Name: A High-Throughput Metodo per la crioconservazione dello sperma e Zebrafish In Vitro Fecondazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-06T19:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Impara un metodo ad alto rendimento per la crioconservazione dello sperma di zebrafish con fecondazione in vitro. Questo protocollo garantisce una fertilità media del 25% e una conservazione stabile per oltre sette anni.

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Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R01 HG002995 &quot;coltivare la Zebrafish Genoma: un approccio Reverse Genetics&quot; per CBM.

Parte A: Soluzioni di congelamento dello sperma 1. Ginsberg Pesce Ringers (Fai fresco ogni 3 giorni; Ginsburg, 1963) NOTA: ORDINE DI OLTRE è importante per evitare PRECIPITAZIONE In 450 ml sterile ddH2O sciogliere: <ul><li> NaCl 3,25 g </li><li> KCl 0,125 g </li><li> CaCl2 • 2 H2O 0,175 g Poi aggiungere: </li><li> NaHCO3 0,10 g </li></ul> Portare il volume finale a 500 ml con ddH2O sterile e conservare a 4 ° C. 2. Media congelamento (Fai fresca al giorno) <ol style="list-style-type:lower-roman"><li> SENZA Metanolo <ul><li> Pesce Ginsburg Ringers 10 ml (temperatura ambiente). </li><li> Latte scremato in polvere 1,5 gr </li></ul></li><li> Con metanolo NOTA: ORDINE DI OLTRE è importante per evitare PRECIPITAZIONE <ul><li> Pesce Ginsburg Ringers 9 ml (temperatura ambiente). </li><li> 1 ml di metanolo </li><li> Latte scremato in polvere 1,5 g </li></ul> Dopo il montaggio dei media congelamento, mescolate bene per 20 minuti. su agitatore orbitale o bilancieri. Prima di utilizzare, in aliquote da 1 ml provette Eppendorf, evitando le bolle di superficie. </li></ol> Parte B: Materiale necessario per il congelamento degli spermatozoi Materiali necessari per il congelamento degli spermatozoi <ol><li> 10 pipette monouso microlitri (cat Fisherbrand # 22-358697) </li><li> Bicchieri da 250 ml per i pesci di acqua contenente MESAB / Tricaine </li><li> orologi occhiali (Pyrex cat # 9985-75) </li><li> P20 Pipetman (o equivalente) e suggerimenti </li><li> Spugna titolare pesce (di sesso maschile, mentre a tenere spremitura) </li><li> Dissezione microscopio con illuminazione stadio sopra </li><li> Forcipe piatto (ad esempio di tipo Millipore) </li><li> 2,0 ml fiale criogenico (Corning cat # 430488) </li><li> 10X10 cryoboxes (Nalgene cat # 03-337-7AA) </li><li> Contenitore di polistirolo pieno di ~ 15 cm finemente triturato secco ice1 </li><li> 15 ml coniche tubi (Falcon # 352099) </li><li> Dewar pallone contenente azoto liquido </li><li> Pinze lunghe (ad esempio CMS Fisher gatto Health Care # 10-316b) </li><li> Cryogloves </li><li> Serbatoio di recupero per i maschi </li><li> Un tubo eppendorf riempito con i media congelamento senza metanolo </li><li> Un tubo eppendorf riempito con i media di congelamento con metanolo </li><li> Cryofreezer (ad esempio Taylor-Warton serie K) </li></ol> 1 Un metodo semplice per fare finemente triturato ghiaccio secco è quello di avvolgerla in un asciugamano e polverizzare con un martello. Un metodo più efficiente è quello di utilizzare una smerigliatrice di ghiaccio secco, ad esempio, il modello Clawson RE-2. Parte C: metodo di congelamento dello sperma <ol><li> MARK TUBI CAPILLARI: Prima di iniziare, contrassegnare i tubi capillari 10μl con una penna di laboratorio a livello di 3,33 microlitri (cioè 16,7 millimetri dal fondo; vedi Fig. 1.1.). </li><li> Anestetizzare MASCHILE: maschio Luogo (s) in un bicchiere contenente MESAB / tricaine diluito in acqua pesce (ricetta in &quot;Il libro Zebrafish&quot;) </li><li> SECCO DI PESCE: Una volta anestetizzato, ascensore pesce fuor d&#39;anestetico con un cucchiaio di plastica e con delicatezza macchia pesce secco su un tovagliolo di carta, con particolare attenzione per asciugare il lato ventrale. Acqua attiva sperma quindi è importante asciugare completamente intorno alla cloaca. Pesce posizione sul supporto spugna, in crescita del lato ventrale (fig. 1.2). Se la regione attorno a pinna anale è ancora umida, leggermente asciutto con kimwipe. Fare attenzione a non spremere sperma prematuramente! </li><li> Luogo segnato capillare in bocca adattatore pipetta in gomma che è incluso con tubi capillari. L&#39;adattatore è un tubo di gomma che ha un boccaglio da un lato e un supporto capillare dall&#39;altro. In alternativa, il capillare può essere collegato ad una siringa Hamilton 50μl attraverso un breve pezzo di tubo Tygon del diametro adeguato. </li><li> Maschio luogo nell&#39;ambito di applicazione ed