Name: Antivegetativa monostrati auto-assemblati su microelettrodi per Biomolecole Patterning (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-25T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Impara a creare monostrati auto-assemblati di polietilenglicole su microelettrodi d'oro per prevenire il biofouling e permettere il patterning nanometrico di biomolecole tramite elettroforesi.

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Riconosciamo Melissa Grunlan per utili discussioni sulla formazione di SAM. Questa ricerca è stata sostenuta in parte dalla Fondazione A. Robert Welch (A-1585).

Preparazione dei reagenti Preparare tampone TUBI (80 TUBI mM, 1 mM MgCl 2, 1mM EGTA, portato a pH 6,8 con KOH). Aliquota e glucosio ossidasi negozio, la catalasi e il glucosio a -70 ° C e taxolo a -20 ° C secondo i protocolli esistenti. 1,2 Aliquotare e tubulina conservare a -70 ° C secondo le istruzioni fornite dal fornitore. Modello microelettrodi Au utilizzando la litografia <ol><li> Tagliare wafer di silicio in 1,5 1 cm &#39;substrati cm usando una scriba o taglierino wafer. Pulire i substrati mettendoli in un bicchiere con acetone sufficiente a coprirli e sonicare per 5 minuti. Senza che i substrati ad asciugare, sciacquare in acetone fresco, poi risciacquare immediatamente in isopropanolo e asciugare con azoto. </li><li> Realizzare microelettrodi Au sui substrati pulita utilizzando le normali, positivo-tono fotolitografia o la litografia a fascio elettronico, a seconda delle dimensioni delle caratteristiche desiderate. 3 Nel progettare la geometria del modello, tenere il diametro di ciascun modello elettrodo inferiore a 100 micron per garantire la copertura del PEG SAM (descritto nella sezione successiva). Includono cuscinetti di contatto (~ 300 mm 2) posizionato 300 a 500 mm dal modello con una linea 1 millimetro di collegare il pad con l&#39;elettrodo (Fig. 1). Posizionare i modelli litografica vicino al centro del supporto per consentire lo spazio intorno al modello per il montaggio della camera di flusso. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1390/1390fig1thumb.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1. Geometria del campione. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1390/1390fig1.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 1. </li><li> Dopo lo sviluppo del modello nel resistere strato, zero una linea nella resistere dal pad di contatto al bordo del substrato con una pinzetta (Fig. 1). Al deposito di metallo, il graffio permetterà il contatto elettrico tra l&#39;elettrodo e il bordo del supporto. Una camera di deposizione, preferibilmente con due fonti, è utilizzato per depositare lo strato di metallo. Gli elettrodi sono formati dalla deposizione di 2 nm di Cr (per adesione) seguito da 6 nm di Au, senza rompere il vuoto. Un cristallo di quarzo microbilancia attrezzata all&#39;interno della camera può essere utilizzato per misurare lo spessore del film durante la deposizione. </li></ol> Preparare la SAM <ol><li> Preriscaldare il forno e in una zona ben ventilata a 75 ° C. Preparare la soluzione silanizzazione con l&#39;aggiunta di 20 ml di toluene in un becher da 250 ml in vetro. Quindi aggiungere 1 mL PEG-silano (5% v / v) al toluene con una pipetta di plastica. Mescolare nel PEG-silano e pipettando su e giù 5 a 10 volte e poi mescolando con la pipetta per 30 secondi. </li><li> Posizionare i campioni fantasia nel bicchiere con il lato rivolto verso l&#39;alto a motivi geometrici, assicurandosi che essi siano completamente immersi nel PEG-silano soluzione toluene e sono distribuiti uniformemente sul fondo del bicchiere. Porre il bicchiere in forno e cuocere 18-21 ore a 75 ° C. Mentre il SAM si sta formando, preparare il controelettrodo (vedi sotto) e assemblare i componenti aggiuntivi necessari per i passaggi rimanenti. </li><li> Dopo 18-21 ore nel forno, il toluene dovrebbe evaporare lasciando i campioni di fantasia in un viscoso PEG-silano residui. Aggiungere 20 mL di toluene al bicchiere e immergere i campioni per 1-2 minuti. Rimuovere i campioni dal bicchiere e sciacquare con toluene, poi isopropanolo, ed infine asciugare con azoto. A questo punto, i campioni devono look pulito e lo strato SAM dovrebbe essere invisibile ad occhio nudo. SAM preparato in questo modo sono utilizzabili fino a due giorni se conservato in luogo fresco e asciutto (25 ° C, umidità moderata). Infruttuoso risultati formazione SAM in un rivestimento nuvoloso o irregolari residui hued sulla superficie. </li></ol> Realizzare il controelettrodo Nella configurazione stessa camera di deposizione utilizzate per la deposizione di microelettrodi, fare un controelettrodo depositando 1 nm di Cr, seguiti da 4 nm di Au su un x 22 50 mm N ° 1 e n ° 0 coprioggetto di vetro. Il controelettrodo dovrebbe essere quasi trasparente con una tinta grigio chiaro o rosa. Conservare il controelettrodo rivestito-side-up in una capsula di Petri per tenerlo pulito. Tubulina polimerizzano in MT <ol><li> Disgelo senza etichetta tubulina e tubulina