Inserire grande Ambientale Genomic Produzione Biblioteca

Ciao, sono Marcus del laboratorio di Steven Helm presso il Dipartimento di Microbiologia e Immunologia dell'Università della British Columbia. Oggi vi mostreremo una procedura per la costruzione di una grande libreria ambientale a inserti. Ad assistermi nella procedura di oggi c'è San Lee, che eseguirà il confezionamento dei fagi e l'infezione dell'ospite della biblioteca e coli, così come Elise Hawley e Chin Yang che eseguiranno il prelievo della colonia.

Abbiamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la struttura e il metabolismo della comunità microbica in ambienti marini e terrestri. Quindi iniziamo. Questo protocollo per la creazione di una libreria di DNA a base di carbonio inizia dopo l'isolamento e la tosatura del DNA genomico da campioni di biomassa, procedure che abbiamo dettagliato negli articoli di accompagnamento.

I passaggi successivi preparano il DNA SHE per la legatura in quello PCC vettore SMID. Il primo passo è riparare le estremità dei pezzi di DNA e fosforilare SHE. Le cinque estremità prime, tutti i reagenti necessari per questa fase sono inclusi nel PCC uno kit di produzione della libreria SMID dall'epicentro per impostare la reazione di riparazione finale, scongelare tutti i reagenti sul ghiaccio, quindi combinare il tampone di riparazione finale DNTP, mescolare un TP fino a 20 microgrammi di DNA inserito a 0,5 microgrammi per microlitro miscela enzimatica e acqua Per raggiungere brevemente 80 microlitri, centrifugare brevemente la provetta per ottenere tutto il liquido al Fondoschiena.

Incubare la reazione di riparazione finale a temperatura ambiente per 45 minuti a un'ora. Quindi riscaldare, inattiva gli enzimi a 70 gradi Celsius per 10 minuti. Durante l'incubazione finale della riparazione, è possibile preparare il gel per la fase successiva.

Elettroforesi su gel a campo pulsato o PFGE, il tuo obiettivo è isolare molecole di DNA che vanno da 30 a 60. Kilobasi PFGE è un metodo elettroforetico per risolvere questi frammenti di grandi dimensioni che si uniscono durante l'elettroforesi standard. Per iniziare, preparare un gel all'1% utilizzando aros a basso punto di fusione in 150 millilitri di un tampone di corsa XTAE.

Scegliete i pettini che vi permetteranno di caricare l'intero campione da 80 microlitri di DNA di riparazione finale più il tampone di caricamento in uno o due pozzetti. Prestare particolare attenzione a maneggiare il gel poiché i gel agros a basso punto di fusione. Rompere molto facilmente mentre il gel si solidifica.

Preparare la camera di elettroforesi. Aggiungere 2,2 litri di un XTAE nella camera e accendere la macchina per far circolare il buffer di marcia. Impostare il dispositivo di raffreddamento a 14 gradi Celsius e impostare la pompa a 70 giri/min.

Includi un marcatore PFG di fascia media anche da NEB. Per evitare di tagliare il gel troppo in alto, estrudere aros dalla siringa di gel e tagliare un piccolo tappo dall'estremità con il bisturi. Posizionare il tappo nella parte anteriore del pozzetto e sigillare con aros fuso.

Assicurati che il tampone di corsa si sia raffreddato a 14 gradi Celsius prima di caricare il gel. Nel primo pozzo caricare cinque microlitri di New England Biolabs Lambda Hindi tre digeribili. Nel secondo pozzetto caricare un microlitro del marcatore dimensionale di controllo Smid diluito in 10 microlitri di acqua sterile più tampone di caricamento.

Quindi caricare la miscela riparata e inattivata a caldo più il buffer di caricamento. Chiudere il coperchio e programmare la macchina. Il gel durerà durante la notte o 12 ore.

Quando il gel ha finito di funzionare, usa una macchia d'oro cibernetico per visualizzare il DNA diluisce l'oro cibernetico. In 250 millilitri di un XTAE, metti il tuo gel nella soluzione e colora per un'ora al buio l'oro cyberg è sensibile alla luce mentre il gel sta colorando. Preparare un bagnomaria a 70 gradi Celsius e uno F 45 gradi Celsius per la fase di estrazione del gel che segue.

Il passo successivo è l'assaggio e la gelificazione. Purifica il DNA entro l'intervallo di dimensioni desiderato da 30 a 60 kilobasi. Prendi il tuo gel colorato insieme a un tubo di micro sotterfugio vuoto, strappato ed etichettato e un bisturi sterile al transluminatore a luce blu.

Rivesti il transluminatore con un involucro di plastica per evitare di contaminare il gel. Accendi gli occhiali da vista e accendi la luce blu. Ora puoi vedere il tuo DNA genomico riparato e il marcatore dimensionale del controllo FO smid Con il bisturi, asporta una fetta di gel larga da cinque a sette millimetri che è migrata con e leggermente al di sopra del marcatore dimensionale del controllo smid.

