Name: Cultura e manutenzione di cellule staminali embrionali umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-22T16:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Impara le tecniche di coltura e manutenzione di cellule staminali embrionali umane indifferenziate. Questo protocollo dettagliato mostra come nutrire, rimuovere la differenziazione e passare le cellule HES in sicurezza.

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1. Manutenzione: Culture osservare al microscopio <ol><li> Rimuovere una piastra di cellule hES dal 37 ° C incubatore e portare al microscopio. </li><li> Osservare le colonie a bassa potenza, con ingrandimento 2X o 5X, per valutare la qualità complessiva della cultura. Tenere presente quanto segue: colore normale media, assenza di contaminazione visibile, la dimensione complessiva colonia, qualità e densità, e altre osservazioni. </li><li> Osservare i cambiamenti di colore medio. A causa del cambiamento del pH e l&#39;esaurimento dei nutrienti nel terreno dopo una notte di incubazione con le cellule HES, la media cambierà da un colore rosso ad un colore &quot;paglia&quot;. Se il mezzo sembra viola, una variazione del pH di base si è verificato. Se il mezzo appare estremamente giallo, il mezzo si è acidificato. Mezzo molto giallo può essere il risultato di colonie di estremo sovraffollamento nel pozzo o di contaminazione. Il mezzo deve apparire chiaro in ogni momento. Anche se un certo livello di detriti cellulari nel mezzo è normale, non dovrebbe mai apparire nuvoloso. Se un alto livello di detriti cellulari si osserva, la cultura non è sano e può essere contaminato. </li><li> Se le culture non necessitano di manutenzione o passaging, possono essere adottate per la cappa di sicurezza biologica di essere alimentato (vedi sezione 2). </li><li> Se le culture contengono più del 10% circa differenziare le colonie, le cellule devono essere &quot;ripulita&quot; da rimuovere manualmente le zone differenziate (vedi sezione 3). </li><li> Se le culture contengono colonie di grandi dimensioni o dense o il livello alimentatore MEF è più di 12 giorni, le cellule dovrebbero essere diversi passaggi (vedi sezione 4). </li></ol> 2. Alimentazione hES Cellule <ol><li> In un armadio di sicurezza biologica sterile, rimuovere il coperchio del piatto cultura e aspirare il terreno spesi. Non lasciare che la punta della pipetta di toccare qualsiasi parte della targa diversa direttamente all&#39;interno dei pozzi. Se non vi è alcuna preoccupazione di contaminazione, passare a una nuova, pipetta sterile. </li><li> Utilizzando una pipetta sterile di vetro, aggiungere la giusta quantità di caldo terreno di coltura cellulare hES in ciascun pozzetto. Per le culture in un 6-pozzetti, aggiungere 2,5 ml di mezzo di ogni bene. </li><li> Riportare la piastra per l&#39;incubatore di rimanere a 37 ° C e 5% di CO 2. </li></ol> 3. Rimozione differenziazione da colture di cellule hES <ol><li> Trasformare da 9 pollici in vetro pipette Pasteur in strumenti di raccolta per stampaggio le punte sopra la fiamma controllata di un bruciatore ad alcol. Assicurarsi che la punta della pipetta è sigillato per evitare contaminazione e arrotondati per evitare di graffiare la plastica del piatto cultura. Sterilizzare gli strumenti di raccolta prima dell&#39;uso utilizzando la fonte di luce UV nella cappa di sicurezza biologica o raccolta custodia. </li><li> Rimuovere le zone differenziate. La differenziazione avviene spesso in solo una parte di una colonia di cellule hES, di solito lungo i bordi o come punti isolati al centro. Se solo una parte di una colonia è differenziare, solo l&#39;area differenziata deve essere rimosso. La differenziazione può spesso sollevare la piastra in un foglio di &quot;appiccicoso&quot;, ed è utile per separare prima le cellule differenziate dal resto della colonia disegnando una linea attraverso la colonia con la fine dello strumento di prelievo. </li><li> Una volta che i pezzi della colonia sono separati, dolcemente scivolare lo strumento di raccolta lungo la piastra per staccare le cellule indesiderate. Fare attenzione a non raschiare troppo dello strato di alimentatore MEF tra le colonie in questo processo. </li><li> Quando tutte le cellule differenziate vengono rimosse dalla piastra (e galleggiante nel mezzo), riportare la cultura alla cappa di sicurezza biologica. Aspirare il terreno contenente le cellule differenziate e sostituire con nuove terreno di coltura di cellule HES. </li></ol> 4. Passaging hES Cellule Enzima Incubazione <ol><li> In un armadio di sicurezza