esporre l&#39;apertura urogenitale con attenzione la diffusione della pinne pelviche a parte utilizzando le estremità del tubo capillare. </li><li> RACCOLTA SPERMA: Espellere sperma accarezzando delicatamente ai lati del pesce con una pinza liscia (ad esempio Millipore), oppure premendo delicatamente ai lati del pesce tra il dito indice e il pollice. Raccogliere lo sperma in tubo capillare in quanto viene espulso tramite aspirazione delicata (fig. 1.2). Evitare di feci che può essere espulso con lo sperma. </li><li> NORMALIZE VOLUME SPERMA A microlitri 3.3: Se il volume di sperma raggiunge o supera il marchio penna sul tubo capillare (cioè 16,7 millimetri o superiore), poi passare al punto 8. Se il volume di sperma non raggiunge volume di destinazione, poi normalizzare il volume a segnare con la penna Media congelare senza metanolo (fig. 1.3). Quantità minima di spermatozoi che sia accettabile varia con la qualità degli spermatozoi. Spermatozoi buoni è bianco e opaco. Spermatozoi poveri sembra acquoso. In generale, accettiamo come minimi: 1 microlitri spermatozoi buoni (o 1 / 3 di destinazione) e 2 spermatozoi microlitri poveri (o 2 / 3 di destinazione). Il volume è ormai normalizzata a 3,3 microlitri. </li><li> AGGIUNGI crioprotettore A SPERMA: Suck up medio di congelamento CON Metanolo al marchio arancione (circa il volume totale è ora di 20 l;. Fig. 1.4). Espellere miscela sperma e crioprotettore sulla zona pulita di un vetro da orologio, prestando particolare attenzione a non introdurre bolle. Mescolare delicatamente pipettando su e giù ~ 4 volte (evitare l&#39;introduzione di bolle). </li><li> LUOGO 10μl SPERMA IN OGNI DI 2 CRYOVIALS: Pipettare 10 ml di sperma: soluzione crioprotettore nella parte inferiore di due cryovials separati che sono stati etichettati con le informazioni rilevanti (Fig. 1.5). Muoversi rapidamente, fiale cappuccio e rilasciarli nella parte inferiore della temperatura ambiente 15 ml Falcon tubi-uno provetta Microbank ™ / tubo. Cap Falcon tubo ed inserire la coppia di provetta Microbank ™ contenenti tubi Falcon schiacciato in ghiaccio secco. </li><li> FERMO DI SPERMA PER 20 MIN. In ghiaccio secco: Il ghiaccio secco deve essere sotto forma di polvere fine, non pellet. I tubi deve essere inserito il ghiaccio secco abbastanza profondo che solo i loro berretti show (fig. 1.6). Al fine di tenere traccia di tubi in ghiaccio secco, dare ad ogni coppia di tubi Falcon un numero da 1-20 (scritto sul caps) e registrare il tempo vanno in ghiaccio secco. </li><li> CRYOVIALS LUOGO IN AZOTO LIQUIDO:. Dopo lo sperma è stato congelato in ghiaccio secco per 20 minuti, trasferirli ad un liquido contenente azoto vaso Dewar. Spermatozoi viene memorizzato qui fino al momento di mettere in freezer azoto liquido. Quando si posizionano nelle caselle congelatore, congelatore box posto in un bagno di azoto liquido in modo che i campioni non riscaldano. Utilizzare pinze di metallo lungo per recuperare fiale da vaso Dewar e maneggiare con cryogloves. In alternativa, cryovials possono essere trasferiti direttamente dal ghiaccio secco nella casella congelatore se la casella congelatore è tenuta immersa in azoto liquido in un contenitore di polistirolo. </li><li> Cryovials memorizzare a lungo termine in un congelatore criogenico di azoto liquido. Per mantenere la vitalità degli spermatozoi, è importante che i flaconcini sono conservati immersi in azoto liquido. Nella nostra esperienza, fiale memorizzato nella fase vapore perdono vitalità nel tempo. La velocità è importante! Il tempo tra l&#39;aggiunta del crioprotettore e l&#39;immissione fiale di sperma in ghiaccio secco (cioè passi 6-10) dovrebbe essere non più di 30 sec. </li></ol> Parte D: metodo di fecondazione in vitro con lo sperma crioconservati Troviamo che questo funziona meglio con due persone. Una persona spreme le uova da femmine, mentre l&#39;altra persona si scioglie lo sperma. <ol><li> Impostare un bagno d&#39;acqua a 33 ° C. </li><li> Togliere dal freezer provetta Microbank ™ azoto liquido e il trasferimento di liquidi contenenti azoto vaso Dewar fino al momento di disgelo. </li><li> Spremere le uova dalle femmine in 35 millimetri piatto di plastica di Petri. Se possibile, cerca di ottenere 3 grinfie di uova e si combinano in un piatto. Se non è possibile ottenere tre frizioni buon entro 1 minuto della vostra prima frizione, poi passare al punto 4 (una frizione buona è sufficiente). Definizione di una buona frizione:&gt; 150 uova in modo uniforme carina (cioè giallastro, senza residui bianchi indicativo del degrado). Tenere