Usa il marcatore PFG come limite superiore per la tua fetta. Trasferire la fetta nel tubo strappato. È possibile conservare le fette a meno 20 gradi Celsius per un massimo di un anno prima di procedere.

Ora è il momento di gelificare. Purifica il DNA dalla tua fetta. Pesa il tubo contenente la tua fetta di gel e calcola il peso della fetta sottraendo il peso della lacrima.

Quindi, sciogliere la fetta nel bagnomaria a 70 gradi Celsius per 10-15 minuti. Dopo che la fetta di gel si è completamente sciolta, trasferisci rapidamente il tubo nel bagnomaria a 45 gradi Celsius. Tenendo presente che un milligrammo di gel solido ha un volume di un microlitro dopo lo scioglimento.

Aggiungere un'unità o un microlitro di preparato enzimatico Jase per 100 microlitri di aros fuso. Incubare a 45 gradi Celsius per un'ora. Quindi aggiungere da due a quattro microlitri in più e incubare a 45 gradi Celsius per un'ora di calore in più.

Inattivare il gel a 70 gradi Celsius per 10 minuti dopo il calore. Inattivando l'enzima, mettere la provetta sul ghiaccio per 10 minuti e poi centrifugare alla massima velocità. 13.000 giri/min per 15 minuti per pellettare eventuali particelle insolubili.

Facendo attenzione a non disturbare il pellet. Rimuovi il surnatante superiore contenente il tuo DNA purificato e trasferiscilo in una provetta di falco da 15 millilitri. Quindi versarlo con tre millilitri di acqua sterile per lavare e concentrare il DNA.

Trasferire la soluzione dalla provetta Falcon da 15 millilitri all'unità filtrante centrifuga Ancon Ultra four con membrana Ultra cell 10. Posizionare l'unità filtro in un rotore a secchio oscillante utilizzando un tubo Falcon da 50 millilitri come adattatore e centrifugare a 4.000 GS per sei-otto minuti. Centrifugare fino a circa 100-500 microlitri di soluzione.

Rimanere sul filtro e scartare il flusso attraverso. Quindi aggiungere altri tre millilitri di acqua sterile al tubo Falcon vuoto. Trasferire la soluzione nella provetta Amon e ripetere la fase di centrifugazione.

Lavare il tubo falcon una terza volta e ridurre il volume finale raccolto sul filtro da 50 a 100 microlitri. Non devi preoccuparti di perdere il campione. Il filtro manterrà 50 microlitri di liquido anche dopo una centrifugazione prolungata.

Trasferire la soluzione di DNA rimanente dalla provetta AmCon in un'unità di filtro centrifugo MicroCon YM 50 prelavata e sciacquare la provetta Amon con altri 50 microlitri di acqua sterile per recuperare tutta la centrifuga di DNA. L'unità filtrante centrifuga MicroCon YM 50 in una microcentrifuga a 10.000 GS fino a quando il filtro non è ancora leggermente coperto di liquido. Controlla ogni minuto.

Se sul filtro è rimasta solo una piccola quantità di liquido. Capovolgere il filtro e recuperare la soluzione di DNA con una seconda fase di centrifugazione a 1000 GS per tre minuti in una provetta fresca per microcentrifuga. Il volume risultante non deve superare i 10-15 microlitri in totale.

In caso contrario, il tuo DNA potrebbe essere troppo diluito per la legatura. Controllare la concentrazione della soluzione di DNA risultante mediante NanoDrop o Pico Green Assay. Recuperato e riparato.

Il DNA è ora pronto per essere legato al PCC un vettore di clonaggio FO SMID per la legatura e lo scongelamento di tutti i reagenti su ghiaccio. Quindi unire nell'ordine elencato qui, mescolando dopo ogni aggiunta. Innanzitutto, aggiungere acqua sterile per raggiungere un volume di reazione di 10 microlitri.

Quindi 10 tamponi di legatura a collegamento rapido, 10 millimolari A-T-P-P-C-C un vettore SMID e inserire con un rapporto molare di 10 a uno. E infine collegare rapidamente la DNA ligasi. Centrifugare brevemente la provetta per portare tutto il liquido sul fondo.

Tocca il tubo e gira di nuovo. Incubare la reazione di legatura a temperatura ambiente per due ore e inattivare l'enzima per 10 minuti a 70 gradi Celsius. A questo punto, puoi conservare la reazione di legatura a meno 20 gradi Celsius o procedere alla fase di confezionamento dei fagi.