biologica sterile, rimuovere il coperchio del 6 ben piatto cultura e aspirare il medio speso dai pozzi di essere diversi passaggi. Non lasciare che la punta della pipetta di toccare qualsiasi parte della targa diversa direttamente all&#39;interno dei pozzi. </li><li> Utilizzando una pipetta sterile di vetro, aggiungere 1 ml di collagenasi IV riscaldato in ciascun pozzetto di essere diversi passaggi. </li><li> Ritorna la piastra ai 37 ° C incubatore per 5 minuti. </li></ol> Raschiatura e pooling delle Cellule hES <ol start="4"><li> Dopo aver incubato le cellule con collagenasi, osservare le colonie al microscopio. L&#39;enzima dovrebbe causare un cambiamento sottile ma visibile nei bordi colonia. </li><li> Nella cappa di sicurezza biologica, delicatamente aspirato l&#39;enzima di ogni bene e sostituirlo con medie 2,0 ml di coltura cellulare hES. </li><li> Pendere l&#39;ago della piastra di coltura leggermente verso voi e prendere il medium da 2,0 ml nel primo pozzo con una pipetta di vetro 5 ml. Tenendo la pipetta perpendicolare al fondo del piatto, delicatamente scivolare la punta della pipetta tutto il bene mentre rilasciando lentamente il mezzo. </li><li> Ripetere la raschiatura e pipettitempi di movimento ng 3-4 finché tutte le colonie sono state rimosse dal pozzo. Pipettare delicatamente per evitare di rompere le colonie in troppo piccoli pezzi. Quando le cellule sono state rimosse dal primo pozzo, lasciare i contenuti nel bene e iniziare raschiare le cellule off del prossimo bene. </li><li> Quando tutti i pozzi da diversi passaggi sono stati raschiati, piscina per il supporto contenente i pezzi colonia di ogni bene in un tubo sterile 15 ml. </li><li> Sciacquare i pozzi raschiata con l&#39;aggiunta di 1 ml di terreno di coltura cellulare hES in ciascun pozzetto. Raccogliere questa risciacquare e trasferimento al tubo conico. </li><li> Pipettare delicatamente le cellule nel tubo di rompere i pezzi colonia fino alla dimensione desiderata. </li><li> Centrifugare le cellule per 5 minuti a 200 x g. </li></ol> Placcatura Celle cella hES <ol start="12"><li> Mentre le cellule hES sono nella centrifuga, preparare un nuovo cambio a 6 pozzetti alimentatore MEF. Etichettare il piatto con le informazioni appropriate cellule hES: linea cellulare, numero nuovo passaggio, il passaggio e la data. Aspirare il terreno MEF dai pozzetti e aggiungere 1,0 ml di PBS in ciascun pozzetto. Capovolgere delicatamente il tampone intorno ai pozzi ed aspirare il lavaggio PBS. Aggiungere 1,5 ml di cellule hES terreno di coltura in ciascun pozzetto e impostare il piatto da parte. </li><li> Quando le cellule sono finiti hES centrifugazione, portare la metropolitana per tornare alla cabina di sicurezza biologica. Aspirare il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il vagamente ricco di pellet. </li><li> Risospendere le cellule del pellet con il mezzo sufficiente per 1 ml di terreno di coltura di cellule hES per bene a essere placcato. Quando si divide in 6 nuovi pozzi, risospendere il pellet in 6 ml di mezzo. </li><li> Delicatamente e in modo uniforme aggiungere 1 ml di sospensione cellulare ad ogni preparato pozzetto della piastra di alimentazione MEF. </li><li> Collocare la piastra nel 37 ° C incubatore e con attenzione scorrere la piastra in avanti a indietro, e un lato all&#39;altro per distribuire uniformemente le cellule in tutto il bene. </li><li> Permettono alle cellule di fissare a 37 ° C durante la notte. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Cellule indifferenziate hES sono piccoli, fitto, e di solito consistono di diffusione più grande, più le cellule. La differenziazione può avvenire all&#39;interno di una colonia (Figura 1A) o tra le colonie (Figura 3B). Morhopologies differenti può essere visto sotto bassi ingrandimenti al microscopio. Una buona morfologia cellulare, come si vede nella Figura 2A, contiene piccole celle fitto che crescono in un monostrato. Le cellule devono essere puliti, bordi definiti, con poco o nessun differenziazione. Le cellule mostrato nella figura 2B sono pronti per passaging, e le cellule mostrato nella Figura 2C sono sovraffollati. <img src="/files/ftp_upload/1427/1427fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Differenziazione nelle culture hES. (A) la differenziazione di una colonia (B) differenziazione tra colonie. <img src="/files/ftp_upload/1427/1427fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Morfologie visto nelle culture hES. (A) la morfologia cellulare buono (B), le cellule hES che sono pronti per passaging (C) celle sovraffollate.