piatto coperto mentre lo sperma è stato scongelato. </li><li> Rimuovere fiala da azoto liquido e rimuovere il tappo. Fiala rapidamente immergere ~ 1 / 2 strada nel bagno d&#39;acqua a 33 ° C per 8-10 secondi. </li><li> Aggiungere rapidamente 70 microlitri temperatura ambiente Hanks a fiala e mescolare pipettando su e giù. Aggiungere immediatamente alle uova e mescolare delicatamente con la punta della pipetta. </li><li> Senza indugio, attivare lo sperma e le uova con l&#39;aggiunta di acqua 750 microlitri di pesce. Mescolare. Incubare 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Dopo 5 minuti, riempire con acqua piatto di pesce e piatti incubare a 28 ° C. Dopo 2-3 ore, il conteggio e il trasferimento degli embrioni fertili ai piatti 100mm (50/dish). Conte uova sterili in modo che la frequenza fecondazione può essere determinato. </li><li> Abbiate cura delle larve! Per i primi 5 giorni, cambiare l&#39;acqua ogni giorno ed eliminare embrioni morti. Mettete solo le larve che hanno vesciche natatorie in vivaio il giorno 5. </li></ol> Parte E: Risultati Rappresentante Abbiamo utilizzato questa metodologia crypreservation per fare una libreria di 8600 campioni di sperma congelato per TILLING tra gli anni 2001 e 2003. Abbiamo scongelati 106 di questi campioni e determinato la loro fertilità. La fertilità è il rapporto degli embrioni vitali prodotto in fecondazione in vitro diviso per il numero totale di uova che sono stati fecondati con lo sperma congelato. Fresco (non cryporeserved) di solito ha la fertilità dello sperma&gt; 95%; spermatozoi crioconservati ha fertilità molto più basso: una media del 29% (n = 106 fiale). Il flaconcino a fiala variabilità della fertilità è di grandi dimensioni, che vanno da meno dell&#39;1% a un massimo del 62%. Questa variabilità è rappresentato dal grande barre di errore rappresentano la deviazione standard in fig. 2. Tuttavia in 106 campioni di sperma scongelato fino ad oggi abbiamo solo una volta sperimentato 0% la fertilità in entrambi i campioni di sperma e non è riuscito a recuperare la mutazione corrispondente TILLING. Con lo scongelamento fiale di sperma dalla nostra biblioteca, nel corso di diversi anni (2001-2008) abbiamo trovato che la fertilità media dei campioni di sperma congelato da questo metodo rimanestabile nel tempo (Fig. 2). La fertilità media dei campioni di sperma congelato scongelati nel 2001 è stato del 23,5% (basato su 11 campioni di sperma) e nel 2008 era del 25% (sulla base di 21 campioni di sperma). Un certo numero di altri ricercatori stanno utilizzando questo protocollo di congelamento degli spermatozoi nei loro laboratori. Alcuni hanno riportato un buon successo con tassi di fertilità e il campione a campione variabilità simile a quello che abbiamo osservato. Altri hanno riferito non è riuscito a rendere questo protocollo di lavoro nelle loro mani. Crediamo che probabili fonti di problemi sono: <ol><li> Il mancato utilizzo della cryovials esatta o tubi conici abbiamo suggerito nel protocollo, porta a un diverso tasso di raffreddamento quando in ghiaccio secco; </li><li> Il mancato uso di polvere di ghiaccio secco, portando ad una sub-ottimale velocità di raffreddamento; </li><li> Utilizzando pesci di sesso maschile con scarsa fertilità: si dovrebbe ottenere almeno 1 ml di sperma da un singolo maschio. È inoltre possibile verificare la fertilità maschile facendo una fecondazione in vitro con lo sperma fresco, tuttavia questo può essere fuorviante, perché ci vuole molto poco sperma fresco per arrivare vicino al 100% la fertilità. </li><li> Utilizzando sub-standard uova di qualità nella fecondazione in vitro. Utilizzando tutt&#39;altro che perfetto frizioni porta sempre al vicino allo 0% la fertilità, anche da campioni di sperma che in realtà hanno una buona fertilità (in base alla fertilità del flaconcino duplicato). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Schematica della metodologia di congelamento dello sperma. <img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Fertilità dello sperma crioconservati rimane stabile nel tempo. Fertilità per cento è il numero di embrioni vitali prodotto in fecondazione in vitro diviso per il numero totale di uova che sono stati fecondati con lo sperma congelato. &quot;N&quot; si riferisce al numero di flaconcini spermatozoi crioconservati cui fertilità è stato testato nel corso dell&#39;anno corrispondente. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. Dal momento che ogni fiala di sperma è diverso da un maschio, fiala a fiala variabilità si osserva.

