Visualizzare il cuore pulsante di Drosophila

Verranno qui presentate due tecniche per la visualizzazione di un cuore pulsante in Drosophila per la dissezione del cuore adulto. Innanzitutto, la testa e il torace vengono rimossi con un unico taglio lungo la linea indicata. Successivamente, i genitali vengono rimossi e la cavità del corpo addominale viene aperta usando una pinza nell'intestino e, nel caso di una mosca femmina, le ovaie vengono rimosse.

Il corpo adiposo addominale nei segmenti addominali tre e quattro viene accuratamente aspirato per esporre il cuore adulto all'immobilizzazione del cuore larvale. Una singola larva posta in soluzione tampone viene fissata applicando prima la colla istoacrale intorno alla regione della testa della larva. Le larve vengono delicatamente allungate e viene applicata altra colla all'estremità posteriore e poi sui fianchi della parete del corpo della larva.

Ciao, sono GI Fler. Ciao, sono Karen er. Siamo entrambi membri del programma Development and Aging presso il Burnham Institute for Medical Research.

Oggi vi mostreremo le procedure che abbiamo sviluppato per visualizzare il cuore pulsante di Laval e della drosofila adulta. Usiamo entrambi questi preparati come un modo per visualizzare, esaminare e quantificare i parametri del battito cardiaco nel moscerino della frutta. Drosofila. Prima di iniziare, prepariamo una soluzione di emolinfa artificiale.

Questa soluzione contiene l'ingresso di saccarosio, l'elico, che deve essere aggiunto all'emolinfa artificiale da soluzioni di riserva refrigerate appena prima dell'uso. Al fine di prevenire la contaminazione batterica, portare l'emolinfa artificiale a temperatura ambiente e ossigenare la soluzione facendo gorgogliare aria per almeno 15 minuti. Successivamente, estrarre diversi capillari sottili utilizzando un estrattore per pipette standard, che sarà necessario per la rimozione dei corpi adiposi nel moscerino.

Una volta che tutto è stato preparato, le mosche adulte devono essere anestetizzate. Questo può essere fatto utilizzando una breve esposizione al pisolino al volo per due o cinque minuti, ma fai attenzione a non lasciare le mosche nel pisolino al volo per più di cinque minuti. L'esposizione a breve termine al freddo può essere utilizzata anche per anestetizzare le mosche, ma l'anidride carbonica non è raccomandata poiché ha effetti più duraturi sulla frequenza cardiaca e sulla ità.

Successivamente, le mosche anestetizzate vengono posizionate con il lato dorsale rivolto verso il basso in una capsula di Petri rivestita con un sottile strato di vaselina. La cuticola idrofobica nelle ali e nel corpo dovrebbe aderire in modo reversibile alla gelatina, ma la mosca può essere riposizionata se necessario. Un taglio iniziale viene eseguito utilizzando un paio di forbici a molla curve.

Questo viene fatto posizionando le lame delle forbici sotto le gambe della mosca e inclinate verso il basso verso la superficie dorsale vicino al collo. La testa, il cordone nervoso ventrale e le gambe vengono rimossi con un unico taglio una volta tagliati. Il preparato viene quindi immerso nella soluzione di emolinfa artificiale ossigenata utilizzando le forbici a molla.

La punta posteriore dell'addome, che è composta dai segmenti addominali sette e otto, viene rimossa con un singolo taglio. Questo fornisce l'accesso per eseguire tagli laterali lungo entrambi i bordi dell'addome e serve a recidere la connessione tra l'intestino posteriore e la cuticola addominale. Inserisci le lame delle forbici nella piccola apertura nella punta dell'addome e taglia la cuticola lateralmente.

Questo libera un bordo della cuticola ventrale. Afferra il lembo con una pinza e fai un taglio simile lungo il bordo laterale opposto dell'addome. Il lembo liberato della cuticola addominale ventrale può ora essere rimosso.

L'intestino e altri organi addominali di solito possono essere rimossi come un'unica massa usando una pinza da gioielliere e uno strattone delicato. La rimozione degli organi interni rivela il tubo cardiaco pulsante, che è ancora attaccato alla cuticola dorsale da piccoli muscoli ariesi ed è circondato da corpi adiposi. I capillari estratti vengono inseriti in un tubo di plastica da 16 pollici collegato a una fonte di vuoto.

La forza di aspirazione è proporzionale al diametro del puntale, pertanto le pipette con puntali di diametro superiore a 40 micron non devono essere utilizzate una volta installate. Questo sistema di aspirazione viene utilizzato per aspirare il grasso in eccesso intorno al tubo cardiaco. Può essere utilizzato anche per rimuovere le bolle d'aria che si accumulano intorno alla cuticola ed eventuali detriti.

Bisogna prestare la massima attenzione per evitare di toccare il cuore stesso e, poiché la parte posteriore del cuore è molto fragile, quella regione dovrebbe essere evitata insieme. Il tubo cardiaco adulto della drosophila è ora esposto e dovrebbe battere se necessario. La cuticola e il cuore attaccato possono essere riposizionati sollevando delicatamente la cuticola dalla vaselina e pressandola di nuovo con cura.

