Antivegetativa monostrati auto-assemblati su microelettrodi per Biomolecole Patterning

Questa procedura inizia con la fabbricazione di un microelettrodo su un substrato di silicone. Un monostrato autoassemblato di polietilenglicole viene formato sopra il microelettrodo e il substrato per prevenire l'incrostazione dei microtubuli. Quindi vengono preparati i microtubuli marcati con la rumina.

Infine, i microtubuli vengono modellati sugli elettrodi ati mediante elettroforesi. Ciao, sono John Noel del Nana Lab del Dipartimento di Fisica e del Laboratorio di Biomeccanica Molecolare del Dipartimento di Ingegneria Biomedica dell'Università del Texas e m. Sono Wil free Teza del dipartimento di fisica e il direttore del Center Skill Science and Technology presso l'Università del Texas.

E io sono Juan Quang, il direttore del Laboratorio di Biomeccanica Molecolare presso il Dipartimento di Ingegneria Biomedica dell'Università del Texas. Oggi vi mostreremo una procedura per la fabbricazione di micro elettrodi rivestiti con un monostrato autoassemblato non incrostatore. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la palificazione di microtubi mediante elettroforesi.

Quindi iniziamo. Per iniziare, usa un graffietto o un tagliawafer per tagliare i wafer di silicio in pezzi di un centimetro per 1,5 centimetri da utilizzare come substrati. Ora pulisci i substrati mettendoli in un becher con abbastanza acetone da coprirli e sonica per cinque minuti senza lasciare asciugare i substrati.

Sciacquateli con acetone fresco e poi sciacquateli immediatamente di nuovo in isopropanolo e usate l'azoto per asciugarli. Utilizzando la fotolitografia a toni positivi standard o la litografia a fascio di elettroni, fabbricare i micro elettrodi d'oro sui substrati puliti. Quando si progetta la geometria del modello, mantenere il diametro di ciascun modello di elettrodo al di sotto di 100 micron Per garantire la copertura da parte del monostrato autoassemblato trimeth oxy seline o peg Sam del polietilenglicole, includere cuscinetti di contatto posizionati da 300 a 500 micrometri dal modello con una linea di un millimetro che collega il cuscinetto con l'elettrodo.

Dopo lo sviluppo del motivo nello strato di resist, utilizzare una pinzetta per graffiare una linea nel resist dal cuscinetto di contatto al bordo del substrato. Al momento della deposizione del metallo, il graffio consentirà il contatto elettrico tra l'elettrodo e il bordo del substrato. Una camera di deposizione, preferibilmente con due sorgenti, viene utilizzata per depositare lo strato metallico.

Gli elettrodi sono formati dalla deposizione di due nanometri di cromo, seguiti da sei nanometri di oro Senza rompere il vuoto, una micro bilancia a cristalli di quarzo dotata all'interno della camera può essere utilizzata per misurare lo spessore dei film durante la deposizione. Possiamo ora iniziare a preparare il monostrato autoassemblato in una zona ben ventilata, preriscaldare e infornare a 75 gradi Celsius. Preparare la soluzione di purificazione aggiungendo un millilitro di peg selina a 20 millilitri di toluene in un becher di vetro da 250 millilitri.

Mescolare bene pipettando su e giù da cinque a 10 volte e poi mescolando con la pipetta per 30 secondi. Posizionare i campioni di modello nel modello del becher con il lato rivolto verso l'alto, assicurandosi che siano completamente immersi nella soluzione e siano uniformemente distanziati sul fondo del becher. Mettere il bicchiere in forno e cuocerlo per 18-21 ore mentre il Sam si sta formando.

Preparare il controelettrodo depositando un nanometro di cromo seguito da quattro nanometri d'oro su un vetrino di vetro da 22 x 50 millimetri. Il controelettrodo deve essere quasi trasparente con una sfumatura grigio chiaro o rosa. Conservare il controelettrodo rivestito con il lato rivolto verso l'alto in una capsula di Petri per mantenerlo pulito.

Dopo 18-21 ore in forno, togliere il bicchiere dal forno. Il toluene dovrebbe essere evaporato lasciando i campioni del modello in un residuo viscoso di piolo. Aggiungere 20 millilitri di toluene al becher e immergere i campioni per uno o due minuti.

