Generare embrioni di zebrafish Chimerico da trapianto

Ciao, sono Hillary Kemp del laboratorio di Cecilia Owens. E io sono Cecilia Owens. Hillary ed io siamo nella divisione di scienze di base presso il Fred Hutchinson Cancer Research Center di Seattle.

Oggi vi mostreremo una tecnica per creare embrioni chimerici di pesce zebra, noti anche come mosaici genetici. Questa procedura ci permette di valutare le basi cellulari della funzione genica durante lo sviluppo. Possiamo chiederci se un dato gene funzioni all'interno delle cellule con un fenotipo mutante noto come funzione autonoma cellulare, o all'interno di quell'ambiente cellulare noto come non autonomia cellulare.

Realizziamo questi mosaici trapiantando cellule tra embrioni mutanti di tipo selvatico in fase blastula o gastroenterica precoce. Successivamente valutiamo la funzione genica osservando il fenotipo e il genotipo delle cellule derivate da donatori nel loro ambiente ospite. Quindi iniziamo.

In questa parte del protocollo, un colorante di lignaggio viene iniettato nell'embrione del donatore in modo che il destino delle cellule derivate dal donatore possa essere seguito dopo il trapianto. Qualsiasi varietà di acidi nucleici può anche essere iniettata utilizzando questa tecnica, tuttavia, omettere la fase di decorazione quando si inietta il DNA prima di lavorare con gli embrioni, preparare una piastra di iniezione inserendo un vetrino con un angolo di 45 gradi attraverso la parte più larga di una capsula di Petri. Tre quarti pieni di 1,2% aros in penna streptococco embrionale.

Rimuovere lo scivolo dopo che l'agro si è solidificato per fare un trogolo smussato. Riempi la mangiatoia con penna streptococco embrione medium. Ora procedi con la decorazione enzimatica degli embrioni in uno stadio cellulare.

Incubare gli embrioni allo stadio di una cellula per un periodo compreso tra uno e cinque minuti in una dose di 0,5 milligrammi per millilitro. Soluzione di pronasi. Monitora attentamente la decorazione.

Non appena il corion inizia a collassare visibilmente, immergere gli embrioni nell'acqua del sistema E questo sta versando tutto il corium e gli embrioni rimangono dietro nella parte inferiore della curva del becco. Ed è molto importante che gli embrioni non colpiscano la superficie dell'acqua solo una volta e che la maggior parte di loro non abbia il corion. Ce ne sono alcuni che vorticano all'esterno che non lo fanno.

Se c'è ancora qualcosa nel suo corion, allora l'atto di pipettarli in questo modo li farà uscire e poi rilascerà gli embrioni in modo che non colpiscano mai la superficie dell'acqua. È importante maneggiare gli embrioni rivestiti con una pipetta lucidata a fuoco per levigarne i bordi. Trasferire delicatamente i fragili embrioni rivestiti di dec nella vaschetta di iniezione utilizzando una pipetta di vetro lucidata a fuoco di foro largo.

E poi stiamo caricando un singolo file in questo trogolo. Ora gli embrioni sono pronti per essere iniettati con un marcatore di lignaggio utilizzando un fuoco calibrato con precisione, una pipetta per iniezione in vetro tirato e un impianto di iniezione a pressione. Useremo un piatto pieno di terreno embrionale per rompere l'ago e un piatto pieno di olio per calibrare l'ago.

Questo è solo un normale olio minerale standard da laboratorio. Prendiamo un paio di pinze da orologiaio affilate e poi, mentre guardiamo attraverso gli oculari per determinare quale sarebbe la dimensione giusta, mettiamo le pinze su entrambi i lati dell'ago e poi rompiamo delicatamente il chip, cosa che in realtà non posso fare senza guardare per determinare il volume di colorante o ribonucleotide che viene erogato. Prima di iniziare.

Misurare la dimensione del bolo in una capsula di olio minerale. L'ago deve essere rotto in modo che venga erogato un bolo di un nanolitro con uno o due impulsi del micro iniettore. Il volume del bolo può essere calcolato dal suo diametro misurato da un micrometro oculare.

Iniettare un nanolitro di una soluzione da uno al 3% di destrano fluorescente direttamente nel ylk degli embrioni rivestiti tra gli stadi di una e quattro cellule. Quello che farò è posizionare l'embrione proprio sotto l'ago. Infilerò delicatamente l'ago al centro del tuorlo e premo il pedale.