<ol><li>Ginsburg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm-egg+association+and+its+relationship+to+activation+of+the+egg+in+salmonid+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Sperm-egg association and its relationship to activation of the egg in salmonid fishes.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 11, 13-33 (1963).</li>
<li>Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+zebra+fish+spermatozoa+using+methanol%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Zoology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol.</a> Can. J. Zoology. 60, 1867-1870 (1982).</li>
</ol>

Un certo numero di altri ricercatori stanno utilizzando questo protocollo di congelamento degli spermatozoi nei loro laboratori. Alcuni hanno riferito di fertilità simili e lo stesso campione a campione variabilità che abbiamo osservato. Altri hanno riferito non è riuscito a rendere questo protocollo di lavoro nelle loro mani. Crediamo che probabili fonti di problemi sono: <ol><li> Il mancato utilizzo della cryovials esatta o tubi conici abbiamo suggerito nel protocollo, porta a un diverso tasso di raffreddamento quando in ghiaccio secco; </li><li> Il mancato uso di polvere di ghiaccio secco, portando ad una sub-ottimale velocità di raffreddamento; </li><li> Utilizzando pesci di sesso maschile con scarsa fertilità: si dovrebbe ottenere almeno 1 ml di sperma da un singolo maschio. È inoltre possibile verificare la fertilità maschile facendo una fecondazione in vitro con lo sperma fresco, tuttavia questo può essere fuorviante, perché ci vuole molto poco sperma fresco per arrivare vicino al 100% la fertilità. Più grandi, i maschi più robusta di colore tipicamente dare di più spermatozoi di qualità superiore. </li><li> Utilizzando sub-standard uova di qualità nella fecondazione in vitro. Utilizzando tutt&#39;altro che perfetto frizioni porta sempre al vicino allo 0% la fertilità, anche da campioni di sperma che in realtà hanno una buona fertilità (in base alla fertilità del flaconcino duplicato). </li></ol>

