Name: Visualizzare il cuore pulsante di Drosophila /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-28T21:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Scopri le tecniche di visualizzazione del cuore pulsante in Drosophila per studi di biologia dello sviluppo. Questo metodo permette di analizzare la funzione cardiaca in larve e adulti.

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KO è sostenuto da un finanziamento della American Heart Association.

Prima di iniziare Cuori adulti <ol><li> Appena preparare emolinfa artificiale (AH) soluzione contenente 108mm Na +, 5mm K +, 2mm Ca 2 +, 8 mm MgCl 2, 1 mM NaH 2 PO 4, 4mm NaHCO 3, saccarosio 10mM, trealosio 5mm, HEPES 5mm (pH 7.1, tutti i reagenti da Prodotti chimici Sigma). Il saccarosio e trealosio dovrebbero essere aggiunti alla AH dalle soluzioni magazzino refrigerato al momento dell&#39;uso, al fine di prevenire la contaminazione batterica. </li><li> AH portare a temperatura ambiente e ossigenare la soluzione da bolle d&#39;aria per almeno 15 min. </li><li> Tirare diversi fini capillari (ad esempio vetro Capillari, 100ul, VWR) necessari per la rimozione di grasso. </li></ol> Cuori larvale <ol><li> Sylgard rivestita coprioggetto: usando una, trasferimento stuzzicadenti circa 50-70μl di soluzione Sylgard su un vetrino 22x22mm. Lasciate che i indurire Sylgard a 65 ° C durante la notte. </li><li> Preparare il Broadie e tampone del Bate (135mm NaCl, KCl 5mm, 4mm MgCl 2, 2mM CaCl 2, TES 5mm, Saccarosio 36mm;. PH 7,15 Vedi Broadie e Bate, 1993). </li><li> Preparare gli strumenti necessari per applicare la colla histoacryl. In primo luogo, tirare diversi fini capillari (ad esempio Science Prodotti GB100T8P). Collegare la punta della pipetta 1,5 ml con un tubo di plastica di piccole dimensioni (Tygon, 1 / 32 &quot;), inserendo l&#39;estremità più piccola nella provetta. Inserire un capillare con la sua ampia apertura verso l&#39;altra estremità. Caricare il capillare con colla Histoacryl immergendo il capillare in una goccia di colla e di aspirazione delicata nella punta di plastica. Quando si lavora con la colla si dovrebbe avere un secondo bicchiere capillare a portata di mano per rimuovere la colla eccessiva dalla punta della colla capillare. La colla è liquida fino a quando non entra in contatto con soluzione fisiologica tamponata dove si indurisce entro un paio di secondi. Tuttavia, rimane di solito in plastica abbastanza a lungo per essere rimossi dalla punta capillare colla o durante l&#39;applicazione al modello. </li></ol> Semi-intatta Cuore Drosophila dal Fly adulti <ol><li> Adulto vola Drosophila sono anestetizzati con Nap Fly (Carolina Biological Supply Co.) per 2-5 minuti. Bisogna fare attenzione a non lasciare le mosche nel Nap Fly per esposizioni più lunghe. Esposizione a breve termine al freddo può anche essere utilizzato per anestetizzare le mosche, ma di CO 2 non è raccomandato in quanto ha più effetti duraturi sulla frequenza cardiaca e ritmicità. </li><li> Vola anestetizzati sono posti, lato dorsale verso il basso, in una piastra di Petri rivestiti con un sottile strato di vaselina. La cuticola idrofobo nelle ali e il corpo reversibile &quot;bastone&quot; per la gelatina, ma il volo può essere riposizionato, se necessario. Questo diventa particolarmente importante durante le manipolazioni successive. </li><li> Un primo taglio è realizzato con un paio di forbici curve primavera (Roboz # 5611). Le lame a forbice sono posti sotto le gambe e angolati verso il basso verso la superficie dorsale del torace, vicino al collo. La testa, cordone nervoso ventrale, e le gambe vengono rimossi con un unico taglio. La preparazione viene poi immerso in un ossigenato, emolinfa artificiale (AH) soluzione. </li><li> Utilizzando le forbici molla la punta posteriore dell&#39;addome (formato da segmenti addominali 7 e 8) viene rimosso con un unico taglio. Questo consente l&#39;accesso di questi tagli, lungo entrambi i bordi laterali dell&#39;addome e serve a recidere il legame tra l&#39;intestino posteriore e la cuticola addominale. Il lembo libero della cuticola ventrale