Una volta iniettato, è importante iniettare nei flussi di tuorlo in modo che il colorante venga trasportato nelle cellule. Questa iniezione sarà sufficiente per tracciare le cellule negli embrioni chimerici attraverso diversi giorni di sviluppo. Idealmente, lo facciamo prima che le cellule raggiungano lo stadio di quattro cellule, allevare gli embrioni iniettati a bassa densità in una capsula di Petri rivestita riempita con embrione di streptococco fresco di penna. Medio.

Si noti che gli embrioni iniettati tendono ad avere un tasso di sviluppo leggermente rallentato, incubare gli embrioni a temperature diverse, 25, 28 e 31 gradi Celsius per scaglionare il loro sviluppo e massimizzare la finestra temporale in cui i trapianti possono essere eseguiti. L'apparato utilizzato per il trapianto di cellule nella blastula del pesce zebra è costituito da una siringa di Hamilton controllata da un azionamento collegato da un rubinetto di arresto a tre vie a un serbatoio di olio minerale e a un micro portapipette attraverso un tratto di tubo flessibile. Elimina tutte le bolle d'aria dal sistema in quanto rovineranno la tua capacità di controllare l'aspirazione e la pressione.

Utilizzare uno stereomicroscopio con ottiche di alta qualità con almeno un ingrandimento DX. Per controllare il posizionamento del portamicropipette e dell'ago, si consiglia un micromanipolatore manuale NARA shige. Assicurarsi che sia fissato al banco utilizzando una base magnetica per evitare che le vibrazioni si trasferiscano al trapianto.

Gli aghi per trapianto di aghi sono costituiti da pipette capillari di vetro che vengono aspirate in una leggera conicità su un elettrodo polare. Vedere il protocollo JoVE del laboratorio di Miriam Goodman per i dettagli sull'estrazione delle pipette sotto un microscopio da dissezione, rompere la punta dell'ago estratto. Per i trapianti allo stadio di blastula, il diametro esterno dell'ago dovrebbe misurare circa 50-60 micron o 30-40 micron per un trasferimento allo stadio gastro.

Per un trasferimento gastro stage per migliorare la penetrazione, è necessario tirare prima una punta affilata all'estremità dell'ago utilizzando prima un micro foraggio, lisciare la punta dell'ago avvicinandola al filamento della micro forgia. Quindi ruotare l'ago in modo che il bordo anteriore dello smusso possa entrare in contatto con il filamento. Una volta che il bordo anteriore dell'ago tocca il filamento, tiralo via rapidamente per creare una punteccia.

Per evitare di danneggiare le cellule, l'ardiglione deve essere dritto e la punta dell'ago non deve curvarsi Con il rig e gli aghi da trapianto preparati, sei pronto per creare embrioni chimerici. I trapianti di Blastula vengono utilizzati per trapiantare cellule tra embrioni quando non sono richieste informazioni precise sulla mappa del destino. Con l'eccezione delle cellule germinali primordiali, la maggior parte delle cellule generalmente non è impegnata in un destino in questa fase.

La mappa del destino della blastula è tale che possiamo distinguere tra le cellule che daranno origine all'ectoderma e le cellule che daranno origine al mesoderma. Il mesodermico e l'endodermico si trovano vicino al margine dell'embrione allo stadio di blastula, mentre i progenitori dermici, che daranno origine al sistema nervoso e al derma superficiale, si trovano più lontani dal margine dell'embrione. Quindi, quando trapiantiamo cellule in embrioni allo stadio di blastula, possiamo indirizzare quelle cellule al presunto mesoderma o al presunto ectoderma.

Ma non possiamo indirizzare le cellule a nessuna regione particolare dell'ectoderma o del mesoderma perché non lo sappiamo. Allo stadio di blastula, dove si trova il lato dorsale dell'embrione, preparare in anticipo le piastre di iniezione facendo galleggiare uno stampo di plastica con file accoppiate di sporgenze a forma di cuneo in una capsula di Petri, riempita a metà con 1,2% di aros fuso nel mezzo dell'embrione. Una volta che l'aros si è solidificato, rimuovere la sagoma lasciando file di pozzetti di forma triangolare ciascuno abbastanza grande da contenere un embrione.

Riempi lo stampo per il trapianto con un mezzo embrionale per streptococco a penna e carica gli embrioni dello stadio di blastula singolarmente in ciascun pozzetto con una pipetta di vetro lucidato a fuoco. Ora trasferisci gli embrioni nei pozzetti del trapianto, inizialmente consenti loro di sdraiarsi su un fianco. Disporre gli embrioni in modo che gli embrioni del donatore vengano posizionati in basso di una colonna e gli embrioni ospiti vengano posizionati in basso nella colonna adiacente.