<table><tbody><tr><td>Pipette monouso da 10 &amp;mu;l</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-358697</td><td></td></tr><tr><td>Piattini d'orologio</td><td>Pyrex</td><td>9985-75</td><td></td></tr><tr><td>Provette criogeniche da 2 ml</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>Scatole criogeniche da 10 x 10</td><td>Nalge Nunc international</td><td>03-337-7AA</td><td></td></tr><tr><td>Tube conici da 15 ml</td><td>Falcon BD</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-316B</td><td></td></tr><tr><td>Criofrigorifero</td><td>Taylor-Wharton</td><td>K-series</td><td>Ad esempio</td></tr></tbody></table>

a high-throughput metodo per la crioconservazione dello sperma e zebrafish in vitro fecondazione

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

Questo è un metodo per la crioconservazione degli spermatozoi zebrafish che è un adattamento del metodo di Harvey (Harvey et al., 1982). Abbiamo introdotto due modifiche al protocollo originale che sia snellire la procedura e il campione uniformità aumentare. Per prima cosa, normalizzare tutti i volumi degli spermatozoi utilizzando supporti di congelamento che non contiene il crioprotettore. In secondo luogo, gli spermatozoi crioconservati sono memorizzati in cryovials invece di tubi capillari. I tassi di sperma congelamento e scongelamento (δ ° C / ora) sono probabilmente le due variabili più critiche per il controllo di questa procedura. Per questo motivo, non sostituire i tubi diversi per quelli specificati. Lavorare in team di 2, è possibile congelare lo sperma di 100 uomini per ogni squadra in circa 2 ore. Spermatozoi crioconservati utilizzando questo protocollo ha una media di 25% la fertilità (misurata come il numero di embrioni vitali generati in una fecondazione in vitro diviso per il numero totale di uova fecondate) e questo fertilità per cento è stabile per molti anni.

Si tratta di un high-throughput protocollo di crioconservazione degli spermatozoi per zebrafish. Spermatozoi crioconservati utilizzando questo protocollo ha una media del 25% la fertilità fertilizzazione in vitro successive ed è stabile per molti anni.

A High-Throughput Metodo per la crioconservazione dello sperma e Zebrafish In Vitro Fecondazione

Questo è un metodo per la crioconservazione dello sperma di zebrafish che rappresenta un adattamento del metodo di Harvey (Harvey et al., 1982). Abbiamo introdotto due modifiche a...