addominale viene quindi rimosso. </li><li> Nei passaggi 3 e 4 le connessioni anteriore e posteriore dell&#39;intestino sono così reciso gli organi addominali sono ora tenuti in posizione da solo tracheols. L&#39;intestino e altri organi addominali di solito può essere rimosso come una massa unica con pinze gioielleria (Roboz, # 55) e gentile strattoni. La rimozione degli organi interni rivela il tubo cuore pulsante ancora attaccato alla cuticola dorsale circondato da corpi grassi. </li><li> I corpi grassi sono abbastanza opachi al microscopio ottico, di conseguenza è spesso necessario per rimuovere una parte di questo grasso per vedere il tubo di cuore in modo chiaro. Questo si ottiene utilizzando una tecnica di liposuzione finemente disegnate vetro capillari. Capillari sono realizzati con uno standard pipetta estrattore (Es. Sutter P-97 pipette Puller) e vengono poi inseriti in tubi in plastica (Tygon, 1 / 16 &quot;) collegato a una fonte di vuoto. Questo sistema è utilizzato per aspirazione il grasso in eccesso attorno al tubo cuore. Forza di aspirazione è proporzionale al diametro della punta in modo pipette con le punte maggiori di 40 micron di diametro non deve essere utilizzato. Estrema cura deve essere presa per evitare di toccare il cuore stesso e perché la parte posteriore del cuore è molto fragile, che la regione dovrebbe essere evitato del tutto. </li><li> L&#39;adulto tubo cuore Drosophila è ora esposta e va a battere. Se necessario, il cuore della cuticola e allegata possono essere riposizionati da sollevando delicatamente la cuticola fuori la vaselina e con attenzione pigiatura indietro, sempre evitando ogni contatto con il tessuto cardiaco. Til suo punto la soluzione balneari la preparazione deve essere sostituita con AHL fresca. Questa preparazione deve essere lasciato equilibrare per 20-30 minuti con l&#39;ossigenazione prima di qualsiasi manipolazione. Se la preparazione deve essere mantenuta per più di 60 minuti dovrebbe essere perfusi con AHL fresca. </li></ol> Immobilizzare le larve di Drosophila per la registrazione ottica <ol><li> Mettere una goccia di colla Histoacryl vicino a ogni angolo del coprioggetto Sylgard. Aggiungere 50μl di B &amp; B buffer per le gocce di colla che si indurisce immediatamente. Riempire lo spazio tra i punti incollati con B &amp; B - la colla non mancherà di tenere il tampone sul vetrino. </li><li> Prendete una larva L3 errante e mettetelo su un foglio di carta velina bagnata in ghiaccio per 2 minuti. Questo rallenterà il suo movimento. Poi trasferire la larva nel buffer e orientarlo con la parte dorsale verso l&#39;alto (questo è il lato della larva che non ha le cinture dentino). Applicare rapidamente po &#39;di colla tra la regione della testa e del Sylgard. La colla si indurisce molto rapidamente e prevenire il capo della larva di muoversi. </li><li> Utilizzando pinze attentamente afferrare l&#39;animale dal spiracoli posteriori e delicatamente stretch. Fissare la larva in questa posizione applicando la colla lungo entrambi i lati della larva a metà posteriore. Per ridurre ulteriormente il movimento della cuticola dalla muscoli della parete del corpo, aggiungere la colla per i fianchi dell&#39;animale. La larva è ora fissato in questa posizione. Il coprioggetto può essere collocato in una piccola scatola di Petri piena di AHL o PBS. Battiti cardiaci possono essere registrati senza interferenze da parte dei movimenti parete del corpo. </li></ol> Rappresentante dei risultati: Il semi-intatti cuore adulto Drosophila batterà ritmicamente per ore seguenti dissezione quando mantenuto in fresco, AH ossigenata (vedi Dati supplementari, Ocorr, et al., 2007). Un esempio rappresentativo è mostrato in Movie 1. Cuori da 3 larva ° instar e vola giovani (1 - 3 settimane dopo eclosion) in genere mostrano un ritmo regolare cuore a tassi tra l&#39;1 - 3 Hz. Vola più di 3 settimane in genere sono più aritmici, tuttavia, questi cuori sono ancora in grado di battere spontaneamente per ore in AHL ossigenato. Cuori in mosche adulte che sono danneggiati come conseguenza della procedura di dissezione mostrano tipicamente le regioni localizzate di costrizione estrema, che non sono in grado di rilassarsi. Tassi di battito cardiaco più lento di 1 Hz sono raramente osservati nelle mosche meno di 3 settimane di età, di conseguenza tali preparati sono considerati danneggiati e vengono scartati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1425/MOVIE1.avi">Clicca qui per scaricare film 1.