Name: Monitoraggio Dinamica di attecchimento muscolare nei piccoli animali da In Vivo Fluorescente Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Scopri un protocollo di imaging fluorescente in vivo per monitorare la rigenerazione muscolare utilizzando mioblasti GFP in topi. Questo metodo consente studi longitudinali sull'attecchimento cellulare.

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Il lavoro di Z e Y Wang Yang è stato reso possibile da concedere K02 AR051181 da NIAMS / NIH, borse di studio da Distrofia muscolare e della Harvard Stem Cell Institute per Y Wang. Il lavoro di Zeng Q e X Xu sono supportati da una sovvenzione del programma assegnato al Laboratorio di Imaging Ottico dal Brigham e l&#39;ospedale delle donne. Gli autori desiderano ringraziare Liu Wen dal Dipartimento di Anestesia, BWH, per un aiuto tecnico al lavoro delle cellule.

Preparazione delle cellule <ol><li> Cella di isolamento satellitare <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Sotto anestesia, i muscoli degli arti di topi transgenici GFP (C57BL / Ka-βactin-EGFP) vengono rimossi. Dopo aver tagliato in piccoli pezzi, le cellule satellite sono dissociato enzimaticamente tramite l&#39;incubazione del tessuto macinato con una soluzione di collagenasi dispasi al 2% per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Neutralizzare la digestione enzimatica con i media di crescita contenente Ham F-10 e il 20% FBS, dissociare il muscolo da triturazione ripetuto con una pipetta Pasteur. Le cellule vengono filtrati attraverso un colino cella (ø70-100μm) e poi placcato in maniera non rivestito piatto per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Rimuovere delicatamente il supernatante e la piastra su un piatto rivestito di collagene. Ripetere questa 1 ora passo successivo, per purificare il mioblasti. (Pre-piastra) </li><li> Cambiare il supporto e la piastra delle cellule nel tempo. I mioblasti finale purificato sono coltivate in terreno contenente Ham F-10, 20% FBS, 100 U / ml penicillina e 100 mg / ml di streptomicina (mezzo di coltura) a 37 ° C con 5% di CO2, l&#39;aria del 95%. </li></ol> </li><li> Cultura ed espandere la mioblasti primari nel terreno di coltura con aggiunta di FGF base di 10 ng / ml. </li><li> Per tutti gli esperimenti in vivo, abbiamo iniettare 5x10 5 cellule muscolari per TA. </li><li> Durante la raccolta del mioblasti, si staccano le cellule utilizzando 0,25% tripsina / EDTA e lavate con PBS due volte. I numeri di cellulare vengono contati con un emocitometro e le cellule sono risospese in HBSS ad una concentrazione di 5x10 4 cellule / ml. Le cellule concentrate in HBSS sono immessi sul ghiaccio e iniettata entro 1 ora dopo la raccolta. </li></ol> Imaging in vivo <ol><li> Maschio topi mdx all&#39;età di 4-6 settimane sono acquistati da Jackson laboratorio e mantenuto in un impianto di stabulazione degli animali. </li><li> Dopo circa una settimana di alloggio per l&#39;ambiente, i topi sono pronti per essere impiantati con le cellule in coltura. </li><li> Prima del trapianto delle cellule, il mouse è anestetizzato da una intraperitoneale (ip) iniezione della miscela di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Poi i capelli intorno alla zona del muscolo TA viene rimosso applicando Nair alla gamba e in attesa di 30 secondi per pulirlo con acqua distillata. </li><li> Mentre il mouse è ancora sotto anestesia, 5x10 5 celle in HBSS 10μl sono iniettata lentamente in ogni muscolo TA a 3 punti con un ago da 30 gauge. </li><li> Dopo il punto 4, il mouse può essere regolarmente ripreso dal vivo in fluorescenza imaging. La fluorescenza immagini stazione Nightowl LB981 (di Berthold Technologies, Inc.), dotato di alta sensibilità accoppiamento di carica della telecamera, viene utilizzato per ottenere immagini dalla ostacolare zampe dei topi. </li><li> Il giorno di imaging in vivo, per prima cosa controllare la ricrescita dei capelli sul muscolo TA. Se necessario, riapplicare Nair per rimuovere i capelli come sopra descritto, dopo anestetizzare il mouse con la miscela di ketamina e xilazina. </li><li> Mentre il mouse è sotto anestesia, posizioniamo il mouse in posizione prona su un pezzo di nero non fluorescente carta (carta nera Artagain da Strathmore). Per esporre completamente il muscolo TA per immagini migliori, abbiamo nastro le zampe posteriori per la carta. </li><li> Abbiamo posto il mouse nella camera di imaging e la posizione delle gambe posteriori per essere ripreso al centro del campo visivo della telecamera. Per prima cosa cambiare il filtro per le emissioni di prendere un tradizionale scala di grigi dell&#39;immagine fotografica della gamba con un tempo di esposizione di 5 secondi. Regolare la posizione del mouse e messa a fuoco della fotocamera, se necessario. I parametri di imaging compreso il tempo di esposizione (1.250 m), altezza del campione (0,9 cm) ecc, sono mantenute costanti nel processo sperimentale. </li><li> Siamo quindi passare nel filtro emissione appropriati per la lunghezza d&#39;onda proteina fluorescente verde. Prendiamo l&#39;immagine di fluorescenza con un tempo di esposizione di 1.250 ms e un certo numero di binning 1. Dopo l&#39;imaging, il mouse viene rimosso dalla camera di imaging a una gabbia di aspettare il recupero. </li><li> Per l&#39;analisi, disegniamo una regione di interesse (ROI) oltre i segnali fluorescenti per misurare la loro intensità in termini di fotoni al secondo. Si misura anche la dimensione del ROI in termini di numero di pixel come un altro valore di quantificazione. Gli esperimenti di imaging può essere ripetuta ogni settimana o più frequentemente nel corso di un paio di mesi, se necessario, per acquisire dati longitudinali. </li></ol> Alla fine degli esperimenti, il mouse è eutanasia e il muscolo TA viene raccolto per l&#39;analisi istologica.