Estrarre i campioni dal becher e sciacquarli con toluene, quindi isopropanolo e infine asciugarli con azoto. A questo punto, i campioni dovrebbero apparire puliti e lo strato Sam dovrebbe essere invisibile ad occhio nudo. I Sam's preparati in questo modo sono utilizzabili per un massimo di due giorni se conservati in condizioni fresche e asciutte.

La formazione di Sam non riuscita provoca un rivestimento di residui torbido o di colore irregolare sulla superficie. Con i Sam preparati, possiamo ora iniziare la polimerizzazione della tubulina in microtubuli. Inizia scongelando la tubulina non marcata e la tubulina r domina e combinale immediatamente con un rapporto di due a uno da non marcato a marcato per ottenere microtubuli luminosi.

Mescolarli bene pipettandoli su e giù più volte. Successivamente, polimerizzare la tubulina per 20-40 minuti in un bagno d'acqua riscaldato a 37 gradi Celsius mentre la tubulina sta polimerizzando. Preparare un tampone Taxol per tubi mescolando 20 micromolari di Taxol con il tampone per tubi.

Mescolare bene pipettando su e giù più volte e agitando vorticamente, quindi posizionare la provetta nel bagno riscaldato a 37 gradi Celsius. Dopo la polimerizzazione, diluire i microtubuli in un tampone caldo pipee Taxol e proteggerli dalla luce. Verificare che la polimerizzazione dei microtubuli sia andata a buon fine e che i microtubuli siano stabili sotto diversi minuti di eccitazione a fluorescenza.

Mediante imaging dei microtubuli preparati con una miscela di scavenging dell'ossigeno con polimerizzazione della tubulina in microtubuli completa. Iniziamo a modellare l'MTS con l'elettroforesi. Per iniziare, taglia un pezzo di nastro biadesivo in strisce sottili posizionandolo su un vetrino e usando una lama di rasoio per tagliare posiziona due strisce di nastro biadesivo sul campione rivestito di Sam modellato, in modo tale che l'elettrodo si trovi tra le strisce con il percorso di collegamento che corre perpendicolare al nastro.

Posizionare il controelettrodo sul nastro biadesivo con il lato metallico a contatto con il nastro in modo che il bordo del campione sporga dal controelettrodo di circa tre millimetri. Tagliare diverse lunghezze di 15 centimetri di filo smaltato di rame isolato e spelare un centimetro di isolamento da entrambe le estremità. Utilizzare una piccola goccia di vernice argentata per fissare un filo all'area dorata esposta del substrato, facendo attenzione a evitare il contatto elettrico con il controelettrodo.

Ora usa la vernice argentata per attaccare un secondo filo al bancone. I fili degli elettrodi fissati con vernice d'argento possono essere ulteriormente fissati ai campioni con nastro adesivo. Quindi, utilizzando una pipetta, introdurre i microtubuli all'immagine di diluizione desiderata con un ingrandimento di 20 x e individuare il modello sul wafer di silicio prima di applicare una tensione.

A causa della profondità della camera di flusso, potrebbero essere necessari obiettivi a lunga distanza di lavoro per visualizzare la superficie superiore della camera di flusso. La distanza dalla superficie del campione alla superficie superiore della camera di flusso è determinata dallo spessore del nastro e dovrebbe essere compresa tra 60 e 100 micrometri. Applicare una tensione fino a un volt e osservare la migrazione dei microtubuli.

Se si desidera l'intrappolamento reversibile dei microtubuli. Utilizzare lo smalto per unghie per sigillare la camera di flusso per evitare la deriva laterale e utilizzare tensioni inferiori fino a circa 0,5 volt. La migrazione può essere tracciata regolando il piano verticale di messa a fuoco del microscopio con le tensioni applicate intorno a 0,9-1,2 volt che i microtubuli localizzano sulle superfici degli elettrodi.

Una tensione più elevata renderà la migrazione più veloce e l'adesione più forte, ma una tensione eccessiva indurrà l'elettrolisi e si depolimerizzerà. Microtubuli, vi abbiamo appena mostrato come preparare i micro elettrodi rivestiti Sam per il patterning MT perché il rivestimento SAM impedisce l'assorbimento dei micro tubuli sui micro elettrodi. Questa procedura può essere utilizzata anche per il patterning reversibile dei microtubuli.

Inoltre, questo processo non si limita solo ai microtubuli, ma può essere utilizzato anche per modellare le biomolecole in generale. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.