Name: Inserire grande Ambientale Genomic Produzione Biblioteca (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 59 s
Description: Scopri come costruire una libreria fosmidica ambientale di grandi inserti per studiare la struttura e il metabolismo delle comunità microbiche marine. Questo metodo consente l'analisi funzionale e il sequenziamento del DNA genomico.

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Vorremmo ringraziare la Fondazione canadese per l&#39;innovazione, la British Columbia Fondo di conoscenza per lo sviluppo e la Nazionale di Scienze e Ingegneria Research Council (NSERC) del Canada per sostenere gli studi in corso sulle regioni di scarsità di ossigeno delle acque costiere oceaniche e aperto. MT e SL erano supportati da borse di studio del Centro TULA fondazione finanziata per la diversità microbica e Evolution (CMDE). MT inoltre ricevuto il sostegno borsa di studio della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

<ol><li>Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seawater+sampling+and%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Seawater sampling and.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+volume+%2820L%2B%29+filtration+of+coastal+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples.</a> J Vis Exp. 28, (2009).</li>
<li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Extraction+from+0.22+%CE%BCM+Sterivex+Filters+and+Cesium+Chloride+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation.</a> J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).</li>
<li>Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+uncultivated+prokaryotes%3A+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).</li>
<li>Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).</li>
<li>DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+Ocean%27s+interior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean's interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li>
<li>Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+methanogenesis%3A+testing+the+hypothesis+with+environmental+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics.</a> Science. 305, 1457-1462 (2004).</li>
</ol>

Una procedura viene descritto come generare più efficiente un grande inserto biblioteca fosmid con il DNA genomico derivato da un campione d&#39;acqua costiere. A monte di estrazione del DNA genomico è descritta in un protocollo separato [3]. Mentre il fosmid-libreria di produzione è un processo multistep, piano di almeno due o tre settimane, in tempo per l&#39;intera procedura compresi tutti i passaggi quattro presentati. L&#39;estrazione del DNA genomico è il passo più importante e tutte l...

<table><tbody><tr><td>&lt;forte&gt;Passaggio II&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CopyControl&amp;#8482; Kit per la Produzione di Librerie di Fosmidi</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>CCFOS110</td><td>sufficiente a generare 9-10 librerie di fosmidi</td></tr><tr><td>SeaPlaque Agarosio</td><td>Cambrex</td><td>50100</td><td></td></tr><tr><td>piastra magnetica riscaldata</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di corsa TAE 1,0X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema di elettroforesi in campo pulsato CHEF Mapper XA, comprensivo di modulo di raffreddamento e pompa a velocità variabile</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;#955; Digestione con DNA-HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>N3012S</td><td></td></tr><tr><td>Marcatore MidRange I PFG</td><td>New England Biolabs</td><td>N3551S</td><td></td></tr><tr><td>10.000X SYBR Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>pellicola di plastica microondeabile</td><td>Saran wrap premium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transilluminatore Safe Imager</td><td>Invitrogen</td><td>S37102</td><td></td></tr><tr><td>Preparazione GELase per la digestione di gel di agarosio</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>G09100</td><td></td></tr><tr><td>bisturi</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>Unità filtrante centrifuga Amicon Ultra-4 con membrana Ultracel-10</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Microcon YM-30 Unità filtrante centrifuga </td><td>EMD Millipore</td><td>42410</td><td></td></tr><tr><td>acqua priva di nucleasi</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Kit Quant-iT PicoGreen per saggio di DNA ds *2000 saggi*#</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>termoblocco digitale secco</td><td>VWR international</td><td>12621-088</td><td></td></tr><tr><td>bagno termico</td><td>VWR international</td><td>14231-854</td><td></td></tr><tr><td>centrifuga</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Avanti J-E</td><td></td></tr><tr><td>rotore della centrifuga</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>JA 5.3</td><td></td></tr><tr><td>centrifuga da banco</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>tubi per microcentrifuga, 1,7 mL, trasparenti</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>tubi da centrifuga da 15 mL </td><td>Fisher Scientific</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>&lt;forte&gt;Passaggio III&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>brodo LB</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 1426-2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>tampone per la diluizione del fago</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl [pH 8,3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>vials criogenici</td><td>Fisher Scientific</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>&lt;forte&gt;Passaggio IV&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti con coperchio</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003370(3370)</td><td></td></tr><tr><td>Piastra da 384 pozzetti con coperchio</td><td>Fisher Scientific</td><td>07201157(3680)</td><td></td></tr><tr><td>Piastrine di Petri 100 mm di diametro x 15 mm di altezza</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Piastrine di Petri 150 Dia. x 15 mmH</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-14</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm</td><td>VWR international</td><td>CABD351040</td><td></td></tr><tr><td>glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>cloramfenicolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>brodo LB</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 1426-2</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>perle di vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-310-1</td><td></td></tr><tr><td>QFill3</td><td>Genetix</td><td>X3050</td><td></td></tr><tr><td>Candeggina</td><td>Javex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>tubi da centrifuga da 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>QPix colony picker</td><td>Genetix</td><td>QPix2</td><td></td></tr><tr><td>piastrina di selezione (E. coli) </td><td>Genetix</td><td>X4006</td><td></td></tr></tbody></table>