Evitare qualsiasi contatto con il tessuto cardiaco. A questo punto, la soluzione che bagna il preparato deve essere sostituita con emolinfa artificiale fresca. Questo preparato deve essere lasciato equilibrare per 20-30 minuti con ossigenazione prima di qualsiasi manipolazione.

Se il preparato deve essere mantenuto per più di 60 minuti, deve essere riperfuso con emolinfa artificiale fresca. Questo preparato è ora pronto per essere utilizzato per la registrazione ottica e può essere utilizzato anche per la registrazione elettrofisiologica o per manipolazioni istologiche. È necessaria una tecnica diversa per visualizzare il cuore che batte all'interno delle larve.

Innanzitutto, prepara i vetrini il giorno prima della procedura. Questo viene fatto usando uno stuzzicadenti per trasferire circa 50-70 microlitri di soluzione di Sard su un vetrino coprioggetti di 22 x 22 millimetri. Lascia indurire la syl guard a 65 gradi Celsius durante la notte.

Successivamente, prepara il tampone Brody e Bates una volta preparato, le aliquote possono essere conservate a meno 20 gradi Celsius e scongelate quando necessario. Infine, preparare gli strumenti necessari per applicare la colla storica. Per prima cosa, estrai diversi capillari sottili.

Quindi, collegare un puntale per pipetta da 1,5 millilitri con un piccolo tubo di plastica di circa 32 pollici di diametro. Inserendo l'estremità più piccola nel tubo, inserire un capillare con la sua ampia apertura all'altra estremità. Una volta installato, caricare il capillare con la colla histo immergendo il capillare in una goccia di colla e aspirando delicatamente la punta di plastica.

Quando si lavora con la colla, si dovrebbe avere a portata di mano un secondo capillare di vetro per rimuovere la colla in eccesso dalla punta del capillare della colla. La colla è liquida fino a quando non viene a contatto con soluzione salina tamponata, dove si indurirà entro un paio di secondi. Tuttavia, di solito rimane di plastica abbastanza a lungo da poter essere rimosso dalla punta del capillare della colla o durante l'applicazione sul campione.

Ora per iniziare l'immobilizzazione delle larve, posizionare una goccia di colla istoacrale vicino a ciascun angolo della protezione sillabare. I vetrini coprioggetti aggiungono 50 microlitri di tampone B e B alle gocce di colla, che si induriranno istantaneamente riempiendo lo spazio tra i punti incollati con b e b. La colla manterrà il tampone sul vetrino.

Prendi una L tre larve vaganti e posizionala su un pezzo di carta velina bagnata sul ghiaccio per due minuti. Questo rallenterà il suo movimento. Successivamente, trasferisci le larve nel tampone e orientalo con il lato dorsale rivolto verso l'alto.

Questo è il lato delle larve a cui mancano le cinture identiche. Applicare rapidamente un po' di colla tra la regione della testa e la protezione del davanzale. La colla si indurirà molto rapidamente e impedirà alla testa delle larve di muoversi.

Usando il forcipe, afferra con cura l'animale per le scintille posteriori e allungalo delicatamente. Fissare le larve in questa posizione applicando la colla lungo entrambi i lati delle larve nella metà posteriore. Per ridurre ulteriormente il movimento della cuticola da parte dei muscoli della parete del corpo, aggiungere più colla ai fianchi dell'animale.

La larva è ora fissata in questa posizione. Il vetrino coprioggetto può essere inserito in una piccola capsula di Petri riempita con emolinfa artificiale o i battiti cardiaci PBS possono ora essere registrati senza interferenze da movimenti della parete corporea. Il cuore adulto di drosofila semi intatto batterà ritmicamente per ore dopo la dissezione, se mantenuto in emolinfa artificiale ossigenata fresca.

Un esempio rappresentativo è mostrato qui e nel film supplementare uno cuori dal terzo nelle larve stellari mostrate qui, e le giovani mosche da una a tre settimane dopo l'elo generalmente mostrano un battito cardiaco regolare a velocità comprese tra uno e tre hertz, le mosche più vecchie di tre settimane generalmente sono più aritmiche. Tuttavia, questi cuori sono ancora in grado di battere spontaneamente per ore nei cuori di emolinfa artificiale ossigenata e i moscerini adulti che vengono danneggiati a seguito della procedura di dissezione mostrano tipicamente regioni localizzate di estrema costrizione che non sono in grado di rilassarsi e spesso sono incontrollabili. Frequenze cardiache più lente di un Hertz sono raramente osservate nei moscerini di età inferiore alle tre settimane.

Di conseguenza, tali preparati sono considerati danneggiati e vengono scartati. Abbiamo appena dimostrato come preparare cuori di moscerino della frutta livellati e adulti per l'imaging ottico. Ricorda, quando fai il preparato semi integro non toccare mai il cuore stesso.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.