<ol><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+Animal+Cells%3A+A+Manual+of+Basic+Technique%22">Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique</a>. , 5th edition, Wiley-Liss. (2005).</li>
</ol>

Sterilità deve essere mantenuto in ogni momento quando si lavora con le cellule HES. Pulire e sterilizzare la cappa di sicurezza biologica e tutte le attrezzature prima dell&#39;uso. Tutti i reagenti devono essere filtrati con un filtro di dimensione dei pori 0,22 micron prima dell&#39;uso. L&#39;uso di antiboiotics in coltura cellulare hES non è necessario e deve essere evitato. Un ambiente separato deve essere impostato come una stazione di raccolta designato. L&#39;involucro sterile per la stazione può essere un contenitore statico (come ad esempio una workstation PCR) con una sorgente di luce UV, una cappa a flusso laminare, o una cappa di sicurezza biologica. Un microscopio da dissezione all&#39;interno della stazione di prelievo è necessario per osservare le colonie come le zone differenziate vengono rimossi. Il pannello di vetro frontale di un contenitore statico o di una cappa di sicurezza biologica deve essere modificato per consentire la oculari del microscopio per estendere attraverso il pannello senza compromettere il corretto flusso e la sterilità. Per mantenere sano hES colture cellulari, le cellule devono essere diversi passaggi al momento ottimale, di solito ogni 4-7 giorni. In questo momento le colonie hanno raggiunto la loro dimensione massima e può iniziare ad unire. Colonie unite possono aumentare il tasso di differenziazione nella cultura. Rapporti di Spalato rientrano generalmente 1:03-1:05, a seconda del numero di colonie placcato, il tasso di espansione e condizioni di coltura. Colonie Overplated (rapporto di divisione troppo basso) probabilmente si fondono prematuramente e devono essere diversi passaggi prima che raggiungano la loro dimensione massima. Culture su uno strato alimentatore MEF che è più di 2 settimane di vita devono essere diversi passaggi a nuove MEF che sosterrà la crescita indifferenziata e la proliferazione. Dal momento che la differenziazione si verifica naturalmente in colture cellulari hES, una piccola quantità è previsto. Differenziazione frequente o eccessiva può verificarsi se le culture non ricevono cure adeguate. Le cellule devono essere nutriti ogni giorno, crescita eccessiva tra i passaggi dovrebbero essere evitati. Utilizzare sempre i reagenti freschi. Tutti i media, MEF e reagenti devono essere utilizzati entro 14 giorni di tempo per evitare la crescita delle cellule indifferenziate hES. Nuovi lotti di reagenti, come la sostituzione Knockout Serum, FBS e MEF, devono essere sottoposti a screening prima dell&#39;uso. Ricorda che tutte le cellule differenziate non rimossi prima passaging saranno trasferiti alle nuove culture. Inoltre, cercare di mantenere le cellule a 37 ° C, quando possibile. Ridurre al minimo il tempo le cellule passano al di fuori dell&#39;incubatore (ad esempio sul palco microscopio o nella cabina di sicurezza biologica.) Una fase microscopio riscaldata può essere molto utile se le cellule saranno dell&#39;incubatore per lunghi periodi di tempo. Osservando le colture cellulari hES sotto il microscopio, in primo luogo valutare la qualità complessiva e le dimensioni delle colonie vista con un basso consumo (2x o 5x) obiettivo. Se le cellule potenzialmente differenziati sono osservati a bassa potenza, confermare la morfologia differenziata con un obiettivo più alto ingrandimento (10X). Immediatamente dopo la rimozione di differenziazione, i bordi delle colonie possono apparire irregolari o danneggiati. Incubare le colonie durante la notte in un mezzo fresco per permettere alle cellule indifferenziate rimanenti per recuperare. Senza l&#39;influenza di differenziazione nella cultura, queste colonie rimanenti continueranno a proliferare normalmente. Se possibile, iniziare gli esperimenti con basso passaggio cellule HES. Cariotipo delle cellule prima e dopo tutti gli esperimenti più importanti.