rodamina e subito si combinano con un rapporto di 1:2 etichettati in modo da non marcata per ottenere brillanti MTS. Mescolare pipettando su e giù parecchie volte. Polimerizzare la tubulina per 20-40 minuti in un bagno d&#39;acqua riscaldata a 37 ° C. La lunghezza del MTs sarà maggiore per i tempi di polimerizzazione più lunghi. Mentre la tubulina è polimerizzazione, preparare una TUBI-taxolo tampone con l&#39;aggiunta di taxolo a 20 mm in una provetta contenente tampone TUBI. Mescolare bene il taxolo pipettando su e giù parecchie volte e vortex, e quindi inserire il tubo nel bagno riscaldato a 37 ° C. Dopo la polimerizzazione, diluire il MT da 1 / 100 nel warm-taxolo PIPES buffer e scudodalla luce. MT preparato in questo modo si allungano nel tempo e bundle, che può essere ridotto di ulteriore diluizione. </li><li> Preparare una miscela di ossigeno scavenging 10x (OS) combinando 30 mL TUBI tampone a freddo (0-4 ° C), 5 ml di 50% 2-mercaptoetanolo, 5 glucosio ossidasi mL, 5 mL catalasi, glucosio e 5 ml. 2 Il glucosio deve essere aggiunto scorso. Mescolare pipettando su e giù per 3-5 volte dopo l&#39;aggiunta di ogni componente. Mettere il composto OS su ghiaccio, ma rimarrà efficace per circa 2 ore. </li><li> Verificare che la polimerizzazione MT ha avuto successo e che le MT sono stabili sotto alcuni minuti di eccitazione di fluorescenza per immagini la MT preparato con la miscela 1x OS. Per l&#39;imaging L&#39;UST preparato in questo modo, assicurarsi di utilizzare una eccitazione / emissione combinazione di filtri adatti per fluorescenza rodamina. Determinare la diluizione di lavoro ottimale per i filamenti singoli di imaging mediante ulteriori diluizioni MTS di 1 / 10 a 1 / 100 con tampone TUBI e imaging con mix 1x OS. </li><li> Preparare una camera di flusso da sandwich una grande (22 x 50 mm) e piccolo (22 x 22 mm) coprioggetto di vetro con due pezzi di nastro biadesivo messo 2-3 mm. Il nastro può essere facilmente tagliata a strisce mettendolo su un vetrino e il taglio con una lama di rasoio. Introdurre un microlitri alcuni di MTS nella cella di flusso utilizzando una micropipetta. Per l&#39;imaging ad alto ingrandimento, obiettivi a lunga distanza di lavoro può essere richiesto per l&#39;imaging della superficie superiore della camera di flusso. La distanza dal coprioggetto / superficie del campione alla superficie superiore della camera di flusso è determinata dallo spessore del nastro e dovrebbe essere 60-100 mm. </li></ol> Modello MT mediante elettroforesi <ol><li> Preparare una camera di elettroforesi mettendo due sottili strisce di nastro biadesivo in tutto il campione fantasia, SAM rivestite in modo che l&#39;elettrodo è tra le strisce con il percorso di collegamento perpendicolari al nastro (Fig. 2). Posizionare il controelettrodo sul nastro biadesivo con la parte metallica tocca il nastro in modo che il bordo del campione sovrasta il controelettrodo di circa 3 mm (Fig. 2). Diverse lunghezze di taglio 15 cm di filo di rame isolato magnete e nastri 1 cm l&#39;isolamento fuori di entrambe le estremità. Collegare un filo alla zona esposta Au del supporto con una piccola goccia di vernice argento avendo cura di evitare il contatto elettrico con il controelettrodo (questo può essere controllato con un multimetro). Collegare un secondo filo al controelettrodo con vernice argento. Fili attaccati con vernice argento può essere ulteriormente assicurata ai campioni con del nastro adesivo. <img src="/files/ftp_upload/1390/1390fig2thumb.jpg" border="0" alt="figura 2" /> Figura 2. Celle di assemblaggio di flusso per un microscopio invertito a fluorescenza. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1390/1390fig2.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 2. </li><li> Introdurre MTs alla diluizione desiderata utilizzando tampone TUBI combinato con OS a 1x concentrazione finale. Immagine a 20X di ingrandimento e individuare il motivo sul wafer di silicio prima di applicare una tensione. In alternativa, la camera di flusso può essere sigillati con smalto per evitare il flusso del fluido e la migrazione MT nel piano della camera di flusso. </li><li> Applicare una tensione fino a 1 V e osservare la migrazione di MTS. Tensioni più basse (fino a circa 0,5 V) possono essere utilizzati se cattura reversibile di MTS è desiderato, ma questo richiede di tenuta della camera di flusso per evitare la dispersione laterale. Smalto funziona bene per sigillare le estremità aperte della camera di flusso. A tensioni di sopra di circa 0,7 V, alcuni adesione MT può essere visto sul modello, anche se sarà debole. A tensioni di sopra di circa 0,9 V, la migrazione MT sarà più veloce, e l&#39;adesione sarà più forte. Sopra circa 1,2 V la probabilità di indurre elettrolisi (formazione di bolle di gas) ed anche per distruggere il microelettrodi aumenta in modo significativo. La migrazione può essere rintracciato regolando il piano verticale di messa a fuoco del microscopio. Se eseguita correttamente, l&#39;UST si localizza alle superfici degli elettrodi. </li></ol>

