Inserire grande Ambientale Genomic Produzione Biblioteca

Ciao, sono Marcus del laboratorio di Steven Helm del Dipartimento di Microbiologia e Immunologia dell'Università della British Columbia. Oggi vi mostreremo un procedimento per la costruzione di una libreria ambientale con inserto di grandi dimensioni. Assiste nella procedura di oggi San Lee, che eseguirà l'incapsidamento fagico e l'infezione dell'ospite della libreria e coli, insieme a Elise Hawley e Chin Yang, che si occuperanno della selezione delle colonie.

Abbiamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare la struttura e il metabolismo della comunità microbica in ambienti marini e terrestri. Cominciamo dunque. Questo protocollo per la creazione di una libreria di DNA fo smid inizia dopo l'isolamento e la frammentazione del DNA genomico da campioni di biomassa, procedure che abbiamo descritto dettagliatamente in articoli JoVE correlati.

Nelle prossime fasi si prepara il DNA SHE per la ligazione nel vettore SMID PCC one. Il primo passaggio consiste nel riparare le estremità dei frammenti di DNA SHE e nella loro fosforilazione. Per le estremità 5', tutti i reagenti necessari a questo passaggio sono inclusi nel kit per la produzione di librerie SMID PCC one di Epicenter. Per impostare la reazione di riparazione delle estremità, scongelare tutti i reagenti sul ghiaccio, quindi unire il buffer per la riparazione delle estremità, la miscela di dNTP, l'enzima T4 polinucleotide chinasi e fino a 20 microgrammi di DNA inserto SHE a 0,5 microgrammi per microlitro, aggiungendo acqua per raggiungere un volume finale di 80 microlitri. Centrifugare brevemente il tubo per raccogliere tutto il liquido sul fondo.

Incubare la reazione di riparazione degli estremi a temperatura ambiente per 45 minuti fino a un'ora. Successivamente, inattivare gli enzimi a 70 gradi Celsius per 10 minuti. Durante l'incubazione della riparazione degli estremi, è possibile preparare il gel per il passaggio successivo.

Elettroforesi in gel con campo pulsato, o PFGE, il tuo obiettivo è isolare molecole di DNA comprese tra 30 e 60 chilobasi. La PFGE è un metodo elettroforetico per risolvere questi frammenti di grandi dimensioni che migraziono insieme durante l'elettroforesi standard. Per iniziare, prepara un gel all'1% utilizzando agarosio a basso punto di fusione in 150 millilitri di tampone di corsa 1X TAE.

Scegliere pettini che consentano di caricare l'intero campione di 80 microlitri di DNA sottoposto a riparazione dei capi, insieme al buffer di caricamento, in uno o due pozzetti. Prestare particolare attenzione durante la manipolazione del gel, poiché i gel in agarosio a basso punto di fusione si rompono molto facilmente durante la solidificazione.

Preparare la camera elettroforetica. Aggiungere 2,2 litri di XTAE nella camera e accendere la macchina per far circolare il buffer di corsa. Impostare il dispositivo di raffreddamento a 14 gradi Celsius e regolare la pompa a 70 giri al minuto.

Includere un marcatore PFG a media gamma, anch'esso proveniente da NEB. Per evitare di tagliare troppo in alto il gel, estrudere dell'agarosio dalla siringa e tagliare un piccolo tappo all'estremità con il bisturi. Posizionare il tappo all'inizio del pozzetto e sigillarlo con agarosio fuso.

Assicurarsi che il tampone di corsa si sia raffreddato a 14 gradi Celsius prima di caricare il gel. Nel primo pozzetto, caricare cinque microlitri del digestione Lambda Hindi III di New England Biolabs. Nel secondo pozzetto, caricare un microlitro del marcatore di controllo delle dimensioni Smid diluito in 10 microlitri di acqua sterile più tampone di caricamento.

Quindi carica la miscela riparata alle estremità e inattivata termicamente, insieme al buffer di carico. Chiudi il coperchio e programma la macchina. L'elettroforesi del gel proseguirà per tutta la notte o per 12 ore.