</a> - Una settimana quella vecchia volare tipo selvatico adulto (ceppo di laboratorio w 1118) che mostra il tubo esposto cuore addominale (anteriore a sinistra). Nota regolare, contrazioni ritmiche. Regioni opache nell&#39;angolo in alto a destra ci sono i restanti corpi grasso addominale; cellule rotonde su entrambi i lati del cuore sono cellule del pericardio.

<ol><li>Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCNQ+potassium+channel+mutations+cause+cardiac+arrhythmias+in+Drosophila+that+mimic+the+effects+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).</li>
<li>Broadie, K. S., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+embryonic+neuromuscular+synapse+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster.</a> J Neurosci. 13, 144-166 (1993).</li>
</ol>

Il modello Drosophila ha dimostrato di essere un potente strumento genetico che è stato usato per affrontare una serie di quesiti scientifici che spaziano dallo sviluppo embrionale all&#39;apprendimento e alla memoria. Di recente questo organismo modello versatile è stato utilizzato per studiare la genetica della funzione cardiaca in tempo reale. Un certo numero di tentativi di quantificare fisiologia cardiaca in adulti Drosophila si sono basati sulle osservazioni fatte nei moscerini intatta attraverso la cuticola addom...

<table><tbody><tr><td>Forbici da dissezione microchirurgiche a molla (curve)</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5611</td><td>Adatte per tagli grossolani (Passaggio 3)</td></tr><tr><td>Forbici da dissezione microchirurgiche a molla (dritte)</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5620</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Dumont n. 55</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Dumont n. 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Capillari di vetro, 100 µl</td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Capillari di vetro, fini</td><td>Science Products</td><td>GB100T8P</td><td></td></tr><tr><td>Tiracapillari</td><td>Sutter Equipment</td><td>P-97</td><td>Sia i tiracapillari orizzontali che verticali sono utilizzabili</td></tr><tr><td>Tubulatura di plastica</td><td>Tygon</td><td>1/16&amp;#8221; diametro interno</td><td>per capillari da 100&amp;#x03BC;l</td></tr><tr><td>Tubulatura di plastica</td><td>Tygon</td><td>1/32&amp;#8221; diametro interno</td><td>per capillari piccoli</td></tr><tr><td>Adesivo tissutale Histoacryl&amp;#174;</td><td>B. Braun Medical</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzare il cuore pulsante di drosophila</em

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Il<em&gt; Drosophila</emCuore&gt; è recentemente emerso come un sistema di buon modello per l&#39;esame dei meccanismi genetici, cellulari e molecolari alla base della funzione nei cuori miogenico. Un passo fondamentale per esaminare la funzione cardiaca in tempo reale è trovare un modo per accedere al cuore in un modo che conserva la sua funzione miogenici pur consentendo l&#39;organo cuore pulsante di essere osservato e registrato. Due diversi metodi per osservare e registrare il cuore pulsante in entrambe le larve e adulti<em&gt; Drosophila</em&gt; Sono descritte qui. Il nostro semi-intatta la preparazione con le mosche adulte consente la visualizzazione chiara del cuore addominali senza interferenze da parte cuticola pigmentate e sovrastanti corpi grassi. Per registrare il cuore batte larvale è necessario immobilizzare la larva, che riduce al minimo i movimenti parete del corpo in modo da ridurre i movimenti cuore che non sono associati a contrazioni del miocardio. Le nostre metodologie di produzione stabile adulti e preparati cuore larvale che può battere per ore a tassi di Hz 1-3.