Posizionare il piatto sul tavolino in modo che quando l'ago da trapianto entra in un embrione, l'ago spinga l'embrione contro la parete posteriore del suo pozzetto. Utilizzando il micro manipolatore, abbassare l'ago da trapianto nella piastra con un angolo abbastanza ripido. Idealmente, l'ago da trapianto dovrebbe entrare nell'embrione con un angolo di circa 45 gradi.

Una volta che la punta dell'ago si trova sotto la superficie del terreno embrionale, aspirare una piccola quantità di terreno embrionale nell'ago ruotando l'azionamento micrometrico che controlla la siringa di Hamilton. Per un controllo più preciso, l'interfaccia tra l'olio minerale e il mezzo embrionale deve rimanere nella parte sottile e affusolata dell'ago, non troppo vicino all'estremità. Posizionare delicatamente l'embrione donatore con l'ago, quindi tirare indietro l'ago e inserire il cappuccio della blastula dell'embrione nella posizione desiderata.

Un colpo rapido e duro penetrerà nell'embrione senza farlo rotolare. Aspirare le cellule del donatore lentamente e con attenzione nell'ago per evitare di tranciare le cellule. Evitare di prendere il tuorlo nell'ago dopo che è stato assorbito il numero desiderato di cellule.

Invertire leggermente la pressione per fermare l'aspirazione e rimuovere l'ago dal portare l'embrione ospite in posizione. Spostando la piastra di trapianto, è possibile apportare piccole modifiche alla posizione dell'embrione ospite ruotandolo delicatamente con l'ago da trapianto, purché si faccia attenzione a non toccare il tuorlo. Quando si espelleno le cellule del donatore nell'embrione ospite, evitare di assumere il ylk nell'embrione in quanto ciò danneggerebbe e ucciderebbe le cellule del donatore. Un singolo donatore, l'embrione può essere trapiantato in più ospiti dopo che i trasferimenti di cellule sono stati completati.

Trasferire le coppie di ospiti donatori nei pozzetti rivestiti di una piastra da 24 pozzetti per continuare lo sviluppo. L'unica eccezione alla regola delle cellule che non sono impegnate in destini particolari nello stadio di blastula sono le cellule germinali primordiali. Le cellule germinali primordiali vengono specificate molto presto nello sviluppo e sono impegnate nel loro destino primordiale di cellule germinali.

Fin da uno stadio molto precoce, le cellule germinali primordiali si trovano vicino al margine di una blastula e di un embrione allo stadio gast. Quindi, se l'obiettivo dell'esperimento di trapianto è quello di trapiantare cellule germinali primordiali, allora è molto importante da dove provengono le cellule nell'embrione donatore e non è importante dove vanno nell'embrione ospite. Quindi la regola è che per le cellule somatiche, è importante dove vanno nell'embrione ospite che determinerà il loro destino.

Nel caso delle cellule germinali primordiali, è importante da dove provengono nell'embrione del donatore perché il loro destino è già determinato. Se l'obiettivo è quello di trapiantare cellule germinali primordiali, allora le cellule devono essere prelevate dal margine della speranza dell'embrione donatore, e sono situate proprio vicino al margine dell'embrione in quattro piccoli gruppi di ciascuno di tre o quattro cellule in questo foglio, questo stadio di lancia o alto stadio di sviluppo. E devi raccoglierli con molta cautela per non iniziare accidentalmente a succhiare il tuorlo.

Ok, e questo è quello che ho fatto lì, e ora sto passando a un embrione ospite. Ora le cellule germinali primordiali si affineranno nella regione della cresta genitale di qualsiasi embrione in cui si trovino. Quindi non c'è bisogno di trapiantare queste cellule germinali primordiali fino al margine che ci arriveranno da sole.

Quindi sto semplicemente trapiantandoli, rimettendoli in qualsiasi vecchio posto nel post-embrione. La chiave per i trapianti di cellule germinali, che è esattamente l'opposto di qualsiasi altro tipo di trapianto, è che importa da dove provengono le cellule del donatore. Il trapianto di cellule in un ospite allo stadio gastro consente allo sperimentatore di sfruttare la mappa del destino del pesce zebra che emerge quando lo scudo embrionale diventa visibile.

