Fare Diploide Zebrafish Gynogenetic di Pressure presto

Ciao, sono Charlene Walker del laboratorio di Charles Kimmel presso l'Università dell'Oregon, Istituto di Neuroscienze. E io sono Gregory Walsh. Lavoro nel laboratorio di Cecilia Moens nella Divisione delle Scienze di Base presso il Fred Hutchinson Cancer Research Center.

Oggi vi mostreremo un procedimento per ottenere zebrafish diploidi mediante il metodo della pressione precoce. Questo metodo utilizza una pressione idrostatica per depolimerizzare i microtubuli in un uovo fecondato con spermatozoi irradiati con raggi UV. L'esecuzione al momento giusto è fondamentale.

Questo impedisce l'espulsione del secondo globulo polare, generando un embrione diploide i cui cromosomi omologhi sono i due prodotti della meiosi I. Questa tecnica è stata messa a punto all'inizio degli anni '70, quando lavoravo nel laboratorio di George Reisinger presso l'Università dell'Oregon. Nel nostro laboratorio, utilizziamo questa procedura in schermate genetiche di seconda generazione di quarta generazione.

Le cellule gametiche di pesci mutagenizzati F1 possono essere analizzate direttamente alla ricerca di mutazioni recessive che causano fenotipi dello sviluppo in prole gino, diploide dal punto di vista genetico. Poiché il pesce zebra presenta un elevato grado di interferenza genetica, utilizziamo questo metodo anche per mappare le mutazioni sui cromosomi e per stimare la distanza tra queste mutazioni e il centromero. Cominciamo dunque. Nel tardo pomeriggio del giorno precedente l'esperimento, prepararsi al prelievo dello sperma separando i maschi e le femmine da cui estrarre il liquido seminale; possono essere utilizzati maschi anziani poiché non contribuiranno con materiale genetico.

Le femmine devono apparire grandi e grasse nell'addome, mentre i maschi devono apparire gialli e vivaci. Mantenere i maschi e le femmine durante la notte in vasche separate, dove possano essere facilmente accessibili la mattina. Al mattino dell'esperimento, preparare la soluzione di Hank e aggiungere bicarbonato di sodio.

Portare al laboratorio dei pesci in un secchiello con ghiaccio. La soluzione di Hank's trica un timer e provette per la raccolta dello sperma. Infine, una volta nel laboratorio dei pesci, diluire la trica in acqua per pesci.

Questo verrà utilizzato per anestetizzare i pesci nel passaggio successivo. Per iniziare la raccolta dello sperma, preparare una provetta trasparente contenente soluzione di Hank posta sul ghiaccio. Una quantità sufficiente di soluzione di Hank, fredda, per circa 50 microlitri per maschio da spremere; anestetizzare uno o due maschi alla volta.

Tramite immersione e trica, possono essere sollevati dall'anestetico con un cucchiaio di plastica. Risciacquare i maschi e l'acqua dei pesci e asciugare delicatamente con un tovagliolo di carta. Questo passaggio è molto critico perché l'acqua attiva gli spermatozoi.

Una volta asciutti, montare i pesci su un supporto in schiuma sotto un microscopio stereoscopico a basso ingrandimento con illuminazione epi. Separare le pinne pelviche con pinzette e posizionare una microcapillare all'apertura della cloaca per iniziare a raccogliere lo sperma. Accarezzare delicatamente ma con fermezza i fianchi del pesce con pinzette lisce da mill, mentre lo sperma lattiginoso fuoriesce dal poro genitale; raccoglierlo nella microcapillare utilizzando una leggera aspirazione, prelevando lo sperma da diversi maschi su ghiaccio.

Soluzione salina fredda di Hank. Lo sperma di cinque-dieci maschi è sufficiente per fecondare le uova di 20-30 femmine. Lo sperma conservato in soluzione fredda di Hank mantiene la capacità fecondante per diverse ore.

Raccogliere abbastanza sperma da formare una sospensione torbida per l'inattivazione mediante UV. Iniziare riempiendo la base di una piastra di Petri di vetro con del ghiaccio. Posizionare un vetrino da orologio sopra il ghiaccio all'interno della piastra.

Successivamente, utilizzare la pipetta per trasferire lo sperma dal tubo di prova sulla capsula di Petri. Assicurarsi di aspirare la maggior quantità possibile di sperma nella pipetta, evitando di introdurre bolle d'aria. È fondamentale evitare la formazione di bolle nello sperma; espellere lo sperma in uno strato sottile e uniforme sulla capsula di Petri e quindi smaltire la pipetta.

Dopo il trasferimento degli spermatozoi, posizionare la piastra di Petri in un incrociatore UV. Accendere l'incrociatore impostato su un'energia di 900 JUULs. Dopo l'incrocio, utilizzare una pipetta pulita per rimuovere gli spermatozoi dalla capsula di vetro e trasferirli in un tubo fendor contrassegnato come spermatozoi UV e posizionarlo sul ghiaccio.

Per iniziare la raccolta delle uova, anestetizzare due femmine alla volta. In Trica, è fondamentale non mantenere i pesci in trica troppo a lungo poiché un'anestesia prolungata può uccidere i pesci. Successivamente, risciacquare i pesci in acqua per pesci e asciugarli leggermente su un tovagliolo di carta.

Questo è fondamentale perché l'eccesso di acqua farebbe gonfiare le uova e impedirebbe la fecondazione. Posizionare la femmina in una capsula di Petri di plastica da 35 millimetri con le dita umide ma non bagnate. Premere delicatamente ma con fermezza sull'addome.