Una volta terminata l'elettroforesi, utilizzare un colorante cyber gold per visualizzare il DNA. Diluire il cyber gold in 250 millilitri di TAE 1X, inserire il gel nella soluzione e colorare per un'ora al buio, poiché il cyber gold è sensibile alla luce. Mentre il gel viene colorato, preparare un bagno termico a 70 gradi Celsius e uno a 45 gradi Celsius per il successivo passaggio di estrazione del gel.

Il passo successivo consiste nell'escindere e in gel. Purificare il DNA all'interno dell'intervallo di dimensioni desiderato compreso tra 30 e 60 kilobasi. Prendere il gel colorato insieme a una provetta microcentrifuga vuota strappata ed etichettata e un bisturi sterile e portarli al transilluminatore a luce blu.

Rivestire il transluminatore con pellicola di plastica per evitare contaminazioni incrociate del gel. Indossare gli occhiali di protezione e accendere la luce blu. A questo punto è possibile visualizzare il DNA genomico riparato alle estremità e il marcatore di dimensione FO smid. Con il bisturi, asportare una fetta di gel larga da cinque a sette millimetri che ha migrato in corrispondenza e leggermente al di sopra del marcatore di dimensione smid.

Utilizzare il marcatore PFG come limite superiore per la sezione. Trasferire la sezione nel tubo strappato. È possibile conservare le sezioni a meno 20 gradi Celsius per un periodo massimo di un anno prima di procedere.

Ora è il momento della corsa in gel. Purificare il DNA dal tuo frammento. Pesare il tubo contenente il frammento di gel e calcolare il peso del frammento sottraendo il peso del tubo vuoto.

Successivamente, sciogliere la fetta di gel nel bagnomaria a 70 gradi Celsius per 10-15 minuti. Una volta che la fetta di gel è completamente sciolta, trasferire rapidamente il tubo nel bagnomaria a 45 gradi Celsius. Tenere presente che un milligrammo di gel solido ha un volume di un microlitro dopo lo scioglimento.

Aggiungere un'unità o un microlitro di preparato enzimatico Jase per ogni 100 microlitri di aros fuso. Incubare a 45 gradi Celsius per un'ora. Quindi aggiungere da due a quattro microlitri in più di les e incubare a 45 gradi Celsius per un'ulteriore ora a caldo.

Inattivare il gel a 70 gradi Celsius per 10 minuti dopo il riscaldamento. Dopo aver inattivato l'enzima, mettere il tubo sul ghiaccio per 10 minuti e quindi centrifugare alla velocità massima, 13.000 giri/min per 15 minuti, per formare un pellet di eventuali particelle insolubili.

Avendo cura di non disturbare il pellet. Rimuovere il soprannatante superiore contenente il DNA purificato e trasferirlo in una provetta falcon da 15 millilitri. Successivamente, diluirlo con tre millilitri di acqua sterile per lavare e concentrare il DNA.

Trasferire la soluzione dal tubo Falcon da 15 millilitri all'unità filtrante centrifuga Ancon Ultra con membrana ultra cell 10. Posizionare l'unità filtrante in un rotore a cestello oscillante utilizzando un tubo Falcon da 50 millilitri come adattatore e centrifugare a 4.000 ×g per sei-otto minuti. Centrifugare fino a quando rimangono circa da 100 a 500 microlitri di soluzione.

Rimanere sul filtro e scartare il flusso passante. Quindi aggiungere altri tre millilitri di acqua sterile nel tubo falcon vuoto. Trasferire la soluzione nel tubo Amon e ripetere il passaggio di centrifugazione.

Lavare il tubo conico per la terza volta e ridurre il volume finale raccolto sul filtro a 50-100 microlitri. Non è necessario preoccuparsi della perdita del campione. Il filtro tratterrà 50 microlitri di liquido anche dopo una prolungata centrifugazione.