<table><tbody><tr><td>D-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td>Per mezzo MEF</td></tr><tr><td>Serum Fetale Bovino (FBS), Certificato</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td>Inattivato termicamente&lt;br/&gt;Per mezzo MEF</td></tr><tr><td>D-MEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Knockout&amp;#8482; Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>Pre-screening per garantire il supporto delle cellule staminali embrionali umane</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Stemgent</td><td>03-0002</td><td>Usare a [4 ng/mL] finale</td></tr><tr><td>Aminoacidi Non Essenziali</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>200 mM (100X)&lt;br/&gt; Usare a [1X] finale</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td>Senza Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; o Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Collagenasi IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td>Preparare una soluzione fresca a 1 mg/mL in D-MEM/F-12</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>Tipo A, da suino</td></tr><tr><td>Serum Fetale Bovino (FBS), Definito</td><td>Hyclone</td><td>SH300.70.01</td><td>Per mezzo di congelamento</td></tr><tr><td>Piastre a 6 pozzetti</td><td>Nalge Nunc international</td><td>140675</td><td>Per colture generali</td></tr><tr><td>Piastre a 4 pozzetti</td><td>Nalge Nunc international</td><td>176740</td><td>Per scongelamento</td></tr><tr><td>Pipette di vetro da 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-27E</td><td>Confezionate singolarmente</td></tr><tr><td>Provette coniche da 15 mL</td><td>Corning</td><td>430052</td><td>In polipropilene</td></tr><tr><td>Pipette di Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td>9&amp;#8221; in vetro</td></tr></tbody></table>

cultura e manutenzione di cellule staminali embrionali umane

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Staminali embrionali umane (HES), le cellule devono essere monitorati e curati al fine di mantenere sano, culture indifferenziato. Come minimo, le culture devono essere nutriti ogni giorno eseguendo un cambiamento completo di media per ricostituire i nutrienti perduti e per mantenere le culture senza fattori di differenziazione indesiderati. Sebbene una piccola quantità di differenziazione è normale e previsto in colture di cellule staminali, la cultura dovrebbe essere regolarmente ripulito da rimuovere manualmente, o &quot;picking&quot; zone differenziate. Identificare e rimuovere l&#39;eccesso di differenziazione da colture di cellule hES sono tecniche essenziali per il mantenimento di una popolazione sana di cellule.

Questo protocollo dimostra come mantenere sani, indifferenziate staminali embrionali umane (ES) cellule.

Cultura e manutenzione di cellule staminali embrionali umane

Le cellule staminali embrionali umane (hES) devono essere monitorate e curate per mantenere colture sane e indifferenziate. Al minimo, le colture devono essere...