Se è pronta a deporre le uova, queste usciranno facilmente; raccogliere le uova con una spatola e restituire la femmina in acqua. Le uova sane hanno un colore giallognolo e traslucido, mentre quelle rimaste troppo a lungo all'interno della femmina sono bianche e acquose. Per assicurarsi di ottenere uova di buona qualità, raccoglierle durante le prime due ore successive all'accensione delle luci nella struttura per pesci e mantenere le uova coperte per evitare che si secchino.

Dopo aver raccolto le uova, aggiungere da 30 a 50 microlitri di sospensione di spermatozoi UV sulle uova e mescolare delicatamente con la punta di una pipetta. Aggiungere immediatamente circa un millilitro di acqua per pesci e avviare il cronometro. Le uova lasciate sviluppare a questo punto saranno aploidi.

I seguenti passaggi devono essere completati entro 90 secondi dalla fecondazione. Avviare il cronometro nel momento in cui le uova vengono attivate con l'aggiunta di acqua.

Il momento esatto della metafase della meiosi I dipende dalla temperatura. Il tempo di applicazione e rimozione della pressione è ottimizzato a 28,5 gradi Celsius. Dopo aver avviato il cronometro, attendere alcuni istanti, quindi aggiungere altra acqua e spostare le uova al centro della piastra.

Utilizzando una pipetta da pascolo tagliata e lucidata, trasferire le uova fecondate nei vial di pressione, se necessario, aggiungere ulteriore acqua per uova al vial fino a farla quasi traboccare, lasciando una goccia d'acqua nell'ansa dei vial. Successivamente, posizionare un tappo di gomma sopra la goccia d'acqua e fissare il coperchio di plastica sopra la gomma.

Posizionare i vial capovolti nel cilindro a pressione, aggiungendo ulteriore acqua per uova. Per ricaricare il cilindro, fissare accuratamente il coperchio. Una volta chiuso, inserire il cilindro nella pressa con il pistone rivolto verso l'alto ed applicare una pressione di 8.000 libbre per pollice quadrato.

Lasciare il cilindro nella pressa fino a sei minuti dopo il tempo di attivazione, per un tempo totale di 4,5 minuti di pressione. Sei minuti dopo l'attivazione, rimuovere il cilindro dalla pressa. Rimuovere le provette dal cilindro e asciugarle con cura per evitare il raffreddamento degli embrioni.

Reimpostare il cilindro e riempirlo nuovamente con acqua per uova. Preparare le provette successive riempiendole parzialmente con acqua per uova secondo necessità. Ripetere questi passaggi per tutti i lotti di uova.

Il cilindro può contenere fino a due provette alla volta, quindi si può considerare di ritardare la fecondazione delle uova di uno o due minuti per verificare se altre femmine già presenti nel trica producono uova. Questo aiuterà ad accelerare il processo trattando più lotti contemporaneamente. Inoltre, se si comprimono i pesci mentre la pressa è in uso, le uova potrebbero seccarsi troppo per essere ancora vitali quando la pressa sarà nuovamente disponibile. 24 ore dopo la fecondazione, un embrione di zebrafish aploide avrà un corpo corto e tozzo, una coda corta e un cervello meno definito.

Tuttavia, tutti avranno le stesse parti del corpo, come somiti, corda dorsale, occhi e orecchie. Essendo diploidi, gli aploidi e i diploidi mostrano movimenti di flessione libera intorno alle 24 ore. Dopo la fecondazione, i fratelli diploidi EP presentano code lunghe, cervelli ben modellati e dovrebbero avere una vitalità di circa il 60-70%.

Questi appaiono molto simili ai controlli deposti non trattati. Di solito un lotto di embrioni aplo presenta una miscela di embrioni di aspetto normale, embrioni morti e stadi intermedi tra questi estremi. La proporzione di embrioni di aspetto normale rispetto a quelli difettosi riflette i geni dannosi presenti nel genoma femminile.

Le mutazioni sono relativamente facili da identificare anche con questo sfondo, poiché ci saranno diversi individui, fino al 50%, con lo stesso fenotipo caratteristico. È importante assicurarsi che gli embrioni prodotti con questo metodo siano veri tic OIDs, utilizzando come controlli una covata di uova normali sviluppate conservando parte dello sperma senza inattivazione UV e una covata di embrioni aploidi conservando una covata di uova fecondate con sperma UV senza sottoporle alla procedura EP; gli aploidi non sono vitali dopo due o tre giorni. Gli EP sviluppati dovrebbero apparire come diploidi normali.

Sebbene possano verificarsi alcuni esemplari anomali di EP, le covate di diploidi EP dovrebbero essere per lo più vitali, con percentuali comprese tra il 70 e il 90%. La presenza di aploidi nella covata prodotta tramite EP indica un malfunzionamento del processo EP, ad esempio la pressa che non mantiene la pressione. La presenza di diploidi nella covata di aploidi suggerisce un'inattivazione incompleta dello sperma, ad esempio un malfunzionamento del crosslinker.

Abbiamo appena mostrato quanto sia semplice eseguire la fecondazione in vitro con il pesce zebra e come ottenere embrioni diploidi di pesce zebra di origine ginogenetica inibendo la seconda divisione meiotica. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che il momento della pressione precoce deve essere preciso e che la pressa mantiene una pressione costante di 8.000 libbre per pollice quadrato per tutta la durata del trattamento. Assicurarsi che la pressa sia stata tarata correttamente.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna nei vostri esperimenti.