Utilizzando il Granchio Ferro di Cavallo, Limulus Polifemo, In Vision Research

Ciao, sono Chris Paglia, direttore del Laboratorio di Elaborazione dell'Informazione Visiva presso il Dipartimento di Ingegneria Biomedica della Boston University. Ciao, sono Jacque Liu, studentessa di dottorato nel laboratorio del Dott. Paglia. Gli sforzi di ricerca del nostro laboratorio sono rivolti alla comprensione dei calcoli neurali che permettono agli animali di vedere.

Per questa ricerca, utilizziamo una delle creature più antiche della Terra, il granchio ferro di cavallo americano. Attualmente questi animali possono essere considerati fossili viventi. Continuano a svolgere un ruolo insostituibile nella ricerca biomedica.

Non solo il loro sangue contiene cellule speciali che gli scienziati utilizzano per rilevare tossine batteriche nei nostri farmaci, ma i loro occhi contengono anche una rete neurale che ha fornito notevoli spunti sul funzionamento del nostro sistema visivo. La base cellulare di processi come l'adattamento alla luce e l'inibizione laterale è stata scoperta per la prima volta negli studi sugli occhi composti laterali dell'animale e, per questo lavoro pionieristico, il dottor Keffer Hartline ricevette il Premio Nobel nel 1967. Il granchio ferro di cavallo rimane un modello attraente per la ricerca sulla visione perché l'animale è di grandi dimensioni e robusto per un invertebrato, e i suoi neuroni retinici sono grandi e facilmente accessibili.

Il suo sistema visivo è compatto e ampiamente studiato, e il suo comportamento visivo è ben definito. Inoltre, la struttura e la funzione degli occhi sono modulate su base giornaliera da un orologio circadiano presente nel cervello dell'animale. In sintesi, il sistema visivo degli artropodi a ferro di cavallo è abbastanza semplice da poter essere compreso, ma al contempo sufficientemente complesso da risultare interessante.

In questo video illustreremo tre paradigmi sperimentali per lo studio delle basi neurologiche della visione che possono essere eseguiti in vivo con questo classico modello animale. Per la ricerca sulla visione, si tratta della registrazione dell'elettroretinogramma, della registrazione del nervo ottico e della registrazione intraretinica. I granchi ferro di cavallo vengono mantenuti in un serbatoio di acqua salata aerata, situato in una stanza esposta a un ciclo luce-buio regolato.

Prima di iniziare una qualsiasi di queste tecniche di registrazione, gli animali vengono raffreddati in un secchio di ghiaccio per circa 10 minuti e quindi fissati a una piattaforma di legno inserendo due viti in acciaio inossidabile nel pro soma e due nel soma degli EPI. La piattaforma è pesata nella parte inferiore con del granito in modo che affondi nell'acqua. L'elettroretinogramma o ERG viene utilizzato per monitorare la sensibilità oculare nel tempo.

Misura la risposta elettrica globale di tutte le cellule dell'occhio. Per produrre un lampo di luce, gli strumenti necessari per questa procedura includono un cacciavite, soluzione di Ringer con vaselina, una pipetta, un LED, una camera di registrazione, viti in acciaio inossidabile e un bastoncino di cotone. Utilizziamo una camera di registrazione autocostruita per misurare il potenziale evocato retinico (ERG).

Il corpo è progettato per contenere un serbatoio di soluzione salina a contatto con l'occhio. Il coperchio contiene un filo di cloruro d'argento per collegare la soluzione conduttiva a un amplificatore e un piccolo foro dimensionato per alloggiare un LED prima del montaggio. La superficie inferiore della camera è ricoperta di vaselina.

Le camere vengono quindi fissate sull'occhio del granchio ferro di cavallo con due viti riempite di soluzione salina e chiuse con tappi. L'animale viene posizionato in una gabbia isolata dalla luce, all'interno di un serbatoio riempito di acqua di mare che ricopre le branchie. Il cavo del LED viene inserito nel coperchio della camera.

Il cavo del segnale viene collegato con una clip al filo della camera e il cavo di riferimento a una delle viti impiantate, e entrambi i cavi vengono connessi allo stadio di testa di un amplificatore differenziale ad alta impedenza per l'amplificazione del segnale e la filtrazione del rumore. La gabbia viene quindi chiusa per impedire alla luce ambientale di raggiungere l'animale. Lo stadio ad viene collegato all'amplificatore e i filtri dell'amplificatore vengono impostati per far passare frequenze inferiori a circa 10 hertz.