Il passo successivo consiste nel generare fagi batterici che funzioneranno per introdurre la tua libreria FO SMID in e coli due o tre giorni prima di pianificare di eseguire la fase di confezionamento dei fagi: escludi il ceppo di placcatura resistente EPI 300 T fornito su una piastra LB semplice e incuba durante la notte a 37 a gradi Celsius per ottenere singole colonie. Puoi sigillare questa piastra e conservarla a quattro gradi Celsius per un uso futuro. Il giorno prima delle reazioni di confezionamento, inoculare 50 millilitri di brodo Albee più 10 millimolari di solfato di magnesio con una singola colonia dalla piastra Epi 300 Agitare a 225 giri/min e 37 gradi Celsius durante la notte.

Il giorno delle reazioni di confezionamento, inoculare 50 millilitri di brodo fresco LB più 10 millimolari di solfato di magnesio con cinque millilitri di coltura notturna. Coltura, i batteri a 37 gradi Celsius a un OD 600 da 0,8 a 1,0. Non superare il diametro esterno di 600 di 1.0.

Diluire il campione prima di misurarlo sullo spettrofotometro in modo da ottenere un risultato accurato. Conservare con ghiaccio o a quattro gradi Celsius fino al momento di procedere o fino a 72 ore. Ora che i batteri sono pronti per l'infezione, è il momento di preparare il disgelo dei fagi.

Le placche max Lambda Packaging estrae con ghiaccio. Utilizzando un tubo per reazione di legatura, lo scongelamento richiederà dai 10 ai 15 minuti circa. Nel frattempo, pre-raffreddare nuovamente un tubo vuoto da 1,5 millilitri con ghiaccio utilizzando un tubo per reazione.

Una volta scongelati gli estratti della confezione Lambda, trasferirli immediatamente in 25 microlitri di ciascun estratto della confezione nel tubo micro fuge pre-raffreddato da 1,5 millilitri e metterli sul ghiaccio. Riportare l'estratto di imballaggio rimanente a meno 80 gradi Celsius. Lasciare gli estratti scongelati sul ghiaccio troppo a lungo ridurrà l'efficienza dell'infezione.

Successivamente, aggiungere 10 microlitri della reazione di legatura a ogni 25 microlitri di estratti scongelati su ghiaccio mescolati pipettando più volte la soluzione senza introdurre bolle d'aria. Centrifugare brevemente per consolidare tutto il liquido sul fondo delle provette e incubare le reazioni di confezionamento in un bagno d'acqua a 30 gradi Celsius per 90 minuti. Dopo 80 minuti di incubazione, scongelare l'estratto di imballaggio rimanente su ghiaccio.

Al termine della reazione di confezionamento di 90 minuti, aggiungere i restanti 25 microlitri di estratto di imballaggio in ciascuna provetta di reazione. Incubare le reazioni per altri 90 minuti a 30 gradi Celsius. Dopo la seconda incubazione, aggiungere 100 microlitri del tampone di diluizione fagico preparato in ciascuna provetta di confezionamento e mescolare delicatamente aggiungendo cinque microlitri di cloroformio in ciascuna provetta.

Ora dovresti avere un volume totale di 165 microlitri nel tubo. Un precipitato viscoso può formarsi dopo l'edizione del cloroformio. Evitare questo precipitato e la fase di cloroformio organico durante il pipettaggio delle particelle di fagi.

A questo punto, puoi conservare le particelle di fago confezionate a quattro gradi per diversi giorni, se necessario, ma usa il fago appena preparato per ottenere i migliori risultati. Ora sei pronto per infettare le cellule ospiti, che hai coltivato durante le fasi di confezionamento del fago con il fago confezionato. Aggiungere il fago confezionato a EPI 300 T una cellula ospite resistente OD 600,8 a 1,0 nel rapporto di 400 microlitri di epi 300 T una cellula resistente per ogni 10 microlitri di particelle di fagi.

Per evitare di pipettare cloroformio dal fondo della provetta di fago confezionato, utilizziamo 125 microlitri di particelle di fago confezionate e cinque millilitri di cellule ospiti resistenti epi 300 T one preparate mescolate delicatamente e poi incubiamo a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Il passo successivo è determinare il titolo del fago confezionato. A tale scopo, si posizionano i batteri infetti su un terreno per selezionare le cellule infette.

Quindi contando le colonie risultanti e dividendo per il volume di fago aggiunto ai batteri che hai piastrato. Il C one SMID contiene un gene di resistenza al cloramfenicolo. Quindi, per selezionare i cloni infetti, i batteri vengono utilizzati su piastre LB contenenti cloramfenicolo.

Distribuire due volte 50 microlitri e due volte 10 microlitri di cellule EPI 300 T 1 resistenti infettate dal fago su quattro piastre separate e posizionare le piastre capovolte in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 16-24 ore, non più di 48 ore fino alla formazione delle colonie. Nel frattempo, raccogliere le cellule residue EPI 300 T one resistenti dall'infezione da cinque millilitri mediante centrifugazione a 3.500 GS per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante.