Ciao, sono Leah Kent di STEM Gent. Oggi vi mostreremo le procedure per l'alimentazione, la rimozione della differenziazione e il confezionamento di cellule staminali embrionali umane. Utilizziamo queste tecniche nel nostro laboratorio per la coltura e la manutenzione di routine delle cellule HES.Iniziamo. La qualità complessiva della coltura viene valutata osservando le colonie a basso ingrandimento, utilizzando un aumento di due x o cinque x. Osservando le cellule al microscopio, prendere nota dei seguenti parametri: colore normale del mezzo, assenza di contaminazioni visibili, dimensione e densità delle colonie, e qualità complessiva delle cellule.Il mezzo di coltura fresco per cellule staminali umane normalmente ha un colore arancione o giallo paglierino dopo un'incubazione notturna. Il mezzo di coltura appare spesso più giallo a causa del cambiamento di pH e dell'esaurimento dei nutrienti nel mezzo. Se il mezzo appare viola come mostrato in questo esempio, si è verificato un aumento del pH.Se il mezzo appare estremamente giallo, significa che si è acidificato, il che potrebbe essere causato da colonie eccessivamente sovraffollate o da contaminazione. Il mezzo dovrebbe apparire sempre chiaro. Se la coltura non contiene colonie grandi o dense, le cellule non necessitano di essere confezionate, ma richiedono comunque il cambio del mezzo ogni giorno.Portare le cellule nell'armadio di sicurezza biologica. Rimuovere il coperchio della piastra di coltura ed aspirare il mezzo usato. Non permettere alla punta della pipetta di toccare alcuna parte della piastra al di fuori delle singole pozzette.Utilizzando una pipetta sterile, aggiungere la quantità appropriata di mezzo di coltura riscaldato per cellule staminali umane in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti, con 2,5 millilitri di mezzo per pozzetto; dopo aver nutrito le cellule, reinserire la piastra nell'incubatore. La differenziazione si verifica comunemente ai margini delle colonie di cellule staminali embrionali umane. Utilizzando un microscopio e uno strumento sterile per il prelievo, le cellule differenziate possono essere delicatamente rimosse dai bordi della colonia, lasciando indietro le cellule indifferenziate.Per la coltura continuata, lo stesso procedimento può essere utilizzato quando si rimuovono le cellule differenziate dal centro di una colonia, lasciando un anello di cellule staminali embrionali umane indifferenziate attorno all'area delle cellule rimosse. Se la coltura contiene più del 10% di colonie in differenziamento, le cellule devono essere ripulite rimuovendo manualmente le aree differenziate. Per fare ciò, trasformare innanzitutto nove pipette di vetro da nove pollici in strumenti da prelievo.Modellando le punte sulla fiamma controllata di un becco Bunsen, assicurarsi che la punta della pipetta sia sigillata per prevenire contaminazioni e arrotondata. Per evitare di graffiare la plastica della piastra di coltura prima di utilizzare gli strumenti di selezione, sterilizzarli mediante la sorgente di luce UV all'interno della cappa a sicurezza biologica per 15-20 minuti. Per rimuovere le cellule differenziate, separarle prima dal resto della colonia tracciando una linea attraverso la colonia con l'estremità dello strumento di selezione.Dopo aver separato i frammenti della colonia, far scorrere delicatamente lo strumento di prelievo lungo la piastra per staccare le cellule indesiderate. Prestare attenzione a non asportare troppo dello strato di supporto di metionina presente tra le colonie durante questa operazione. Quando tutte le cellule differenziate sono state rimosse dalla piastra e galleggiano nel mezzo, trasferire la coltura nell'armadio di sicurezza biologica.Aspirare il mezzo contenente le cellule differenziate e sostituirlo con un nuovo mezzo di coltura per cellule staminali umane. Mezzo per il passaggio. Cellule staminali umane. Le colonie vengono delicatamente raschiate dalla superficie della piastra di coltura utilizzando una pipetta serologica, dopo una breve incubazione enzimatica, quando si desidera che tutte le colonie nei pozzetti vengano passate. I frammenti di colonia vengono raccolti in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugati per ottenere un pellet cellulare poco compatto. Il soprannatante viene quindi rimosso e il pellet cellulare viene risospeso in cellule di dimensioni appropriate.Aggregati mediante pipettaggio in mezzo ESL umano fresco. Dopo aver risciacquato una nuova piastra da coltura contenente uno strato di alimentazione di MEF appena irradiato, le cellule staminali embrionali umane vengono distribuite uniformemente tra le pozzette della nuova piastra e lasciate aderire per tutta la notte. Se la coltura contiene colonie grandi o dense, oppure se lo strato di alimentazione di MEF ha più di 12 giorni, le cellule devono essere passate in un armadio a sicurezza biologica sterile.Rimuovere il coperchio della piastra colturale a sei pozzetti