Da qui, il segnale sale all'oscilloscopio per la visualizzazione e a una scheda di acquisizione dati per l'analisi e l'archiviazione tramite computer; utilizziamo un programma personalizzato scritto in LabVIEW per erogare stimoli luminosi tramite il LED e per registrare il segnale ERG. Il LED viene attivato con un impulso di 100 millisecondi a cinque volt ogni 10 minuti. A sinistra viene visualizzata la forma d'onda ERG corrispondente a ogni lampo di luce, mentre a destra viene riportata l'ampiezza picco-picco delle forme d'onda dei lampi successivi, al fine di monitorare nel tempo le variazioni della sensibilità oculare.

Mediante registrazioni del potenziale retinico (ERG), è possibile studiare gli effetti dell'adattamento alla luce e della modulazione neurale circadiana. L'occhio trasmette messaggi visivi al cervello e le risposte a potenziale d'azione delle fibre del suo nervo ottico. I messaggi codificati possono essere studiati mediante registrazione extracellulare da singole fibre nervose.

I messaggi del ritmo circadiano retrotrasmessi all'occhio possono essere studiati anche con questo metodo. Gli strumenti necessari per questa procedura includono un cacciavite, soluzione Ringer, forbici, una camera di registrazione, pinze curve, una sonda a sottile ago, un bisturi smussato, forbici chirurgiche e un elettrodo sezionale. Le camere di registrazione sono progettate con una sporgenza per alloggiare il nervo; 20 millilitri di sangue possono essere prelevati dal granchio inserendo un ago da 16 gauge tra i muscoli dell'articolazione e il cuore.

L'esanguinazione non è necessaria, ma rende più facile la dissezione del nervo ottico con l'animale fissato alla piattaforma. La posizione del nervo ottico viene stimata tracciando una linea leggermente curva sul carpo tra gli occhi laterali e mediano. Successivamente viene praticato un foro circolare nel carpo con un refin.

Il foro ha lo stesso diametro della base della camera. Il centro del foro si trova circa due centimetri in avanti rispetto all'occhio laterale e leggermente in posizione dorsale rispetto alla linea, in modo che il nervo si estenda lungo la porzione ventrale della camera. Il tessuto connettivo sovrastante viene rimosso fino a quando non è visibile l'intera lunghezza del nervo, e il nervo esposto viene liberato dai tessuti circostanti e sottostanti. Un filamento viene fatto passare attorno al nervo e tirato all'interno della camera attraverso l'apertura semicircolare presente nella parte inferiore.

Attraverso questa stessa apertura, il nervo viene delicatamente guidato nella camera tirando sul filo. Mentre il nervo entra nella camera, la base viene spinta all'interno del foro per minimizzare la trazione sul nervo. La camera viene quindi fissata con due viti e riempita con soluzione di Ringer.

Dopo il fissaggio della camera, l'animale viene posizionato in una gabbia a marea luminosa all'interno di un serbatoio riempito con acqua di mare che ricopre le branchie. L'interno della camera viene visualizzato al microscopio stereoscopico e viene inserito del cotone attorno all'apertura inferiore per prevenire la fuoriuscita di sangue nella camera e la fuoriuscita di ringer dalla camera. La camera viene quindi riempita nuovamente con soluzione di Ringer fresca.

Il tessuto residuo viene rimosso con pinzette e forbici fini. Viene praticato un piccolo taglio nella guaina che incapsula il nervo e il nervo viene separato dalla guaina mediante una sonda aghiata fine. La guaina viene gradualmente srotolata e rimossa tagliando lungo il decorso del nervo.

Un piccolo fascio di fibre viene quindi separato dal nervo utilizzando la sonda e reciso all'estremità più lontana dall'occhio per la registrazione delle fibre afferenti e all'estremità più vicina all'occhio per la registrazione delle fibre efferenti. Utilizziamo un elettrodo a sezione di sistema AM riempito con soluzione di Springer per la registrazione, collegato tramite tubo a una siringa Gilman per l'aspirazione. La punta dell'elettrodo è realizzata mediante vetrofusione, lucidando l'estremità di una capillare di vetro borosilicato di un millimetro di diametro; una connessione A e C fornisce il collegamento del segnale, mentre il collegamento di riferimento è costituito da un filo di cloruro d'argento avvolto intorno all'elettrodo per ridurre il rumore.