inserire grande ambientale genomic produzione biblioteca

Large Insert Environmental Genomic Library Production

La stragrande maggioranza dei microbi in natura attualmente rimangono inaccessibili ai metodi di coltivazione tradizionali. Negli ultimi dieci anni, la cultura indipendente genomica ambientale (<em&gt; Cioè</em&gt; Metagenomica) approcci sono emersi, consentendo ai ricercatori di colmare questa lacuna coltivazione catturando il contenuto genetico di comunità microbiche indigene direttamente dall&#39;ambiente. A tal fine, le librerie di DNA genomico sono costruiti utilizzando le normali tecniche seppur abile clonazione di laboratorio. Qui si descrive la costruzione di una grande libreria genomica inserimento ambientale fosmid con il DNA derivato dal continuum profondità verticale di un fiordo stagionalmente ipossia. Questo protocollo è direttamente collegato ad una serie di protocolli di collegamento tra il campionamento delle acque costiere marine [1], la filtrazione di grandi volumi di biomassa microbica [2] e una estrazione del DNA e protocollo di purificazione [3]. All&#39;inizio, DNA genomico di alta qualità è fine riparato con la creazione di estremità blunt 5-fosforilata. End-riparato il DNA è sottoposto a campo pulsato elettroforesi su gel (PFGE) per la selezione del formato e l&#39;estrazione del gel viene eseguito per recuperare frammenti di DNA tra i 30 ei 60 mila paia di basi (Kb) di lunghezza. DNA formato selezionato è purificato dalla matrice gel PFGE e legato alla fosfatasi trattati smussato-end fosmid CopyControl vettore pCC1 (Epicentre<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385"&gt; Http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a&gt;). Concatemers lineare di pCC1 e del DNA sono successivamente inserire headfull confezionati in particelle di fago lambda terminase, con successiva infezione dei fagi resistenti<em&gt; E. coli</em&gt; Cellule. Cloni con successo trasdotte sono recuperate su piastre di agar LB con selezione antibiotica e archiviati in formato da 384 pozzetti piastra utilizzando una colonia automatizzato raccolta robot (Qpix2, Genetix). L&#39;attuale protocollo attinge da varie fonti tra cui il CopyControl Kit Produzione Biblioteca Fosmid da Epicentre e le opere pubblicate di gruppi di ricerca multipli [4-7]. Ogni passo è presentato con le migliori pratiche in mente. Quando è possibile si evidenzia sottigliezze in esecuzione di migliorare la qualità e l&#39;efficienza della produzione di biblioteca. L&#39;intero processo di produzione e raccolta biblioteca fosmid colonia automatizzato richiede almeno 7-10 giorni in quanto vi sono molti passaggi di incubazione inclusi. Tuttavia, ci sono diversi punti di sosta possibili, che sono indicati all&#39;interno del protocollo.

Costruzione di una biblioteca con fosmid ambientale DNA genomico isolato dal continuum profondità verticale di un fiordo stagionalmente ipossia è descritto. La biblioteca clone risultante è raccolto in 384 pozzetti e archiviati per il sequenziamento a valle e screening funzionale con l&#39;applicazione di un sistema automatizzato di raccolta colonia.

Inserire grande Ambientale Genomic Produzione Biblioteca

La stragrande maggioranza dei microbi presenti in natura rimane attualmente inaccessibile ai metodi di coltivazione tradizionali. Negli ultimi dieci anni, i metodi indipendenti dalla coltura...

Ciao, sono Marcus del laboratorio di Steven Helm del Dipartimento di Microbiologia e Immunologia dell'Università della British Columbia. Oggi vi mostreremo un procedimento per la costruzione di una libreria ambientale con inserto di grandi dimensioni. Assiste nella procedura di oggi San Lee, che eseguirà l'incapsidamento fagico e l'infezione dell'ospite della libreria e coli, insieme a Elise Hawley e Chin Yang, che si occuperanno della selezione delle colonie.Abbiamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare la struttura e il metabolismo della comunità microbica in ambienti marini e terrestri. Cominciamo dunque. Questo protocollo per la creazione di una libreria di DNA fo smid inizia dopo l'isolamento e la frammentazione del DNA genomico da campioni di biomassa, procedure che abbiamo descritto dettagliatamente in articoli JoVE correlati.I prossimi passaggi preparano il DNA SHE per la ligazione nel vettore SMID PCC one. Il primo passaggio consiste nel riparare le estremità dei frammenti di DNA SHE e nella loro fosforilazione. Per le estremità 5', tutti i reagenti necessari per questo passaggio sono inclusi nel kit per la produzione di librerie PCC one SMID di Epicenter

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Su larga scala Schermi di librerie metagenomiche

Qui si descrive un metodo per la preparazione di entrambi i singoli letti e associato fine Illumina mRNA-Seq librerie sequenziamento per l'analisi di espressione genica basata su amplificazione lineare dell'RNA T7. Questo protocollo richiede solo 10 nanogrammi di RNA totale di partenza e genera librerie altamente coerente rappresentanza trascrizioni intero.

