A High-Throughput Metodo per la crioconservazione dello sperma e Zebrafish In Vitro Fecondazione

Ciao, sono Bruce Draper dell'Università della California Davis, dipartimento di Biologia Molecolare e Cellulare, e sono Cecilia Moans della Divisione di Scienze di Base presso il Fred Hutchinson Cancer Research Center di Seattle. Oggi, Cecilia ed io dimostreremo il protocollo di conservazione del pianto di sperma di pesce zebra, che è una modifica del protocollo originale di Brian Harvey. Vi mostreremo che, lavorando in team di due persone, è possibile crioconservare lo sperma di 100 singoli maschi in meno di due ore.

Sebbene esista un'ampia gamma di fertilità dopo lo scongelamento, in media riceviamo il 25% di fertilità, e questo proviene da una libreria che è stata crioconservata per oltre sette anni. Quindi iniziamo. Prima di eseguire questa procedura, prepara le soluzioni di congelamento dello sperma.

La soluzione Ginsburg Fish ringer viene preparata fresca ogni tre giorni e il mezzo di congelamento viene prodotto fresco ogni giorno con e senza metanolo. La composizione di queste soluzioni è disponibile nelle informazioni supplementari online che accompagnano questo protocollo. I materiali utilizzati in questa procedura possono influenzare il tasso di congelamento e scongelamento, che a sua volta può influire sulla fertilità degli spermatozoi congelati.

Per questo motivo, viene fornito anche un elenco di materiali consigliati come informazioni supplementari online. È meglio congelare lo sperma su ghiaccio secco finemente tritato piuttosto che su pellet di ghiaccio secco. Un modo semplice per tritare il ghiaccio secco è avvolgerlo in un asciugamano e polverizzarlo con un martello.

Un metodo più efficiente consiste nell'utilizzare un tritaghiaccio secco come un artiglio e il modello RE due per congelare lo sperma di pesce zebra. Per prima cosa, segnare 10 provette capillari da microlitri con una penna da laboratorio al livello di 3,33 microlitri, o circa 16,7 millimetri dal fondo, per anestetizzare i maschi, mettere da due a quattro maschi in un becher contenente trica diluita e acqua di pesce. La ricetta può essere trovata nel libro del pesce zebra.

Una volta anestetizzato, sollevare i pesci dall'anestetico usando un cucchiaio di plastica e asciugarli delicatamente su un tovagliolo di carta. Prestare particolare attenzione al disegno del lato ventrale. L'acqua attiva lo sperma, quindi è fondamentale asciugare completamente intorno all'ika.

Posizionare il pesce sul supporto della spugna con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Se la regione intorno alle pinne pelviche è ancora umida, asciugala delicatamente con una salvietta Kim. Posizionare il tubo capillare contrassegnato in un adattatore per pipette in gomma incluso con i tubi capillari.

L'adattatore è un tubo di gomma che ha un bocchino su un'estremità e un supporto capillare sull'altra. In alternativa, il tubo capillare può essere collegato a una siringa Hamilton da 50 microlitri. Utilizzando un breve pezzo di tubo tigon del diametro appropriato, posizionare il maschio sotto l'endoscopio ed esporre l'apertura urogenitale allargando con cura le pinne pelviche.

Usando l'estremità del tubo capillare, esprimi lo sperma accarezzando delicatamente i lati del pesce con una pinza liscia o stringendo delicatamente i lati del pesce con un indice e un pollice, raccogli lo sperma in un tubo capillare mentre viene espulso usando una leggera aspirazione. Evita le feci che possono essere espulse con lo sperma. Il volume target di spermatozoi è di 3,3 microlitri.

La quantità minima di spermatozoi accettabile varia a seconda della qualità dello sperma. Gli spermatozoi buoni sono bianchi e opachi, mentre gli spermatozoi porosi sembrano acquosi. In generale, la quantità minima accettabile di spermatozoi è di un microlitro di spermatozoi buoni o un terzo del bersaglio e due microlitri di spermatozoi porosi o due terzi del bersaglio.

Se il volume dello sperma non raggiunge il volume target di 3,3 microlitri, è necessario normalizzare il volume fino al segno della penna utilizzando un mezzo di congelamento senza metanolo. Se il volume degli spermatozoi raggiunge o supera già il segno della penna sul tubo capillare, procedere al passaggio successivo. Ora aggiungi il crioprotettore allo sperma.

Aspirare il mezzo di congelamento con metanolo fino al segno arancione. Il volume totale approssimativo è ora di 20 microlitri. Espellere la miscela di sperma e crioprotettore su un'area pulita del vetro di un orologio, mescolata delicatamente pipettando su e giù circa quattro volte ed evitare di introdurre bolle.

Aliquotare lo sperma in due fiale criogeniche pipettando 10 microlitri della soluzione crioprotettiva per spermatozoi sul fondo di ciascuna fiala etichettata. Muovendosi rapidamente, tappare le fiale e far cadere ogni fiala criogenica in un tubo di falco separato da 15 millilitri. A temperatura ambiente, tappare i tubi di falco e inserirli nel ghiaccio secco finemente polverizzato.