Tecnica necessaria per visualizzare il cuore pulsante di larve e adulti<em&gt; Drosophila</em&gt; Sono presentati. Ogni fase della vita richiede una metodologia diversa.

Visualizzare il cuore pulsante di Drosophila</em

Il cuore di Drosophila è emerso recentemente come un buon sistema modello per esaminare i meccanismi genetici, cellulari e molecolari alla base della funzione in ...

Verranno presentate qui due tecniche per la visualizzazione di un cuore in battito in Drosophila per la dissezione del cuore adulto. Innanzitutto, la testa e il torace vengono rimossi con un singolo taglio lungo la linea indicata. Successivamente, vengono rimossi gli organi genitali e la cavità addominale viene aperta utilizzando pinzette; vengono quindi rimossi l'intestino e, nel caso di una mosca femmina, anche le ovaie.Il tessuto adiposo addominale nei segmenti addominali tre e quattro viene delicatamente aspirato per esporre il cuore adulto al fine di immobilizzare il cuore larvale. Una singola larva posizionata in soluzione tampone viene fissata applicando prima una colla istoacrilica attorno alla regione cefalica della larva. La larva viene delicatamente stirata e ulteriore colla viene applicata all'estremità posteriore e poi ai lati della parete corporea della larva.Ciao, sono GI Fler. Ciao, sono Karen er. Entrambi facciamo parte del programma di Sviluppo e Invecchiamento presso l'Istituto Burnham per la Ricerca Medica.Oggi vi mostreremo le procedure che abbiamo sviluppato per visualizzare il cuore in battito di Drosophila allo stadio larvale e adulto. Utilizziamo entrambi questi preparati come metodo per visualizzare, esaminare e quantificare i parametri del battito cardiaco nella mosca della frutta, Drosophila. Prima di iniziare, prepariamo innanzitutto una soluzione artificiale di emolinfa.Questa soluzione contiene l'ingresso di saccarosio, helo, che deve essere aggiunto all'emolinfa artificiale proveniente da soluzioni madri refrigerate appena prima dell'uso. Per prevenire contaminazioni batteriche, portare l'emolinfa artificiale a temperatura ambiente e ossigenare la soluzione mediante bollicine d'aria per almeno 15 minuti. Successivamente, preparare diverse capillari sottili utilizzando un estrattore standard per pipette, che saranno necessarie per la rimozione dei corpi adiposi nella mosca.Dopo aver preparato tutto, i moscerini adulti devono essere anestetizzati. Questo può essere fatto esponendoli brevemente al gas anestetico per due-cinque minuti, ma è necessario fare attenzione a non lasciare i moscerini nel gas anestetico per più di cinque minuti. Anche un'esposizione a breve termine al freddo può essere utilizzata per anestetizzare i moscerini, ma non si consiglia l'anidride carbonica poiché ha effetti persistenti sulla frequenza cardiaca e sulla motilità.Successivamente, le mosche anestetizzate vengono posizionate con il lato dorsale verso il basso in una piastra di Petri rivestita con uno strato sottile di vaselina. La cuticola idrofoba delle ali e del corpo dovrebbe aderire in modo reversibile alla vaselina, ma la mosca può essere riposizionata se necessario. Viene effettuato un taglio iniziale utilizzando un paio di forbici a molla curve.Questo viene fatto posizionando le lame delle forbici sotto le zampe della mosca e inclinandole verso il basso, in direzione della superficie dorsale vicino al collo. Il cordone nervoso ventrale della testa e le zampe vengono rimossi con un singolo taglio. Il preparato viene quindi immerso nella soluzione artificiale di emo-linfato ossigenata