<ol><li>Ballou, B., Ernst, L. A., Waggoner, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+tumors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of tumors in vivo.</a> Curr Med Chem. 12, 795-805 (2005).</li>
<li>Green, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Godavarty, A., Sevick-Muraca, E. M., Eppstein, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fluorescence+lifetime+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Phys%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fluorescence lifetime tomography.</a> Med Phys. 32, 992-1000 (2005).</li>
<li>Graves, E. E., Weissleder, R., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+molecular+imaging+of+small+animal+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models.</a> Curr Mol Med. 4, 419-430 (2004).</li>
<li>Graves, E. E., Yessayan, D., Turner, G., Weissleder, R., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+in+vivo+fluorochrome+concentrations+measured+using+fluorescence+molecular+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography.</a> J Biomed Opt. 10, 44019-44 (2005).</li>
<li>Gurfinkel, M., Ke, S., Wen, X., Li, C., Sevick-Muraca, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+fluorescence+optical+imaging+and+tomography.+Dis+Markers%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Near-infrared fluorescence optical imaging and tomography. Dis Markers.</a> , 107-121 Forthcoming.</li>
<li>Lee, J., Sevick-Muraca, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fluorescence+enhanced+optical+tomography+using+referenced+frequency-domain+photon+migration+measurements+at+emission+and+excitation+wavelengths%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+Soc+Am+A+Opt+Image+Sci+Vis%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fluorescence enhanced optical tomography using referenced frequency-domain photon migration measurements at emission and excitation wavelengths.</a> J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 19, 759-771 (2002).</li>
<li>In vivo fluorescence imaging of muscle regeneration by transplanted eGFP-labeled myoblasts. Xu, X., Yang, Z., Liu, Q., Wang, Y. Annual Meeting of American Society of Gene Therapy, 2008 May 28-June 1, Boston, Ma, , American Society of Gene & Cell Therapy. Milwaukee, WI. (1985).</li>
<li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cell+biology+of+cancer+cells+visualized+with+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo cell biology of cancer cells visualized with fluorescent proteins.</a> Curr Top Dev Biol. 70, 121-144 (2005).</li>
<li>Coulton, G. R., Morgan, J. E., Partridge, T. A., Sloper, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mdx+mouse+skeletal+muscle+myopathy%3A+I.+A+histological%2C+morphometric+and+biochemical+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol+Appl+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 53-70 (1988).</li>
<li>Morgan, J. E., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle satellite cells.</a> Int J Biochem Cell Biol. 35, 1151-116 (2003).</li>
<li>Mendell, J. R., Kissel, J. T., Amato, A. A., King, W., Signore, L., Prior, T. W., Sahenk, Z., Benson, S., McAndrew, P. E., Rice, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblast+transfer+in+the+treatment+of+Duchenne%27s+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Myoblast transfer in the treatment of Duchenne's muscular dystrophy.</a> N Engl J Med. 333, 832-838 (1995).</li>
<li>Bogdanovich, S., Perkins, K. J., Krag, T. O., Khurana, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutics+for+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+current+approaches+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutics for Duchenne muscular dystrophy: current approaches and future directions.</a> J Mol Med. 82, 102-115 (2004).</li>
<li>Morgan, J. E., Coulton, G. R., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdx+muscle+grafts+retain+the+mdx+phenotype+in+normal+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Mdx muscle grafts retain the mdx phenotype in normal hosts.</a> Muscle Nerve. 12, 401-409 (1989).</li>
<li>Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+skeletal+muscle+contributions+from+circulating+cells%2C+bone+marrow+cells%2C+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells. 22, 1292-1304 (2004).</li>
<li>Cerletti, M., Jurga, S., Witczak, C. A., Hirshman, M. F., Shadrach, J. L., Goodyear, L. J., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient%2C+functional+engraftment+of+skeletal+muscle+stem+cells+in+dystrophic+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles.</a> Cell. 134, 37-47 (2008).</li>
</ol>