<ol><li>Tubulin Polymerization with GTP/GMPCPP/Taxol [Internet]. , Harvard University. Cambridge, Ma. Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/poly.html">http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/poly.html</a> (2009).</li>
<li>Flow Cell Assays with Microtubules: Motility/Dynamics [Internet]. , Harvard University. Cambridge, Ma. Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/flowcell.html">http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/flowcell.html</a> (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Handbook+of+Microlithography%2C+Micromachining%2C+and+Microfabrication%3A+Microlithography%22">Handbook of Microlithography, Micromachining, and Microfabrication: Microlithography</a>. Rai-Choudhury, P. , SPIE Press. Bellingham, WA. (1997).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

La migrazione di MTS è facilmente visualizzabile usando la microscopia a fluorescenza per la loro luminosità e la fluorescenza di fondo basso. Il metodo è generalmente applicabile a patterning biomolecole, in quanto richiede solo che il biomolecole essere indotto a portare un onere netto di regolazione adeguata del pH del buffer. Elettroosmosi è evitato in questa configurazione perché non ci sono superfici di carico, come le pareti di silice utilizzata in elettroforesi capillare. Diverse mod...

N. 1 vetro borosilicato coprioggetto (22 x 50 mm) sono stati acquistati da VWR. Lucido elettronica grado di tipo p &lt;111&gt; wafer di silicio sono stati acquistati da Addison Engineering, Inc. ad elevata purezza vernice argento è stato ottenuto da Struttura Probe, Inc. (Catalogo # 5001 AB). Isolati calibro sottile filo di rame magnete (~ 0,08 mm (0.003) diametro) è disponibile presso le imprese di fornitura elettronica.

antivegetativa monostrati auto-assemblati su microelettrodi per biomolecole patterning

Antifouling Self-assembled Monolayers on Microelectrodes for Patterning Biomolecules

Vi presentiamo una procedura per la formazione di un poli (glicole etilenico) (PEG) trimetossisilano monostrato auto-assemblato (SAM) su un substrato di silicio con microelettrodi d&#39;oro. Il PEG-SAM si forma in un passo unico assembly ed evita biofouling sulle superfici di silicio e oro. La SAM è utilizzato per microelettrodi cappotto fantasia con lo standard, positivo-tono litografia. Utilizzando il microtubulo come esempio, si applica una tensione continua di indurre la migrazione elettroforetica al SAM-elettrodo rivestito in modo reversibile. Una camera di flusso viene utilizzato per l&#39;imaging e la migrazione elettroforetica patterning microtubuli<em&gt; In situ</em&gt; Usando la microscopia in epifluorescenza. Questo metodo è generalmente applicabile a patterning biomolecole, in quanto impiega l&#39;elettroforesi per immobilizzare molecole bersaglio e quindi non richiede specifiche interazioni molecolari. Inoltre, evita i problemi incontrati nel tentativo di modello le molecole SAM direttamente utilizzando tecniche litografiche. La compatibilità con la litografia a fascio elettronico permette a questo metodo da utilizzare per biomolecole modello su scala nanometrica.