Leggi singolo e accoppiamento finale mRNA-Seq Biblioteche Illumina da 10 nanogrammi di RNA totale

Il test del reporter genetico è uno strumento consolidato e potente per sezionare la relazione tra le sequenze di DNA e le loro attività di regolazione genica. L'accoppiamento di elementi regolatori candidati a geni reporter che trasportano tag di sequenza identificativi consente una massiccia parallelizzazione di questi saggi.

Saggi Reporter massicciamente parallelo in cellule di mammifero in coltura

Questo manoscritto descrive un approccio automatizzato di selezione delle dimensioni del gel per purificare i frammenti di DNA per il sequenziamento di nuova generazione. La tecnologia Ranger fornisce l'automazione completa dell'intero processo di caricamento del gel di agarosio, analisi elettroforetica e recupero di frammenti di DNA mirati, consentendo librerie di sequenziamento di nuova generazione ad alta produttività e di alta qualità.

Automated Gel Selection Size per migliorare la qualità delle Biblioteche di sequenziamento di nuova generazione Preparato da campioni di acqua ambientale

Metodi per la generazione di librerie di gRNA su larga scala dovrebbero essere semplice, efficiente e conveniente. Descriviamo un protocollo per la produzione di gRNA librerie basate su digestione enzimatica del DNA bersaglio. Questo metodo, CORALINA (generazione della libreria completa gRNA attraverso attività controllata nucleasi) presenta un'alternativa alla sintesi del oligonucleotide personalizzato costosi.

Un protocollo universale per gRNA su larga scala produzione di libreria da qualsiasi fonte di DNA

Utilizzando un vettore binario pBIBAC-GW rende generando piante transgeniche con inserimenti di singola copia intatti, un processo facile. Qui, una serie di protocolli è presentata che guida il lettore attraverso il processo di generazione di piante transgeniche di Arabidopsis e prova le piante per integrità e copiare il numero degli inserti.

Generazione di piante transgeniche con inserimenti di copia singola utilizzando il vettore binario BIBAC-GW

Descriviamo un metodo per generare librerie mutanti trasposoni saturanti nei batteri Gram-negativi e la successiva preparazione di librerie di amplicone di DNA per il sequenziamento ad alto rendimento. Ad esempio, ci concentriamo sull'agente patogeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii, ma questo protocollo è summostico per una vasta gamma di organismi Gram-negativi.

Generazione di librerie di inserimento transposon in batteri Gram-Negativi per il sequenziamento ad alta velocità effettiva

Questo protocollo descrive un approccio completo per la coltura, il sequenziamento e l'assemblaggio del genoma ibrido de novo dei batteri urinari. Fornisce una procedura riproducibile per la generazione di sequenze genomiche circolari complete utili nello studio di elementi genetici sia cromosomici che extracromosomiali che contribuiscono alla colonizzazione urinaria, alla patogenesi e alla diffusione della resistenza antimicrobica.

Assemblaggio di genoma ibrido De Novo per la generazione di genomi completi di batteri urinari utilizzando tecnologie di sequenziamento a lettura breve e lunga

La mutagenesi inserzionale è uno strumento essenziale nella genetica avanzata per identificare gli elementi genomici funzionali. Qui, descriviamo l'Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), un metodo per rilevare i siti di integrazione dei lentivirus all'interno di una libreria di cellule di mutagenesi inserzionale basata su lentivirus.

Identificazione di siti di integrazione di lentivirus funzionalmente rilevanti in una libreria di cellule di mutagenesi inserzionale

Questo protocollo fornisce un metodo per l'ottimizzazione globale sistematica di biosensori geneticamente codificati attraverso la generazione e la valutazione di librerie genetiche assistite dall'automazione. A ciò si aggiungono metodologie di progettazione dell'esperimento per semplificare la sperimentazione e consentire la selezione di componenti genetici per regolare i biosensori in base a risultati di progettazione specifici.

Campionamento efficiente dello spazio di progettazione di biosensori geneticamente codificati grazie alla progettazione di esperimenti e al flusso di lavoro di automazione

Questo studio presenta un protocollo multioma spaziale Trekker–CUT&amp;Tag che combina il codice a barre spaziale diretto di una sezione tissutale con l'analisi multioma a singola cellula. Questo approccio consente contemporaneamente la profilazione spaziale dell'espressione genica a singola cellula e la modifica dell'istone H3K27ac, offrendo intuizioni meccanicistiche sulla regolazione genica nel contesto della microanatomia tissutale.

Profilazione multiomica integrata a singola singola e risolta spazialmente del trascricroma e dei bersagli epigenomici nelle sezioni di tessuto congelato

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