Abbiamo creato una piattaforma di imaging affidabile e stabile per il monitoraggio delle cellule trapiantate fluorescenza etichettati nel muscolo scheletrico ospitare in questo studio. GFP-etichettata da GFP mioblasti di topo transgenico cavalletti di un tipo di cellule staminali adulte che saranno candidati per la terapia cellulare per il futuro. Una manipolazione costante tra cui il numero delle cellule, l&#39;iniezione di cellule, sfondo chiaro, la posizione delle immagini e dei parametri della macchina è importante per ottenere immagini di alta qualità e soprattutto per l&#39;analisi quantitativa. Fluorescenza imaging ha numerose applicazioni nel campo della ricerca biomedica in quanto non è invasiva, facile da usare, ed ha un throughput elevato. Inoltre l&#39;imaging di fluorescenza in grado di fornire una misura quantitativa basata sulla conta fotone, anche se a causa della attenuazione dispersione e l&#39;assorbimento, la luce non può penetrare una grande distanza nel tessuto, che è una lacuna della tecnica. Gli sforzi sono in corso per usare giornalista rosso o vicino infrarosso per aumentare la profondità di penetrazione della luce. Un altro vantaggio di imaging di fluorescenza è che è traducibile alle cliniche se il giornalista specifico fluorescente è omologato per uso umano. Rispetto al MRI, CT, PET e, fluorescenza imaging ha un&#39;elevata flessibilità in quanto non richiedono hardware costosi e gli agenti di imaging. Un esempio è fluorescenza a base di endoscopio e micro-endoscopio che sono stati utilizzati nelle cliniche. Grazie alla combinazione di imaging di fluorescenza con altre modalità, ci aspettiamo di raggiungere la capacità di acquisire informazioni sia anatomiche e funzionali sui processi biologici sottostanti.