utilizzando forbici a molla.Il margine posteriore dell'addome, costituito dal settimo e dall'ottavo segmento addominale, viene rimosso con un singolo taglio. Questo permette di effettuare tagli laterali lungo entrambi i bordi dell'addome e serve a interrompere la connessione tra l'intestino posteriore e la cuticola addominale. Inserire le lame delle forbici nella piccola apertura situata all'estremità dell'addome e tagliare lateralmente la cuticola.Questo libera un margine del cuticolo ventrale. Afferrare la linguetta con una pinzetta ed eseguire un taglio simile lungo il margine laterale opposto dell'addome. La linguetta libera del cuticolo addominale ventrale può ora essere rimossa.Gli organi addominali, inclusa l'intestino, possono generalmente essere rimossi come un'unica massa utilizzando pinzette da orafo ed esercitando un leggero strappo. La rimozione degli organi interni rivela il tubo cardiaco in battito, che è ancora attaccato alla cuticola dorsale mediante piccoli muscoli arteriosi ed è circondato da corpi adiposi. I capillari estratti vengono inseriti in un tubo di plastica di un sedicesimo di pollice, collegato a una fonte di vuoto.La forza di aspirazione è proporzionale al diametro della punta, quindi non si devono utilizzare pipette con punte di diametro superiore a 40 micron una volta predisposte. Questo sistema di aspirazione serve per rimuovere il grasso in eccesso attorno al tubo cardiaco. Può essere utilizzato anche per eliminare le bolle d'aria che si accumulano attorno alla cuticola e qualsiasi detrito.È necessario prestare la massima attenzione per evitare di toccare direttamente il cuore; poiché la porzione posteriore del cuore è molto fragile, anche questa regione deve essere evitata. Il tubo cardiaco dell'adulto di drosophila è ora esposto e, se necessario, dovrebbe essere in attività contrattile. La cuticola e il cuore ad essa aderente possono essere riposizionati sollevando delicatamente la cuticola dalla gelatina di petrolio e premendola con attenzione nuovamente verso il basso.Evitando qualsiasi contatto con il tessuto cardiaco. A questo punto, la soluzione in cui è immersa la preparazione deve essere sostituita con emolinfa artificiale fresca. Si deve permettere a questa preparazione di equilibrarsi per 20-30 minuti con ossigenazione prima di qualsiasi manipolazione.Se la preparazione deve essere mantenuta per più di 60 minuti, va ripristinata con emolinfa artificiale fresca. Questa preparazione è ora pronta per essere utilizzata per la registrazione ottica e può anche essere impiegata per registrazioni elettrofisiologiche o per manipolazioni istologiche. È richiesta una tecnica diversa per visualizzare il cuore in battito all'interno dei larve.Preparare innanzitutto le lamelle il giorno precedente la procedura. Per farlo, utilizzare uno stuzzicadenti per trasferire circa 50-70 microlitri di soluzione Sard su una lamella di 22 per 22 millimetri. Lasciare indurire il syl guard a 65 gradi Celsius durante la notte.Successivamente, preparare il buffer di Brody e Bates; una volta preparato, gli aliquote possono essere conservati a meno 20 gradi Celsius e scongelati all'occorrenza. Infine, preparare gli strumenti necessari per applicare la colla isto acrale. Per prima cosa, tirare parecchie capillari fini.Successivamente, collegare una punta da pipetta da 1,5 millilitri a un tubicino di plastica di circa un trentaduesimo di pollice di diametro. Inserendo l'estremit&agrave; pi&ugrave; piccola nel tubicino, collegare un capillare con l'apertura larga