Trasferire la soluzione di DNA rimanente dal tubo AmCon in un'unità di filtrazione centrifuga prelavata MicroCon YM 50 e risciacquare il tubo Amon con ulteriori 50 microlitri di acqua sterile per recuperare tutto il DNA. Centrifugare l'unità di filtrazione centrifuga MicroCon YM 50 in una microcentrifuga a 10.000 ×g fino a quando il filtro è ancora leggermente ricoperto di liquido. Controllare ogni minuto.

Se rimane solo una piccola quantità di liquido sul filtro, capovolgere il filtro e recuperare la soluzione di DNA mediante una seconda centrifugazione a 1000 ×g per tre minuti in un nuovo tubo microcentrifuga. Il volume risultante non deve superare complessivamente da 10 a 15 microlitri.

In caso contrario, il tuo DNA potrebbe essere troppo diluito per la ligazione. Verifica la concentrazione della soluzione di DNA risultante mediante NanoDrop o saggio Pico Green. Recuperato e riparato.

Ora il DNA è pronto per essere ligato al vettore di clonaggio PCC one FO SMID; scongelare tutti i reagenti sul ghiaccio. Quindi combinarli nell'ordine indicato qui, mescolando dopo ogni aggiunta. Per prima cosa, aggiungere acqua sterile per raggiungere un volume di reazione di 10 microlitri.

Quindi aggiungere 10 x tampone di ligazione rapida, A-T-P-P-C-C 10 millimolari, un vettore SMID e l'inserzione in un rapporto molare di 10 a 1. Infine, aggiungere la DNA ligasi rapida. Centrifugare brevemente il tubo per far scendere tutto il liquido sul fondo.

Battere leggermente il tubo e centrifugare nuovamente. Incubare la reazione di ligazione a temperatura ambiente per due ore e inattivare l'enzima per 10 minuti a 70 gradi Celsius. A questo punto, è possibile conservare la reazione di ligazione a meno 20 gradi Celsius oppure procedere al passaggio di confezionamento fagico.

Il passo successivo consiste nel generare fagi batterici che fungeranno da vettori per introdurre la tua libreria FO SMID in E. coli. Due o tre giorni prima di eseguire il passaggio di confezionamento del fago, effettua un’isolazione su piastra del ceppo di EPI 300 T resistente alla piastrazione fornito, su una piastra LB semplice e incuba tutta la notte a 37 gradi Celsius per ottenere colonie singole. Puoi sigillare questa piastra e conservarla a 4 gradi Celsius per utilizzi futuri. Il giorno prima delle reazioni di confezionamento, inoculari 50 millilitri di brodo Albee aggiunti di 10 millimolari di solfato di magnesio con una singola colonia proveniente dalla tua piastra di Epi 300. Agita a 225 giri al minuto e a 37 gradi Celsius per tutta la notte.

Il giorno delle reazioni di confezionamento, inoculare 50 millilitri freschi di brodo LB contenente 10 millimoli di solfato di magnesio con cinque millilitri della coltura ottenuta durante la notte. Coltivare i batteri a 37 gradi Celsius fino a un OD 600 compreso tra 0,8 e 1,0. Non superare un OD 600 di 1,0.

Diluire il campione prima di effettuare la misurazione sullo spettrofotometro in modo da ottenere un risultato accurato. Conservare in ghiaccio o a quattro gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo o per un massimo di 72 ore. Ora che i batteri sono pronti per l'infezione, è il momento di preparare lo scongelamento del fago.

I massimi placche estratte con Lambda Packaging vanno tenute sul ghiaccio. Utilizzando un tubo per ogni reazione di ligazione, lo scongelamento richiederà circa da 10 a 15 minuti. Nel frattempo, raffreddare preventivamente un tubo da 1,5 millilitri vuoto sul ghiaccio, utilizzando nuovamente un tubo per ogni reazione.

Dopo il scongelamento degli estratti per il confezionamento di Lambda, trasferire immediatamente 25 microlitri di ciascun estratto in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitro pre-raffreddato e porre sul ghiaccio. Riporre il resto dell'estratto per il confezionamento a meno 80 gradi Celsius. Lasciare gli estratti scongelati sul ghiaccio per troppo tempo ridurrà l'efficienza di infezione.