Ciao, sono Bruce Draper dell'Università della California Davis, dipartimento di Biologia Molecolare e Cellulare, e sono Cecilia Moans della Divisione di Scienze di Base presso il Fred Hutchinson Cancer Research Center di Seattle. Oggi, Cecilia e io illustreremo il protocollo di crioconservazione dello sperma di pesce zebra, una modifica del protocollo originale di Brian Harvey. Vi mostreremo che, lavorando in squadre di due persone, è possibile crioconservare lo sperma di 100 maschi singoli in meno di due ore.Sebbene vi sia un'ampia variabilità della fertilità dopo la scongelazione, in media otteniamo una fertilità del 25%, e ciò proviene da una libreria criopreservata da oltre sette anni. Cominciamo dunque. Prima di eseguire questa procedura, preparare innanzitutto le soluzioni per la congelazione degli spermatozoi.La soluzione fisiologica per pesci di Ginsburg viene preparata fresca ogni tre giorni, mentre il mezzo di congelamento viene preparato fresco ogni giorno, con e senza metanolo. La composizione di queste soluzioni è disponibile nelle informazioni supplementari online allegate al presente protocollo. I materiali utilizzati in questo procedimento possono influenzare la velocità di congelamento e scongelamento, il che a sua volta può influire sulla fertilità dello sperma congelato.Per questo motivo, un elenco dei materiali raccomandati è fornito anche come informazione supplementare online. È preferibile congelare lo sperma su anidride carbonica solida finemente tritata piuttosto che su pellet di anidride carbonica solida. Un modo semplice per tritare l'anidride carbonica solida è avvolgerla in un asciugamano e ridurla in polvere con un martello.Un metodo più efficiente consiste nell'utilizzare un macinatore a secco di anidride carbonica, come il modello RE due con artigli, per congelare lo sperma di pesce zebra. Per prima cosa, segnare delle provette capillari da 10 microlitri con una penna da laboratorio a livello di 3,33 microlitri, ovvero circa 16,7 millimetri dal fondo; per anestetizzare i maschi, posizionarne da due a quattro in un becher contenente trica diluita e acqua per pesci. La ricetta può essere trovata nel libro sul pesce zebra.Dopo aver anestetizzato il pesce, sollevarlo dal liquido anestetico utilizzando un cucchiaio di plastica e asciugarlo delicatamente con un tovagliolo di carta. Prestare particolare attenzione all'asciugatura della faccia ventrale. L'acqua attiva gli spermatozoi, quindi è fondamentale asciugare accuratamente intorno all'ika.Posizionare il pesce sul supporto di spugna con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Se la zona intorno alle pinne pelviche è ancora umida, asciugarla delicatamente con un fazzoletto di carta Kim. Inserire il tubo capillare marcato in un adattatore per pipetta con bocchino di gomma incluso con i tubi capillari.L'adattatore è un tubo di gomma che presenta un boccaglio a un'estremità e un supporto per capillare all'altra. In alternativa, il tubo capillare può essere collegato a una siringa Hamilton da 50 microlitri. Utilizzando un breve pezzo di tubo in teflon di diametro appropriato, posizionare il maschio sotto la lente d'ingrandimento ed esporre l'apertura urogenitale separando con attenzione le pinne pelviche.Utilizzando l'estremità del tubo capillare, espellere lo sperma effettuando delicati movimenti di strofinamento lungo i fianchi del pesce con pinzette lisce o comprimendo leggermente i fianchi del pesce con indice e pollice; raccogliere lo sperma nel tubo capillare man mano che viene espulso, applicando una leggera aspirazione. Evitare le feci che potrebbero essere espulse insieme allo sperma. Il volume target di sperma è di 3,3 microlitri.La quantità minima di sperma accettabile varia a seconda della qualità dello sperma. Lo sperma di buona qualità è bianco e opaco, mentre quello scadente appare acquoso. In generale, la quantità minima accettabile è di un microlitro di sperma di buona qualità, ovvero un terzo della quantità desiderata, oppure di due microlitri di sperma scadente, ovvero due terzi della quantità desiderata.Se il volume dello sperma non raggiunge il volume target di 3,3 microlitri, è necessario normalizzare il volume fino al segno della penna utilizzando mezzo di congelamento senza metanolo. Se il volume dello sperma ha già raggiunto o superato il segno sulla provetta capillare, procedere al passaggio successivo. Aggiungere ora il crioprotettore allo sperma.Aspirare il mezzo congelante con metanolo fino al segno arancione. Il volume totale approssimativo è ora di 20 microlitri. Espellere delicatamente la miscela di sperma e crioprotettante su un'area pulita di una capsula di vetro, mescolando delicatamente mediante pipettaggio su e giù per circa quattro volte, evitando di introdurre bolle d'aria.Aliquotare lo sperma in due provette criogeniche pipettando 10 microlitri della soluzione crioprotettiva per lo sperma sul fondo di ciascuna provetta etichettata. Chiudere rapidamente le provette e immergere ciascuna provetta criogenica in un tubo Falcon da 15 millilitri separato. A temperatura ambiente, chiudere i tubi Falcon e inserirli in anidride carbonica solida