<table><tbody><tr><td>NightOwl LB981</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

monitoraggio dinamica di attecchimento muscolare nei piccoli animali da in vivo fluorescente imaging

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Distrofie muscolari sono un gruppo di malattie muscolari degenerative caratterizzata dalla progressiva perdita di cellule muscolari contrattili. Attualmente, non esiste alcuna cura disponibile. I recenti progressi nella biologia delle cellule staminali hanno generato nuove speranze per lo sviluppo di terapie cellulari basate efficace per il trattamento di queste malattie. Trapianto di vari tipi di cellule staminali etichettati con proteine ​​fluorescenti nei muscoli di modelli animali distrofici è stato utilizzato ampiamente nel settore. Una tecnica non invasiva con la capacità di seguire il destino delle cellule trapiantate longitudinalmente può ulteriormente la nostra capacità di valutare l&#39;attecchimento del trapianto da cellule muscolari trapiantate più accurato ed efficiente. Nel presente studio, abbiamo dimostrato che in vivo l&#39;imaging di fluorescenza è un metodo sensibile e affidabile per il monitoraggio GFP trapiantati (proteina fluorescente verde)-etichettati cellule nei muscoli scheletrici del mouse. Nonostante la preoccupazione di fondo per l&#39;utilizzo di una luce esterna necessaria per l&#39;eccitazione di proteine ​​fluorescenti, abbiamo scoperto che utilizzando il mouse nude o eliminando i capelli con reagenti depilazione molto di questo problema è eliminato. Utilizzando una fotocamera CCD, il segnale fluorescente può essere rilevato nel tibiale anteriore (TA) muscolare dopo l&#39;iniezione di 5 x 10 5 cellule sia da topi transgenici GFP o eGFP trasdotte cultura mioblasti. Per i muscoli più superficiali come l&#39;estensore lungo delle dita (EDL), l&#39;iniezione di un minor numero di cellule produce un segnale rilevabile. Intensità del segnale possono essere misurate e quantificate come il numero di fotoni emessi al secondo in una regione di interesse (ROI). Dal momento che le immagini acquisite mostrano chiari confini che delimitano la zona innestata, la dimensione del ROI può essere misurata come bene. Se le gambe sono posizionate in modo coerente ogni volta, i cambiamenti nel numero totale di fotoni al secondo per muscolare e la dimensione del ROI riflettere le variazioni del numero di cellule trapiantate e le dimensioni della zona innestata. Pertanto, il cambiamento nel muscolo stesso nel corso del tempo sono quantificabili. In vivo tecnica di imaging a fluorescenza è stata utilizzata principalmente per rintracciare la crescita delle cellule tumorogenic, il nostro studio dimostra che è un potente strumento che ci consente di tenere traccia il destino delle cellule staminali trapiantate.

Ci descrivono un<em&gt; In vivo</em&gt; Protocollo di imaging di fluorescenza di monitorare la rigenerazione muscolare GFP-etichettata dopo trapianto di mioblasti scheletrici nei muscoli di topi sani e distrofici. Questo protocollo può essere adattato a studio rigenerazione muscolare da trapianto di altri tipi di cellule e in altre condizioni muscolari così.

Monitoraggio Dinamica di attecchimento muscolare nei piccoli animali da In Vivo Fluorescente Imaging

Le distrofie muscolari sono un gruppo di malattie muscolari degenerative caratterizzate dalla perdita progressiva di cellule muscolari contrattili. Attualmente, non esiste...