Successivamente, aggiungere 10 microlitri della reazione di ligazione a ciascun volume di 25 microlitri degli estratti scongelati su ghiaccio, miscelando mediante pipettaggio ripetuto senza introdurre bolle d'aria. Centrifugare brevemente per raccogliere tutto il liquido sul fondo delle provette e incubare le reazioni di confezionamento in un bagno d'acqua a 30 °C per 90 minuti. Dopo 80 minuti di incubazione, scongelare il resto dell'estratto di confezionamento su ghiaccio.

Al termine della reazione di confezionamento della durata di 90 minuti, aggiungere ai tubi di reazione i rimanenti 25 microlitri di estratto per il confezionamento. Incubare le reazioni per ulteriori 90 minuti a 30 gradi Celsius. Al termine della seconda incubazione, aggiungere 100 microlitri del tampone di diluizione del fago preparato in ciascun tubo di confezionamento e mescolare delicatamente; quindi aggiungere cinque microlitri di cloroformio a ciascun tubo.

Ora si dovrebbe avere un volume totale di 165 microlitri nel tubo. Un precipitato viscoso può formarsi dopo l'aggiunta del cloroformio. Evitare questo precipitato, così come la fase organica di cloroformio, durante la pipettaggio delle particelle fagiche.

A questo punto, se necessario, è possibile conservare le particelle fagiche impacchettate a quattro gradi per diversi giorni, ma per ottenere i migliori risultati si consiglia di utilizzare fagi appena preparati. Ora siete pronti per infettare le cellule ospiti, che avete coltivato durante i passaggi di impacchettamento del fago, con il fago impacchettato. Aggiungere il fago impacchettato a cellule ospiti resistenti EPI 300 T1 con un OD a 600 compreso tra 0,8 e 1,0, nel rapporto di 400 microlitri di cellule resistenti EPI 300 T1 per ogni 10 microlitri di particelle fagiche.

Per evitare di pipettare cloroformio dal fondo del tubo contenente i fagi impacchettati, utilizziamo 125 microlitri di particelle fagiche impacchettate e cinque millilitri di cellule ospiti resistenti epi 300 T1 preparate, mescolando delicatamente e quindi incubando a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Il passaggio successivo consiste nel determinare il titolo dei fagi impacchettati. Questo si ottiene seminando i batteri infettati su un mezzo di coltura per selezionare le cellule infettate.

Quindi conta le colonie risultanti e dividi per il volume di fago aggiunto ai batteri che hai seminato. Il C one SMID contiene un gene di resistenza al cloramfenicolo. Per selezionare le clone infette, semina i batteri su piastre LB contenenti cloramfenicolo.

Spargere due volte 50 microlitri e due volte 10 microlitri di cellule resistenti a EPI 300 T1 infettate con fago su quattro piastre separate e posizionare le piastre capovolte in un incubatore a 37 gradi Celsius per 16-24 ore, non più di 48 ore, fino alla formazione di colonie. Nel frattempo, raccogliere le cellule residue resistenti a EPI 300 T1 dal campione di infezione da cinque millilitri mediante centrifugazione a 3.500 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il soprannatante.

Aggiungere un millilitro di LB con il 20% di glicerolo al tubo per la risospensione. Sospendere il pellet cellulare e aliquote di 100 microlitri ciascuna in provette criogeniche da due millilitri, congelare immediatamente e conservare a meno 80 gradi Celsius. Per un uso successivo nel passaggio di selezione delle colonie il giorno seguente, contare il numero di cloni sulle quattro piastre nell'incubatore a 37 gradi Celsius e determinare il titolo del fago impacchettato, che verrà utilizzato nel passaggio successivo.

La coltura glicerolata resistente di EPI 300 T congelata contiene cellule transdotte con tutti i diversi plasmidi della tua libreria. Successivamente, distribuisci una quantità appropriata in base al titolo virale e alle dimensioni della piastra di ciascun smid. Clona su un quadrato di 2,45 per 2,45 millimetri.