finemente polverizzata.I tubi devono essere inseriti abbastanza in profondità in modo che siano visibili solo i tappi, per tenere traccia dei tubi falcon. Numerarli e registrare l'orario in cui ciascun tubo viene posto nel ghiaccio secco. Lasciare congelare lo sperma nel ghiaccio secco per 20 minuti.Dopo il congelamento dello sperma, trasferire le due provette criogeniche in un matraccio Dewar contenente azoto liquido, per la conservazione temporanea. Posizionare la scatola del congelatore in un bagno di azoto liquido in modo che i campioni non si riscaldino.Utilizzare lunghe pinze metalliche per recuperare le provette dal flacone e maneggiarle con guanti criogenici. In alternativa, le provette criogeniche possono essere trasferite direttamente dal ghiaccio secco al congelatore. Se la scatola del congelatore viene mantenuta immersa in azoto liquido all'interno di un contenitore in polistirene per la conservazione a lungo termine, posizionare le provette criogeniche in un congelatore criogenico ad azoto liquido.Per mantenere la vitalità degli spermatozoi, è fondamentale che le provette siano conservate immerse nell'azoto liquido; le provette conservate nella fase vapore potrebbero perdere vitalità nel tempo. Anche la rapidità è essenziale per preservare la vitalità degli spermatozoi. L'intervallo di tempo tra l'aggiunta del crioprotettore e il posizionamento delle provette sul ghiaccio secco non deve superare i 30 secondi Fecondazione in vitro.L'utilizzo di sperma criopreservato funziona meglio con due persone. Una persona estrae le uova dalle femmine mentre l'altra scongela lo sperma. Impostare un bagnomaria a 33 gradi Celsius.Rimuovere una provetta criogenica dal congelatore a azoto liquido e trasferirla in un contenitore D o un matraccio contenente azoto liquido, fino al momento del scongelamento. Espellere le uova da femmine anestetizzate in una capsula di Petri di plastica da 35 millimetri. Questa procedura è descritta in dettaglio nel protocollo JoVE intitolato "Produzione di zebrafish geneticamente gini mediante pressione precoce", che fornisce una descrizione dettagliata del zebrafish.Fecondazione in vitro, una buona covata contiene più di 150 uova uniformi e di colore giallastro. Eventuali detriti bianchi indicano degradazione. Se possibile, cercare di ottenere tre covate di uova e unirle in un unico contenitore.Se non si ottengono tre buone covate entro un minuto dalla prima covata, passare al passaggio successivo. Mantenere la piastra coperta mentre lo sperma viene scongelato. Nel frattempo, rimuovere la provetta dall'azoto liquido ed eliminare il tappo.Immergere rapidamente il vialino per metà in un bagno d'acqua a 33 gradi per otto-dieci secondi. Aggiungere rapidamente 70 microlitri di soluzione salina tamponata di Hank a temperatura ambiente al vialino e mescolare aspirando e dispensando immediatamente nel vialino, quindi aggiungere subito alle uova nella piastra di Petri e mescolare delicatamente con la punta della pipetta. Successivamente, attivare immediatamente spermatozoi e uova aggiungendo 750 microlitri di acqua per pesci, ruotare per mescolare e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.Dopo cinque minuti, riempire la piastra con i pesci, aggiungere acqua e incubare a 28 gradi Celsius. Dopo due o tre ore, contare e trasferire gli embrioni vitali in piastre da 100 millimetri, con 50 embrioni per piastra. Contare anche le uova fecondate in modo da poter determinare la fertilità del campione di sperma.La fertilità degli spermatozoi è il rapporto tra embrioni vitali e il numero totale di uova utilizzate per la fecondazione in vitro. Le uova possono essere selezionate in qualsiasi momento da due a sei ore dopo la fecondazione in vitro. Quando le uova infertili sono facilmente distinguibili dagli embrioni vitali, le uova infertili appaiono chiare e non divise.Quando osservato con illuminazione trasmessa al microscopio stereoscopico, la fertilità media degli spermatozoi criopreservati varia notevolmente. Tuttavia, dovrebbe essere possibile ottenere una fertilità media del 25%, stabile per diversi anni. Questo grafico mostra la percentuale media di fertilità degli spermatozoi congelati tra il 2001 e il 2003 e testati fino al 2008.Abbiamo appena dimostrato un metodo ad alto rendimento per la criopreservazione dello sperma di pesce. Eseguendo questo protocollo, è importante utilizzare tutta la plastica e l'attrezzatura raccomandate, nonché utilizzare anidride carbonica solida macinata piuttosto che pellet di ghiaccio secco. È fondamentale utilizzare sperma e uova di qualità molto elevata; nel caso delle uova, durante la fecondazione in vitro, una volta attivato lo sperma, è importante utilizzare il maggior numero possibile di uova per aumentare il numero di embrioni fecondi ottenuti alla fine del processo, il che potrebbe richiedere da tre a quattro femmine, giusto?Un altro componente fondamentale del protocollo è la velocità. Non dovrebbe mai richiedere più di circa un minuto passare dall'estrazione dello sperma dal maschio al suo posizionamento nell'anidride solida. Bene, credo che sia tutto.In bocca al lupo per i tuoi esperimenti.