Ciao, sono Juwan Ma del Dipartimento di Anestesia del Bergham Women's Hospital di Boston. Oggi vi mostreremo una tecnica per acquisire immagini di fluorescenza in vivo al fine di monitorare l'andamento della rigenerazione muscolare nei topi. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare l'attecchimento delle cellule staminali muscolari trapiantate.Cominciamo. Le cellule marcate con GFP per il trapianto sono isolate e coltivate da topi transgenici GFP. Prima di proseguire, una pressione sul dito del piede conferma che il topo è completamente anestetizzato. I muscoli della zampa posteriore vengono quindi rimossi. In condizioni asettiche, il muscolo viene poi macerato.Le cellule satelliti vengono dissociate incubando il tessuto tritato con una soluzione di collagenasi al 2% a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo l'incubazione, viene aggiunto mezzo di crescita contenente Ham F10 e FBS al 20% per arrestare la digestione enzimatica. I muscoli vengono quindi dissociati mediante ripetute pipettature con una pipetta Pasteur.Successivamente, le cellule vengono filtrate attraverso un filtro cellulare e quindi seminate in una piastra da coltura non rivestita. La piastra viene posta in un incubatore standard per colture cellulari per un'ora. Per separare le cellule satelliti da altre popolazioni cellulari con proprietà adesive più forti, il soprannatante viene travasato su una piastra rivestita di collagene e incubato per un'ulteriore ora.Dopo questo periodo di incubazione, il surnatante arricchito in cellule satelliti risultante viene nuovamente prelevato e applicato su una nuova piastra rivestita di collagene, dove viene coltivato fino all'osservazione di colonie di mioblasti. Questo processo è definito prepl; le cellule vengono passaggiate al raggiungimento di una confluenza cellulare del 60-70%. Una piccola frazione delle cellule viene utilizzata per l'immunocitochimica, con colorazione mediante marcatori delle cellule miogeniche, al fine di verificare la purezza delle cellule muscolari nella coltura.Una volta confermata la purezza delle cellule miogeniche, le cellule vengono espanse nella stessa coltura. Prima del trapianto, le cellule vengono staccate con tripsina al 0,25% N. EDTA, lavate due volte e risospese in HBSS a una concentrazione di cinque volte 10 alla settima cellule per millilitro; 10 microlitri della soluzione cellulare vengono iniettati per ciascun muscolo tibiale anteriore, o muscolo TA.Per l'imaging in vivo, i mioblasti marcati con GFP vengono innanzitutto trapiantati in topi maschi di quattro-sei settimane di età. Il topo viene anestetizzato con chetamina e xilazina, e la procedura ha inizio dopo aver confermato lo stato anestetico. Per ridurre il rumore di fondo, i peli su entrambe le zampe posteriori vengono rimossi applicando una crema depilatoria sulle zampe e attendendo 30 secondi prima di asciugarla.Per l'applicatore con estremit&agrave; in cotone, le zampe vengono quindi strofinate nuovamente con un nuovo applicatore con estremit&agrave; in cotone imbevuto di acqua distillata per rimuovere i residui di narici e peli prima del trapianto delle cellule nel topo. Aspirare prima cinque volte 10 alla cinque cellule in 10 microlitri di HBSS in una siringa Hamilton. Con un ago da 30 gauge, iniettare un numero uguale di cellule in tre posizioni lungo l'asse longitudinale del muscolo TA, nella parte mediale superiore e in quella inferiore.Dopo ogni iniezione, mantenere l'ago per due minuti prima di ritirarlo dal muscolo, al fine di prevenire perdite lungo l'ago. Durante il periodo di attesa, aspirare la stessa quantità di cellule in un'altra siringa e iniettare il muscolo TA controlaterale nello stesso modo. Dopo le iniezioni cellulari, il topo viene immediatamente posizionato in posizione prona su un foglio di carta nera non fluorescente, fissando entrambi i piedi alla carta con la pianta rivolta verso il basso e le gambe divaricate di 90 gradi. Successivamente, il topo viene posizionato nella camera di un night owl, stazione di imaging a fluorescenza LB 981.Dotato di una fotocamera altamente sensibile a accoppiamento di carica, un arto posteriore viene posizionato al centro del campo visivo