La punta dell'elettrodo viene posizionata nella camera di registrazione e l'estremità recisa del fascio nervoso viene aspirata all'interno della punta di vetro mediante depressione. I cavi del segnale e del riferimento vengono collegati allo stadio iniziale di un amplificatore differenziale per l'amplificazione del segnale e la filtrazione del rumore. L'uscita dell'amplificatore viene inviata a un oscilloscopio per la visualizzazione e a una scheda di acquisizione dati per l'analisi e la memorizzazione tramite computer.

Utilizziamo un programma personalizzato scritto in LabVIEW per controllare gli stimoli luminosi e un discriminatore digitale di impulsi per registrare i treni di potenziali d'azione. Viene impiegato un condotto luminoso in fibra ottica per l'illuminazione di singole cellule, mentre per la stimolazione con modelli tramite registrazioni del nervo ottico si utilizza un display video controllato dal computer; in questo modo è possibile studiare la trasmissione del segnale tra gli occhi e il cervello a livello intraretinico. La registrazione consiste nell'inserire un microelettrodo direttamente nelle cellule dell'occhio e nel registrare le fluttuazioni di tensione intracellulare indotte dalla luce.

Gli strumenti necessari per questa procedura includono un cacciavite, una piattaforma lucida a forma di L. I fori filettati accolgono un microelettrodo sopra l'elettrodo di vetro, viti in acciaio inossidabile, pinzette e un bisturi fine. Dopo aver immobilizzato il granchio, un albero stabile, una piattaforma di legno, una piastra lucida con fori filettati preimpostati viene fissata al carpo con due viti sui lati e una in alto.

L'animale viene posizionato in una gabbia impermeabile alla luce all'interno di un serbatoio riempito di acqua di mare che ricopre le branchie. Un microposizionatore motorizzato viene fissato saldamente alla lama mediante viti e il braccio del posizionatore viene allineato sopra l'occhio. Un lotto di micropipette di vetro viene tirato da vetro silicato con un diametro esterno di un millimetro e le punte vengono riempite all'indietro per azione capillare.

Posizionando le pipette in una provetta contenente soluzione di cloruro di potassio 3 M per alcuni minuti, il resto della pipetta viene riempito manualmente con la soluzione salina ed inserito in un supporto per microelettrodi precedentemente riempito di soluzione per prevenire la formazione di bolle. Il supporto per microelettrodi viene quindi inserito nella testa dello stadio di un amplificatore intracellulare fissato al microposizionatore. Viene esposta una sezione della retina tagliando con attenzione una piccola area quadrata della cornea dorsale.

Con il bisturi, si pone una goccia di soluzione di Ringer sul tessuto esposto per evitare che si secchi, e la micropipetta viene avanzata verso la retina. Quando la punta della pipetta tocca la soluzione, si attiva la modalità di iniezione di corrente dell'amplificatore intracellulare e si misura l'impedenza della micropipetta; le micropipette con impedenza al di fuori del range compreso tra 20 e 70 megaohm vengono scartate. Quelle comprese in questo intervallo vengono avanzate a passi micrometrici all'interno della retina e inserite nelle cellule facendo vibrare elettronicamente la punta; stimoli luminosi vengono forniti per penetrare le cellule mediante un cavo in fibra ottica o un display video.

Tre tipi di cellule possono essere osservati nell'occhio del granchio ferro di cavallo: cellule ulari, cellule eccentriche e cellule del pigmento. Le cellule ulari presentano una forte risposta depolarizzante alla luce, le cellule eccentriche mostrano una serie di potenziali d'azione sovrapposti a una risposta depolarizzante, mentre le cellule del pigmento non mostrano alcuna risposta alla luce. La risposta viene osservata su un oscilloscopio e registrata su un computer mediante registrazioni intraretiniche. È possibile studiare la base cellulare della visione.

In conclusione, abbiamo mostrato come eseguire registrazioni di elettroretinogramma, registrazioni del nervo ottico e registrazioni intraretiniche su granchi ferro di cavallo in vivo. Questi metodi sono ampiamente utilizzati e forniscono informazioni uniche sui meccanismi neurali dell'elaborazione delle informazioni visive nei granchi ferro di cavallo. Non solo sono semplici da applicare in un laboratorio di ricerca, ma possono essere facilmente integrati in un laboratorio didattico di neurofisiologia visiva.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.