Aggiungere un millilitro di LB con il 20% di glicerolo al tubo di risuzione. Sospendi il pellet di cella e quat a 100 microlitri ciascuno in provette criogeniche da due millilitri, congela immediatamente e conserva a meno 80 gradi Celsius. Per un ulteriore utilizzo nella fase di raccolta delle colonie il giorno successivo, contare il numero di cloni sulle quattro piastre nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e determinare il titolo del fago confezionato, che si utilizza nella fase successiva.

Il ceppo di glicerolo resistente EPI 300 T one congelato contiene cellule trasdotte con tutti i diversi plasmidi presenti nella tua libreria. Successivamente, distribuire una quantità appropriata in base al titolo virale e alle dimensioni della piastra di ciascun smid. Clone su 2 45 x 2 45 millimetri quadrati.

Piastre per biotest di LB con cloramfenicolo utilizzando perle di vetro. Aggiungi anche una piccola quantità di brodo LB al piatto per distribuire uniformemente le cellule. Tieni presente che la preparazione del brodo di glicerolo concentra inoltre le tue cellule circa cinque volte.

Incubare a 37 gradi Celsius per 24 ore nei giorni di raccolta delle colonie, preparare 96 o 3 piastre da 84 pozzetti riempite con 200 microlitri o 70 microlitri per pozzetto di brodo LB. Integrato con 12,5 microgrammi di cloramfenicolo per millilitro di brodo per la selezione degli antibiotici e il 10% di glicerolo per il congelamento. Per questa fase utilizziamo il sistema automatizzato di riempimento a tre piastre qfi.

Il passo successivo consiste nel raccogliere le colonie dalle piastre LB CHLORAMPHENICOL preparate nelle piastre da 96 o 3 pozzetti da 84 pozzetti preparate per il congelamento. Per questa fase, stiamo utilizzando il robot di prelievo cloni qix two, secondo il manuale dell'utente, per creare un ambiente sterile attorno all'area di prelievo dei cloni. Accendi la luce UV per 30 minuti mentre la luce UV è accesa.

Preparare 500 millilitri di candeggina all'1%, 500 millilitri di acqua deionizzata sterile e 500 millilitri di etanolo all'80%. Quando la luce UV si spegne, riempire i vassoi come etichettato da dietro a davanti. Versare l'1% di candeggina, quindi l'acqua deionizzata in autoclave e l'80% di etanolo nel vassoio anteriore.

Assicurati che siano pieni poiché gli aghi di raccolta non possono essere lavati correttamente senza una soluzione di lavaggio sufficiente. Dopo aver impostato i parametri per un prelievo ottimale, togliete i coperchi dalle piastre batteriche e dalle piastre da 96 o 3 pozzetti riempite con LB e posizionatele tra i perni dei plettri Q. Le piastre dell'area di lavoro devono essere strette contro l'angolo anteriore destro in modo che non possano muoversi durante il prelievo.

Quindi chiudere il pannello frontale. Una volta impostati tutti i parametri, può iniziare la procedura di prelievo. Al termine della raccolta, sciacquare le spazzole e i vassoi con acqua deionizzata e metterli sul banco ad asciugare.

Pulisci eventuali fuoriuscite che potrebbero essersi verificate e pulisci l'interno del CICS con etanolo all'80%. Assicurati che tutte le piastre di supporto al glicerolo siano etichettate e mettile nell'incubatore a 37 gradi Celsius per 24 ore per far crescere una coltura da ogni colonia raccolta. Lascia una nota sull'incubatrice che contenga la data, il numero di piastre incubate, l'ora di incubazione, l'ora di rimozione e le tue iniziali.

Dopo l'incubazione, hai la tua libreria. Ogni pozzetto contiene una coltura di un clone batterico contenente il PCC, uno legato a un pezzo di DNA puro dal campione di partenza. Congela le piastre a meno 80 gradi Celsius per una conservazione a lungo termine e congratulati con te stesso per un lavoro ben fatto.

Il protocollo presentato descrive la procedura per generare una libreria di smid ambientale per catturare il contenuto genetico di una comunità microbica in un determinato habitat. Questo protocollo dovrebbe creare una libreria SMID, che sia rappresentativa del contenuto genetico dell'ambiente campionato, e dovrebbe consentire al lettore di ottimizzare i passaggi critici. Se la quantità di cloni FO smid ottenuti alla fine dell'intera procedura è troppo bassa.

Vi abbiamo appena mostrato come costruire la libreria FO SMID a partire dal DNA genomico derivato da un campione di acqua marina. Quando si esegue questa procedura, è importante iniziare con DNA genomico di alta qualità. Tieni pronte tutte le piastre e i reagenti prima di iniziare e pianifica abbastanza tempo per questo processo in più fasi.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.