della fotocamera. Innanzitutto, scattare una tradizionale immagine fotografica in scala di grigi dell'arto. Per iniziare l'acquisizione, si sceglie il filtro di emissione appropriato con una lunghezza d'onda specifica per la proteina fluorescente verde.Acquisire un'immagine con un'esposizione di 1.250 millisecondi, seguita da un'altra con un'esposizione di 500 millisecondi. Rileviamo che un tempo di esposizione più lungo permette la rilevazione di un segnale debole, mentre un'esposizione più breve rivela maggiori dettagli. Dopo aver acquisito un arto posteriore, posizionare l'altro arto posteriore al centro del campo visivo della telecamera e acquisire questo arto nello stesso modo precedentemente illustrato.Per garantire risultati confrontabili, l'altezza del campione deve rimanere invariata. Dopo l'acquisizione delle immagini, il topo viene trasferito nuovamente in una gabbia e il suo recupero dall'anestesia viene monitorato. Ai fini dell'analisi, viene disegnata una regione di interesse sopra i segnali fluorescenti per misurare i fotoni al secondo.Misuriamo inoltre la dimensione della regione di interesse in numero di pixel, ottenendo un ulteriore valore quantitativo; per acquisire dati longitudinali, gli esperimenti di imaging possono essere ripetuti in giorni o settimane diverse secondo necessità. Negli esperimenti, un'immagine fluorescente della zampa posteriore del topo, acquisita nel giorno in cui sono state iniettate le cellule marcate con GFP, ha mostrato un'intensità del segnale elevata. L'intensità del segnale è quindi diminuita al secondo giorno ed è successivamente aumentata fino a stabilizzarsi entro il settimo, quattordicesimo e ventunesimo giorno. Quando queste variazioni della fluorescenza sono state quantificate misurando l'intensità del segnale in fotoni al secondo, abbiamo osservato una marcata riduzione dell'intensità del segnale già un giorno dopo l'iniezione, indicativa di una diminuzione del numero di cellule positive al GFP.Tuttavia, al giorno sette, 14 e 21, l'intensità del segnale era aumentata fino a un livello stabile, indicando che era avvenuta la rigenerazione muscolare. Vi abbiamo appena mostrato come utilizzare l'imaging fluorescente in vivo per monitorare l'andamento della rigenerazione muscolare dopo l'iniezione di cellule marcate con GFP. Utilizzando questo metodo, siamo in grado di studiare la dinamica della rigenerazione muscolare dopo l'iniezione di tutti i tipi di cellule marcate con fluorocromi.Dato che le immagini possono essere acquisite in modo non invasivo a intervalli prestabiliti, è possibile raccogliere dati longitudinali più accurati con un numero ridotto di animali e un carico di lavoro minore. Quando si utilizzano parametri di misurazione fissi, le immagini dello stesso animale nel tempo dovrebbero essere quantitativamente confrontabili. È estremamente importante mantenere una superficie cutanea pulita sopra il muscolo al fine di ridurre il rumore di fondo; è assolutamente essenziale rimuovere tutti i peli che coprono le zampe e pulire accuratamente la zona con bastoncini di cotone o tamponi.E ricordate, non dimenticate di utilizzare ogni volta lo stesso insieme di parametri per garantire coerenza tra tutte le vostre misurazioni. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Monitoraggio non invasivo della dimensione della lesione in un modello murino eterologo di endometriosi

Questo articolo descrive in dettaglio come eseguire la miografia ad impedenza elettrica in vivo (utilizzando array di elettrodi di superficie e ad ago) ed ex vivo (utilizzando una cella dielettrica) sul muscolo gastrocnemio dei roditori. Dimostrerà la tecnica sia nei topi che nei ratti e dettaglierà le modifiche disponibili (cioè animali obesi, cuccioli).

Esecuzione della miografia ad impedenza elettrica in vivo ed ex vivo nei roditori

Scopri un protocollo di imaging fluorescente in vivo per monitorare la rigenerazione muscolare utilizzando mioblasti GFP in topi. Questo metodo consente studi longitudinali sull'attecchimento cellulare.

Monitoraggio Dinamica di attecchimento muscolare nei piccoli animali da In Vivo Fluorescente Imaging

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