Diventa possibile distinguere diversi tipi di tessuto e i domini all'interno del presunto sistema nervoso centrale. Quando si trasferiscono cellule tra embrioni nella fase di elenco gastro, ci sono alcune variazioni nel protocollo, ma la procedura generale è simile al lavoro con blastos per montare i gastro. Per prima cosa spalmare una striscia verticale di metilcellulosa nella depressione di un vetrino di depressione, quindi inondare con una generosa quantità di terreno embrionale per streptococco a penna utilizzando un trasferimento di pipette lucidato a fuoco.

Un donatore e tre stadi di protezione ospitano il vetrino di depressione. Seleziona embrioni donatori leggermente più giovani degli ospiti. È necessario un nuovo strumento per manipolare la colla gastros, le estremità di una lenza di prova di due libbre all'estremità di un tubo capillare.

Creando così un piccolo anello. Usa l'anello per arrotolare delicatamente gli embrioni donatori e ospiti sulla parte superiore della striscia di metilcellulosa e infilarli nella metilcellulosa fino a quando non sono sicuri. Ruotali in posizione in modo che la regione di destinazione sia più in alto.

Poiché durante il trapianto, l'ago entrerà tangenzialmente nell'embrione per fornire le cellule del donatore senza danneggiare l'ylk. I trapianti in stadio gastrogastro vengono eseguiti al meglio su un microscopio composto a stadio fisso. Utilizzare i comandi del micromanipolatore per mettere a fuoco la punta dell'ago da trapianto.

Posizionare il portamicropipette e l'ago con un angolo abbastanza basso in modo che l'ago sia il più vicino possibile all'orizzontale per quanto consentito dal bordo della depressione sul vetrino. Successivamente, forare l'embrione del donatore. Se è montato correttamente, non rotolerà quando entra l'ago del trapianto, a meno che l'embrione non sia troppo vecchio per consentire all'ago di penetrare facilmente.

Per evitare di perforare il ylk, l'ago dovrebbe entrare nell'embrione su un piano focale leggermente più profondo di quello dell'EDL. Una volta perforate, un gran numero di cellule può essere rimosso dal donatore per un massimo di tre iniezioni di cellule ospiti. Quando si prelevano le cellule, evitare di aspirare il tuorlo spostando l'ago poiché le cellule vengono assorbite se lo si desidera.

Ulteriori embrioni possono essere raccolti per più cellule utilizzando lo stesso ago prima di espellere le cellule nell'ospite, durante l'espulsione delle cellule nell'ospite l'embrione espelle le cellule mentre l'ago viene aspirato attraverso l'area mirata invece di depositare le cellule in un singolo grumo. Ciò aumenterà la probabilità che le cellule del donatore contribuiscano al tessuto desiderato. Una volta completati i trasferimenti cellulari, posizionare l'intero vetrino in una capsula di Petri e inondarlo accuratamente con embrione di streptococco in penna. Medio.

Nelle ore successive, la metilcellulosa si dissolverà rilasciando gli embrioni. Il numero di cellule trasferite dipende dall'obiettivo specifico dell'esperimento. Le cellule di un singolo donatore possono essere trapiantate in tre o quattro ospiti la mattina dopo il trapianto.

Gli ospiti possono essere esaminati per determinare se il targeting delle cellule del donatore ha avuto successo. Il trapianto riuscito di cellule germinali primordiali dall'età della blastula si traduce in cellule marcate in fluorescenza, posizionate ventralmente vicino alla giunzione tra l'ylk e l'estensione ylk. Quindi ti abbiamo appena mostrato come eseguire trapianti allo stadio di gastrula e blastula.

Quando si esegue questa tecnica, è importante scegliere il giusto tipo di metodo di trapianto per il tessuto bersaglio che si spera di colpire con le cellule. Quindi il trapianto allo stadio di blastula è sufficiente per determinare le cellule che vanno al derma rispetto all'ectoderma. E puoi anche usare questa tecnica per colpire le cellule germinali primordiali.

Se si desidera eseguire una mappatura più precisa, è meglio utilizzare un trapianto di gastrosa in cui il lato dorsale è già stato determinato. E quindi con questa tecnica, è possibile indirizzare le cellule a varie parti del sistema nervoso, in particolare il proencefalo, il mesencefalo, il cervello posteriore e il midollo spinale. Quindi questo è tutto.

Grazie mille per l'attenzione e in bocca al lupo per tutti i vostri esperimenti.