ed aspirare il mezzo usato dai pozzetti da sottopassare a passaggio. Utilizzando una pipetta di vetro sterile, aggiungere un millilitro di collaghenasi quattro riscaldata in ciascun pozzetto da sottopassare a passaggio. Reintrodurre la piastra nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per cinque minuti.Dopo i cinque minuti, osservare le colonie al microscopio. L'enzima dovrebbe causare un cambiamento sottile ma osservabile nei bordi delle colonie. Questi diventano più definiti e può apparire un alone chiaro attorno ad essi.Nella cappa a sicurezza biologica, aspirare delicatamente l'enzima da ogni pozzetto e sostituirlo con due millilitri di mezzo di coltura per cellule staminali umane. Inclinare leggermente la piastra di coltura verso di sé e aspirare i due millilitri di mezzo. Nel primo pozzetto, utilizzare una pipetta in vetro da cinque millilitri, tenendo la pipetta perpendicolare al fondo della piastra, facendo scivolare delicatamente la punta della pipetta lungo il pozzetto.Mentre si rilascia lentamente il mezzo. Ripetere questo movimento di raschiamento e pipettaggio da tre a quattro volte fino a quando tutte le colonie sono state rimosse dal pozzetto. Quando le cellule sono state rimosse dal primo pozzetto, lasciare il contenuto all'interno del pozzetto e iniziare a raschiare le cellule dal pozzetto successivo.Una volta raschiate tutte le pozzette da sottopassare a passaggio, raccogliere il mezzo contenente i frammenti di colonie da ogni pozzetta in un tubo conico sterile da 15 millilitri; pipettare delicatamente per evitare di frammentare ulteriormente le colonie in pezzi troppo piccoli. Risciacquare le pozzette raschiate aggiungendo un millilitro di mezzo di coltura per cellule staminali umane in ciascuna.Recuperare questa soluzione di risciacquo e trasferirla nel tubo conico, pipettando delicatamente sulle cellule nel tubo per frammentare i pezzi di colonia alla dimensione desiderata. Centrifugare le cellule per cinque minuti a 200 G mentre le cellule staminali umane vengono centrifugate. Preparare una nuova piastra con sei pozzetti contenente fibroblasti nutritivi inattivati. Etichettare la piastra con le informazioni appropriate sulla linea cellulare di cellule staminali umane, il nuovo numero di passaggio e la data del passaggio. Aspirare il mezzo meth dai pozzetti e aggiungere un millilitro di PVS a ciascuno. Ruotare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente il buffer nei pozzetti, quindi aspirare il lavaggio con PBS.Aggiungere 1,5 millilitri di coltura di ESL umano. Mezzo in ogni pozzetto e mettere da parte la piastra. Dopo che le cellule staminali umane sono state centrifugate, riportare il tubo all'interno della cappa a sicurezza biologica.Aspirare il soprannatante, avendo cura di non disturbare il pellet cellulare poco compatto. Risospendere le cellule nel pellet con una quantità sufficiente di mezzo per un millilitro di coltura di ESL umana, mezzo per ogni nuova pozzetta da seminare.Ad esempio, quando si suddivide in sei nuovi pozzetti, risospendere il pellet in sei millilitri di mezzo. Pipettare delicatamente le colonie per frammentarle in pezzi della dimensione appropriata e per disperdere uniformemente i frammenti di colonia. Aggiungere un millilitro di sospensione cellulare in ciascun pozzetto preparato della piastra con fibroblasti MEF come feeder.Posizionare la piastra nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e far scivolare con attenzione la piastra avanti e indietro, poi lateralmente, per distribuire uniformemente le cellule in tutta la pozzetta. Lasciare attaccare le cellule a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Le cellule staminali umane differenziate possono presentare una gamma di morfologie, ma di solito consistono in cellule più grandi e più estese.La differenziazione può avvenire all'interno di una colonia o tra colonie diverse. Queste sono le diverse morfologie delle colture di cellule staminali umane che possono essere osservate a bassa ingrandimento al microscopio. Una buona morfologia cellulare e delle colonie appare in questo modo.Le cellule sono molto piccole, strettamente impacchettate e crescono in un monostrato. Le colonie devono avere margini netti e ben definiti, con scarsa o nulla differenziazione. Per mantenere colture sane di ESL umane, le cellule devono essere sottoposte a passaggio al momento ottimale.Le colonie pronte per l'allestimento hanno quasi raggiunto la dimensione massima, ma non hanno ancora iniziato a fondersi tra loro o a differenziarsi. Non aspettare che le colonie siano sovrasviluppate prima di passarle. Abbiamo appena mostrato come mantenere colture sane di cellule HES seguendo queste procedure.Assicurarsi di mantenere una buona tecnica sterile e conservare sempre una copia di backup. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Propagazione di staminali embrionali umane (ES) Cellule

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