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Sviluppo di ciglia è vitale per l'organogenesi corretto. Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per etichettare e visualizzare le cellule ciliate di zebrafish.

Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

Zebrafish recentemente sono stati utilizzati come un sistema di modello in vivo per studiare il tempo di replicazione del DNA durante lo sviluppo. Qui è dettagliato i protocolli per l'utilizzo di embrioni di zebrafish per tempo di replicazione di profilo. Questo protocollo può essere facilmente adattato per studiare il tempo di replicazione in mutanti, tipi di cellule individuali, modelli di malattia e altre specie.

Tempo di replicazione del DNA utilizzando Zebrafish come un sistema di modello In Vivo di profilatura

Questo protocollo dimostra l'immunofluorescenza sequenziale e l'immunosofochimica sulle criosezioni degli embrioni di pesce zebra in fase iniziale, consentendo precise analisi di co-localizzazione in specifiche popolazioni cellulari.

Immunofluorescenza sequenziale e immunosofochimica su embrioni di pesce zebra criosezione

Presentato qui è un protocollo per l'analisi dell'ibridazione dell'RNA in situ intera nel test di zebra fish e tube formation nelle cellule endoteliali derivate dalle cellule staminali derivate dal paziente per studiare il ruolo dell'endoglin nella formazione vascolare.

Ibridazione dell'intero Monte In Situ negli embrioni di pesce zebra e nella formazione dei tubi, analisi dei prodotti iPSC-EC per studiare il ruolo dell'endoglin nello sviluppo vascolare

Qui presentiamo un protocollo per il rilevamento fluorescente mediato da anticorpi di proteine in interi preparati di embrioni e larve di pesce zebra.

Intero Monte Immunohistochimica in Embrioni e Larve di pesce zebra

Questo protocollo descrive come ottenere immagini combinando l'ibridazione in situ e l'immunoistochimica delle sezioni embrionali di zebrafish. L'ibridazione in situ è stata eseguita prima della criosezione, seguita dalla colorazione anticorpale. È utile rilevare i modelli di espressione di due geni nel pesce zebra se c'è una scarsità di anticorpi.

Sul posto Ibridazione combinata con immunoistochimica in embrioni di zebrafish criosezionati

Questo protocollo descrive un metodo di microscopia ottica a basso costo per valutare la morfologia e la funzione cardiaca negli embrioni di zebrafish, consentendo una valutazione riproducibile della cardiotossicità dello sviluppo senza la necessità di sistemi di imaging avanzati.

Imaging cardiaco funzionale in embrioni di zebrafish utilizzando microscopia standard e analisi video: applicazioni nella ricerca ambientale e biomedica

Impara un metodo ad alto rendimento per la crioconservazione dello sperma di zebrafish con fecondazione in vitro. Questo protocollo garantisce una fertilità media del 25% e una conservazione stabile per oltre sette anni.

A High-Throughput Metodo per la crioconservazione dello sperma e Zebrafish In Vitro Fecondazione

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