celle NA otto tre T tre per cinque minuti a 1200 giri/min corrispondenti a cento e 20 5G. Risospendere con cura le celle pallide in un mezzo di comunicazione a filo da 10 millimetri.

Determinare la conta cellulare per la sottocoltura N IH tre, tre e risospendere 1,5 volte 10 alle sei cellule di alimentazione in un terreno wildtype da 10 millilitri. Trasferirli in un pallone da 75 centimetri quadrati e aggiungere G 4 1 8 in una concentrazione di 0,7 milligrammi per millilitro per selezionare le cellule trasfettate che portano resistenza alla neomicina. I geni infine incubano le cellule di alimentazione a 37 gradi in CO2 al 5% per la stimolazione di CD 40 B.

Prendi il resto delle cellule NI 8 3 3 e irradiale letale con grado 78 per impedirne la proliferazione. Diluire le celle di alimentazione irradiate in un mezzo a filo con una densità cellulare di oh 0,1 volte da 10 a sei cellule per piastra da un millilitro, due millilitri per pozzetto su una piastra a sei pozzetti. Lasciare che le cellule su piastre a sei pozzetti diventino nuovamente aderenti prima di utilizzarle come cellule di alimentazione incubandole per 24 ore a 37 gradi e 5% di CO2 per la stimolazione dei linfociti bi con ligando CD 40.

Controllare al microscopio se le cellule di alimentazione piastrate un giorno prima sono aderenti. Se le cellule di alimentazione sono aderenti, rimuovere la natina di SUP da ciascun pozzetto e lavarle rapidamente due volte. Per prima cosa, lava ogni pozzetto con due millilitri di PBS e il secondo con due millilitri.

CD 40 B Mezzo di lavaggio Per la stimolazione della sospensione PBMC. Preparato poco prima con una densità cellulare di una volta 10 per le sei cellule per millilitro alle celle di alimentazione. Per fare ciò, trasferire delicatamente quattro millilitri di sospensione cellulare su ciascuno.

Incubare bene la piastra a 37 gradi in CO2 al 5% il settimo giorno. Le cellule B del CD 40 possono essere sub-coltivate per la prima sottocoltura del CD 40. Cellule B attivate il settimo giorno e le successive sottocolture ogni tre o quattro giorni.

Raccogli delicatamente le cellule raggruppate dalle sei piastre da 12 di Resus, sospendendole con un tubo da 10 millilitri. Estrarre le cellule CD 40 B in una provetta da 50 millilitri. Far girare le celle CD 40 B per sette minuti a 1200 giri/min corrispondenti a 220 5G completamente.

Sostituire il fluido con il mezzo di lavaggio CD 40 B e determinare il numero di cellule del CD 40. Cellule B attivate. Risospendere le cellule CD 40 B in una sola volta da 10 a sei cellule per millilitro nel terreno di coltura CD 40 B.

Inoltre, integrare la sospensione cellulare con IL 4 umano fresco in una concentrazione di 50 unità per millilitro e ciclosporina A in una concentrazione di 0,63 microgrammi per millilitro per la stimolazione. Uc, cellule alimentatrici irradiate preparate un giorno prima. Naturalmente, le celle di alimentazione irradiate devono essere nuovamente controllate al microscopio per verificarne l'aderenza direttamente prima dell'uso.

Se aderenti, lavare rapidamente le cellule di alimentazione per due volte come prima di una volta con PBS. L'altra volta con il mezzo di lavaggio CD 40 B sono stati accuratamente riprodotti quattro millilitri della sospensione CD 40 B regolata a una volta 10 per sei celle per millilitro su ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti. La sottocoltura viene ripetuta in modo identico dopo tre o quattro giorni due volte alla settimana per finire con gruppi cellulari di cellule B attivate CD 40 umane altamente pure il giorno 14 di coltura.

A questo punto, le cellule B CD 40 esprimono molecole co-stimolatorie come le molecole MHC CD 80, CD 86, CD 83 e la cosiddetta triade di homing linfonodale del ligando CD 62 CCR sette e LFA uno, che può essere controllata da Fox durante la generazione per la risoluzione dei problemi. Si prega di fare riferimento alla versione testuale di questo protocollo. Speriamo che in futuro le cellule B attivate da CD 40 servano come strumento importante per l'immunoterapia del cancro.

Buona fortuna con i tuoi esperimenti.