Vi presentiamo una procedura per la formazione di un poli (glicole etilenico) auto-assemblati monostrato (PEG-SAM) su un substrato di silicio con microelettrodi d&#39;oro. Il PEG-SAM è formato in un unico passaggio ed evita biofouling sulle superfici di silicio e oro. Elettroforesi viene quindi utilizzato per biomolecole patterning fino alla scala nanometrica.

Antivegetativa monostrati auto-assemblati su microelettrodi per Biomolecole Patterning

Presentiamo una procedura per la formazione di un monostrato autoassemblato (SAM) di trimetossisilano di poli(etilenglicole) (PEG) su un substrato di silicio con oro...

Questa procedura inizia con la fabbricazione di un microelettrodo su un substrato di silicone. Viene formato un monolivello autoassemblato di polietilene glicole sul microelettrodo e sul substrato per prevenire l'incrostazione da microtubuli. Successivamente vengono preparati microtubuli marcati con rumina.Infine, i microtubuli vengono disposti sugli elettrodi trattati mediante elettroforesi. Ciao, sono John Noel del Nana Lab del Dipartimento di Fisica e del Laboratorio di Biomeccanica Molecolare del Dipartimento di Ingegneria Biomedica della Texas A&M University. Sono Wil free Teza del Dipartimento di Fisica e direttore del Center Skill Science and Technology della Texas A&M University.E io sono Juan Quang, direttore del Laboratorio di Biomeccanica Molecolare del Dipartimento di Ingegneria Biomedica della Texas A&M University. Oggi vi mostreremo un procedimento per la fabbricazione di microelettrodi rivestiti con un monolivello autoassemblato non aderente. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare il palleggio di microtubi mediante elettroforesi.Iniziamo. Per cominciare, utilizzare uno scriba o un taglierino per wafer per tagliare i wafer di silicio in pezzi di un centimetro per 1,5 centimetri da utilizzare come substrati. Pulire ora i substrati ponendoli in un becher con acetone in quantità sufficiente a coprirli e sottoporli a sonificazione per cinque minuti senza permettere ai substrati di asciugarsi.Sciacquarli con acetone fresco e quindi risciacquarli immediatamente con isopropanolo, asciugandoli successivamente con azoto. Utilizzando una litografia fotolitografica in tono positivo standard o una litografia a fascio di elettroni, realizzare microelettrodi d'oro sui substrati puliti. Quando si progetta la geometria del pattern, mantenere il diametro di ciascun elettrodo al di sotto di 100 micron. Per garantire la copertura da parte del monolayer autoassemblato di trimetossil silano polietilene glicole (Peg Sam), includere pad di contatto posizionati tra 300 e 500 micrometri dal pattern, con una linea di un millimetro che collega il pad all'elettrodo.Dopo lo sviluppo del pattern nello strato di resist, utilizzare una pinzetta per tracciare una linea nel resist dal pad di contatto fino al bordo del substrato. Durante la deposizione del metallo, il graffio permetterà il contatto elettrico tra l'elettrodo e il bordo del substrato. Si utilizza una camera di deposizione, preferibilmente con due sorgenti, per depositare lo strato metallico.Gli elettrodi vengono formati mediante deposizione di due nanometri di cromo, seguita da sei nanometri di oro. Senza rompere il vuoto, si può utilizzare un microbilancio a cristallo di quarzo montato all'interno della camera per misurare lo spessore dei film durante la deposizione. Possiamo ora iniziare a preparare il monolivello autoassemblato in un'area ben ventilata, preriscaldando un forno a 75 gradi Celsius. Preparare la soluzione di silanizzazione aggiungendo un millilitro di peg silane a 20 millilitri di toluene in un becher di vetro da 250 millilitri.Mescolare bene aspirando e dispensando con la pipetta da cinque a dieci volte, quindi agitare con la pipetta per 30 secondi. Posizionare i campioni del motivo nel becher con il lato del motivo rivolto verso l'alto, assicurandosi che siano completamente immersi nella soluzione e uniformemente distanziati sul fondo del becher. Collocare il becher nel forno e cuocere per 18-21 ore mentre avviene la formazione del Sam.Preparare l'elettrodo contatore depositando un nanometro di cromo seguito da quattro nanometri di oro su un'ampolla di vetro di 22 per 50 millimetri. L'elettrodo contatore deve essere quasi trasparente con una leggera tinta grigia o rosa. Conservare l'elettrodo contatore con il lato rivestito rivolto verso l'alto in una piastra di Petri per mantenerlo pulito.Dopo 18-21 ore in forno, rimuovere il becher dal forno. Il toluene dovrebbe essere evaporato, lasciando i campioni di stampo in un residuo viscoso di peg cline. Aggiungere 20 millilitri di toluene nel becher e lasciare