I tubi devono essere inseriti abbastanza in profondità in modo che solo i tappi siano visibili per tenere traccia dei tubi del falco. Numerali e registra il tempo in cui ogni tubo entra nel ghiaccio secco. Lasciare congelare lo sperma nel ghiaccio secco per 20 minuti.

Dopo che lo sperma è stato congelato, trasferire le due fiale criogeniche in un pallone di esercizio contenente azoto liquido. Per la conservazione temporanea. Immergere la scatola del congelatore in un bagno di azoto liquido in modo che i campioni non si riscaldino.

Utilizzare lunghe pinze di metallo per recuperare le fiale dal pallone dell'esecutore e maneggiarle con guanti criogenici. In alternativa, le fiale criogeniche possono essere trasferite direttamente dal ghiaccio secco al congelatore. Se la scatola del congelatore viene conservata immersa nell'azoto liquido in un contenitore di polistirolo per la conservazione a lungo termine, posizionare le fiale criogeniche in un congelatore criogenico ad azoto liquido.

Per mantenere la vitalità degli spermatozoi, è fondamentale che le fiale siano conservate immerse in azoto liquido Le fiale conservate in fase vapore possono perdere vitalità nel tempo. La velocità è fondamentale anche per mantenere la vitalità degli spermatozoi. Il tempo che intercorre tra l'aggiunta del crioprotettore e il posizionamento delle fiale di sperma sul ghiaccio secco non deve superare i 30 secondi di fecondazione in vitro.

L'uso di spermatozoi crioconservati funziona meglio con due persone. Una persona spreme le uova dalle femmine mentre l'altra persona scongela lo sperma. Impostare un bagnomaria a 33 gradi Celsius.

Rimuovere una fiala criogenica dal congelatore ad azoto liquido e trasferirla in un azoto liquido contenente D o in un pallone fino a quando non è pronto per lo scongelamento. Spremere le uova delle femmine anestetizzate in una capsula di Petri di plastica da 35 millimetri. Questo è descritto in dettaglio nel protocollo JoVE intitolato Making Gyno Genetic deployed zebrafish by early pressure, che fornisce una descrizione dettagliata del zebrafish.

Fecondazione in vitro, una buona covata contiene più di 150 uova uniformi e giallastre. Eventuali detriti bianchi sono indicativi di degrado. Se possibile, cercate di ottenere tre covate di uova e di combinarle in un unico piatto.

Se non si ottengono tre buone frizioni entro un minuto dalla prima frizione, procedere al passaggio successivo. Tenere il piatto coperto mentre lo sperma viene scongelato. Nel frattempo, rimuovere la fiala dall'azoto liquido e rimuovere il tappo.

Immergere rapidamente la fiala a metà in un bagnomaria a 33 gradi per 8-10 secondi. Aggiungere rapidamente 70 microlitri di soluzione salina tamponata di Hank a temperatura ambiente alla fiala e mescolare pipettando su e giù, aggiungere immediatamente alle uova nella capsula di Petri e mescolare delicatamente con la punta della pipetta. Quindi attiva immediatamente lo sperma e le uova aggiungendo 750 microlitri di vortice d'acqua di pesce da mescolare e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.

Dopo cinque minuti, riempi il piatto con pesce, acqua e incuba a 28 gradi Celsius. Dopo due o tre ore, contare e trasferire gli embrioni vitali in piastre da 100 millimetri a 50 embrioni per piastra. Conta anche sugli ovuli fecondati in modo da poter determinare la fertilità del campione di sperma.

La fertilità degli spermatozoi è il rapporto tra gli embrioni vitali e il numero totale di ovuli utilizzati per la fecondazione in vitro. Gli ovuli possono essere selezionati in qualsiasi momento, da due a sei ore dopo la fecondazione in vitro. Quando gli ovuli infertili sono facilmente distinguibili dagli embrioni vitali, gli ovuli infertili sono chiari e indivisi.

Se osservata con l'illuminazione trans su uno stereomicroscopio, la fertilità media degli spermatozoi crioconservati varia notevolmente. Tuttavia, dovrebbe essere possibile ottenere una media del 25% di fertilità stabile per più anni. Questo grafico mostra la percentuale media di fertilità degli spermatozoi congelati tra il 2001 e il 2003 e si pensa fino al 2008.

Abbiamo appena dimostrato un metodo ad alta produttività per conservare il pianto senza sperma di pesce. Nell'esecuzione di questo protocollo, è importante utilizzare tutti gli indumenti e le attrezzature in plastica consigliati, nonché utilizzare ghiaccio secco tritato polverizzato piuttosto che pellet di ghiaccio secco. È fondamentale utilizzare spermatozoi e ovuli di altissima qualità, e nel caso degli ovuli quando si esegue la fecondazione in vitro, dopo aver avuto lo sperma, è importante utilizzare il maggior numero possibile di ovuli per migliorare il numero di embrioni fertili che si ottengono dall'altra parte, che potrebbe richiedere da tre a quattro femmine, A destra?

Un altro componente chiave del protocollo è la velocità. Non dovrebbe mai volerci più di un minuto per passare dall'estrazione dello sperma dal maschio al metterlo nel ghiaccio secco. Beh, penso che sia così.

Buona fortuna con i tuoi esperimenti.