Piastre per saggio biologico di LB con cloramfenicolo utilizzando perline di vetro. Aggiungere anche una piccola quantità di brodo LB alla piastra per distribuire le cellule in modo uniforme. Tenere presente che la preparazione del ceppo glicerolato concentra ulteriormente le cellule di circa cinque volte.

Incubare a 37 gradi Celsius per 24 ore nei giorni della selezione delle colonie; preparare 96 o 3 piastre da 84 pozzetti riempiti con 200 microlitri o 70 microlitri per pozzetto di brodo LB, integrato con 12,5 microgrammi di cloramfenicolo per millilitro di brodo per la selezione antibiotica e con il 10% di glicerolo per il congelamento. Per questo passaggio utilizziamo il sistema automatico di riempimento piastre qfi tre.

Il passo successivo consiste nel selezionare le colonie dalle piastre LB CHLORAMPHENICOL preparate e trasferirle nelle piastre da 96 o 384 pozzetti precedentemente preparate per il congelamento. Per questo passaggio, utilizziamo il robot per il prelievo dei cloni qix two, seguendo il manuale dell'utente, al fine di creare un ambiente sterile intorno all'area di prelievo dei cloni. Accendere la lampada UV per 30 minuti mentre la luce UV è attiva.

Preparare 500 millilitri di ipoclorito al 1%, 500 millilitri di acqua deionizzata sterile e 500 millilitri di etanolo all'80%. Quando la luce UV si spegne, riempire i vassoi nell'ordine indicato, da quello posteriore a quello anteriore. Versare prima l'ipoclorito al 1%, poi l'acqua deionizzata sterilizzata in autoclave e infine l'etanolo all'80% nel vassoio anteriore.

Assicurarsi che siano pieni, poiché gli aghi per il picking non possono essere lavati correttamente senza una quantità sufficiente di soluzione di lavaggio. Dopo aver impostato i parametri per un picking ottimale, rimuovere i coperchi dalle piastre batteriche e dalle piastre da 96 o 384 pozzetti riempite con LB e posizionarle tra i supporti del Q picks. Le piastre dell'area di lavoro devono essere ben aderenti all'angolo anteriore destro in modo da non muoversi durante il picking.

Quindi chiudere il pannello anteriore. Una volta impostati tutti i parametri, può iniziare la procedura di selezione. Al termine di tutta l'operazione di selezione, sciacquare le spazzole e i vassoi con acqua deionizzata e lasciarli asciugare sul banco.

Pulire eventuali versamenti e pulire l'interno del CICS con etanolo al 80%. Assicurarsi che tutte le piastre con stock glicerolo siano etichettate e posizionarle nell'incubatore a 37 gradi Celsius per 24 ore per far crescere una coltura da ciascuna colonia isolata. Lasciare un appunto sull'incubatore contenente la data, il numero di piastre incubate, l'ora di inizio dell'incubazione, l'ora di rimozione e le proprie iniziali.

Dopo l'incubazione, si ottiene la propria libreria. Ogni pozzetto contiene una coltura di un clone batterico con il PCC, in cui un frammento di DNA frammentato del campione iniziale è stato ligato a un singolo smid. Congelare le piastre a meno 80 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine e congratularsi per il lavoro ben fatto.

Il protocollo presentato descrive la procedura per generare una libreria ambientale di SMID al fine di catturare il contenuto genetico di una comunità microbica in un determinato habitat. Questo protocollo dovrebbe produrre una libreria SMID rappresentativa del contenuto genetico dell'ambiente campionato e dovrebbe permettere al lettore di ottimizzare i passaggi critici. Se la quantità di cloni FO SMID ottenuti al termine dell'intera procedura è troppo bassa.

Vi abbiamo appena mostrato come costruire la libreria FO SMID a partire dal DNA genomico ottenuto da un campione d'acqua marina. Quando si esegue questa procedura, è importante iniziare con DNA genomico di alta qualità. Preparare in anticipo tutte le piastre e i reagenti e pianificare abbastanza tempo per questo processo articolato in più passaggi.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.