all'altra estremit&agrave;. Una volta assemblato, caricare il capillare con colla istologica immergendo l'estremit&agrave; del capillare in una goccia di colla ed esercitando una leggera aspirazione attraverso la punta di plastica.Quando si lavora con la colla, è consigliabile avere a disposizione una seconda capillare di vetro per rimuovere l'eccesso di colla dalla punta della capillare contenente la colla. La colla è liquida finché non entra in contatto con soluzione salina tamponata, nella quale si indurisce entro pochi secondi. Tuttavia, di solito rimane plastica abbastanza a lungo da poter essere rimossa dalla punta della capillare o mentre viene applicata al campione.Ora, per iniziare l'immobilizzazione delle larve, posizionare una goccia di colla istologica acrilica vicino a ciascun angolo del syl guard. Aggiungere coprioggetti e 50 microlitri di buffer B e B sulle gocce di colla, che si induriranno immediatamente; riempire lo spazio tra i punti incollati con B e B. La colla manterrà il buffer sul vetrino.Prendere tre larve di L in movimento e posizionarle su un pezzo di carta assorbente bagnata posta sul ghiaccio per due minuti. Questo rallenterà il loro movimento. Successivamente, trasferire le larve nel buffer e orientarle con il lato dorsale rivolto verso l'alto.Questo è il lato delle larve che non presenta le cinture identiche. Applicare rapidamente un po' di colla tra la regione cefalica e la guarnizione della soglia. La colla si indurirà molto rapidamente e impedirà al capo della larva di muoversi.Utilizzando pinzette, afferrare con cura l'animale per le scintille posteriori e allungarlo delicatamente. Fissare le larve in questa posizione applicando la colla lungo entrambi i lati delle larve nella metà posteriore. Per ridurre ulteriori movimenti della cuticola da parte dei muscoli della parete corporea, aggiungere altra colla sui fianchi dell'animale.La larva è ora fissata in questa posizione. Il vetrino coprioggetto può essere posizionato in una piccola capsula di Petri riempita con emolinfa artificiale o PBS; a questo punto i battiti cardiaci possono essere registrati senza interferenze derivanti dai movimenti della parete corporea. Il cuore di *Drosophila* semi-intatto continuerà a battere in modo ritmico per ore dopo la dissezione, se mantenuto in emolinfa artificiale fresca e ossigenata.Un esempio rappresentativo è mostrato qui e nel filmato supplementare uno: cuori di larve di terzo stadio in stella mostrati qui, e moscerini giovani, da una a tre settimane dopo l'ecdisi, mostrano generalmente un battito cardiaco regolare con frequenze comprese tra uno e tre hertz. I moscerini più anziani di tre settimane sono generalmente più aritmici. Tuttavia, questi cuori sono ancora in grado di contrarsi spontaneamente per ore in emolinfa artificiale ossigenata. Cuori e moscerini adulti danneggiati a seguito della procedura di dissezione mostrano tipicamente regioni localizzate di costrizione estrema che non riescono a rilassarsi e spesso si contraggono in modo incontrollabile. Frequenze cardiache inferiori a un hertz sono raramente osservate in moscerini più giovani di tre settimane di età.Di conseguenza, tali preparati sono considerati danneggiati e vengono scartati. Abbiamo appena dimostrato come preparare cuori di moscerini adulti per l'analisi mediante imaging ottico. Ricordare che, durante la preparazione semi-integra, non bisogna mai toccare direttamente il cuore.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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