in ammollo i campioni per uno-due minuti.Rimuovere i campioni dal becher e sciacquarli con toluene, quindi con isopropanolo e infine asciugarli con azoto. A questo punto, i campioni dovrebbero apparire puliti e lo strato di Sam dovrebbe essere invisibile ad occhio nudo. I campioni preparati in questo modo possono essere utilizzati fino a due giorni se conservati in condizioni fresche e asciutte.Una formazione non riuscita di Sam produce un residuo opaco o con colorazione irregolare che ricopre la superficie. Una volta preparati i Sam, possiamo iniziare la polimerizzazione della tubulina in microtubuli. Iniziare scongelando la tubulina non marcata e la tubulina marcata con r domine, quindi combinarle immediatamente in un rapporto di due a uno, rispettivamente non marcata a marcata, per ottenere microtubuli luminosi.Miscelarli accuratamente aspirando e dispensando più volte con una pipetta. Successivamente, polimerizzare la tubulina per 20-40 minuti in un bagno termico a 37 gradi Celsius mentre la tubulina è in fase di polimerizzazione. Preparare un buffer pipes Taxol mescolando 20 micromolare di Taxol con buffer pipee.Mescolare accuratamente aspirando e dispensando più volte con una pipetta e agitando con un vortex, quindi inserire il tubo nel bagnomaria a 37 gradi Celsius. Dopo la polimerizzazione, diluire i microtubuli in tampone Taxol tiepido e proteggerli dalla luce. Verificare che la polimerizzazione dei microtubuli sia avvenuta con successo e che i microtubuli siano stabili durante diversi minuti di eccitazione in fluorescenza.Immagini i microtubuli preparati in presenza di una miscela che elimina l'ossigeno, con la polimerizzazione della tubulina in microtubuli completata. Iniziamo a definire il modello dell'MTS mediante elettroforesi. Per cominciare, tagli una striscia di nastro adesivo doppio lato in strisce sottili posizionandola su un vetrino e utilizzando una lametta; quindi posizioni due strisce di nastro adesivo doppio lato attraverso il campione rivestito con Sam e strutturato, in modo che l'elettrodo si trovi tra le strisce e il percorso di collegamento sia perpendicolare al nastro.Posizionare l'elettrodo contatore sul nastro adesivo bifacciale con il lato metallico a contatto con il nastro, in modo che il bordo del campione sporga di circa tre millimetri rispetto all'elettrodo contatore. Tagliare diverse lunghezze di filo di rame smaltato isolate di 15 centimetri e rimuovere un centimetro di isolamento da entrambe le estremità. Utilizzare una piccola goccia di vernice argentata per fissare un filo alla zona d'oro esposta del substrato, avendo cura di evitare contatti elettrici con l'elettrodo contatore.Ora utilizzare la vernice argentata per collegare un secondo filo al contatore. I fili dell'elettrodo fissati con vernice argentata possono essere ulteriormente assicurati ai campioni con del nastro. Successivamente, mediante pipetta, introdurre i microtubuli al grado di diluizione desiderato, osservare l'immagine a 20x di ingrandimento e individuare il disegno sul wafer di silicio prima di applicare una tensione.A causa della profondità della camera di flusso, potrebbero essere necessari obiettivi con lunga distanza di lavoro per immaginare la superficie superiore della camera di flusso. La distanza tra la superficie del campione e la superficie superiore della camera di flusso è determinata dallo spessore del nastro e dovrebbe essere compresa tra 60 e 100 micrometri. Applicare una tensione fino a un volt e osservare la migrazione dei microtubuli.Se si desidera un intrappolamento reversibile dei microtubuli, utilizzare lo smalto per unghie per sigillare la camera di flusso ed evitare spostamenti laterali, e usare tensioni più basse fino a circa 0,5 volt. La migrazione può essere monitorata regolando il piano verticale di messa a fuoco del microscopio con tensioni applicate comprese tra circa 0,9 e 1,2 volt, condizione in cui i microtubuli si localizzano sulle superfici degli elettrodi.Un voltaggio più elevato renderà la migrazione più rapida e l'adesione più forte, ma un voltaggio eccessivo indurrà elettrolisi e depolimerizzazione. Microtubuli: vi abbiamo appena mostrato come preparare microelettrodi rivestiti con SAM per la creazione di schemi di MT, poiché il rivestimento SAM impedisce l'assorbimento dei microtubuli sui microelettrodi. Questa procedura può essere utilizzata anche per la creazione reversibile di schemi di microtubuli.Inoltre, questo processo non è limitato solo ai microtubuli, ma può essere utilizzato anche per definire schemi di biomolecole in generale. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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