Name: Fosfoproteomica quantitativa in acidi grassi Stimolati Saccharomyces cerevisiae /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-12T23:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: Scopri la fosfoproteomica quantitativa in Saccharomyces cerevisiae stimolata da acidi grassi. Questo metodo combina criolisi, frazionamento HILIC e arricchimento IMAC per analizzare i meccanismi di segnalazione cellulare mediante spettrometria di massa.

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Vorremmo ringraziare il Dott. Rogers Ricco di assistenza tecnica con analisi di spettrometria di massa e utili discussioni, e Drs. Rob Moritz, Jeff Ranish, e Hamid Mirzai per utili discussioni. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH Centri di Eccellenza.

La crescita delle cellule e dei media <ol><li> Una singola colonia di cellule BY4742Δarg4Δlys1 durante la notte in 100 ml di mezzi di comunicazione ricco di un OD 600 di 1,0 allora seme in due culture, 1 litro di un mezzo di lievito minimo (0,17% lievito di base di azoto, senza solfato di ammonio o amminoacidi, solfato di ammonio 0,5%) contenente un gamma completa di aminoacidi, integrata con 20 mg / L di arginina isotopi normale o pesante (13 C 6 15 N 4; Isotec) e lisina (13 C 6 15 N 2; Isotec). </li><li> Le cellule sono state coltivate per 18 ore, ad un OD 600 del 1.8. E &#39;fondamentale che le cellule passano attraverso almeno 9 generazioni per raggiungere piena integrazione dei isotopi etichettati. Il campione luce era pellet, lavato con acqua sterile, reseeded in un oleato contenente medio (isotopicamente normale arginina e lisina, 0,2% Oleato (chimici Sigma) e 0,5% di Tween 40 (Sigma Chimica)) e stimolati per altri 85 minuti. Questo produce un isotopicamente luce, per quanto riguarda l&#39;arginina e lisina, oleato stimolati campione e un isotopi pesanti di glucosio-cresciuto campione di riferimento. </li></ol> Cellula Lysis, Isolamento e frazionamento dei peptidi <ol start="3"><li> Pesare bottiglia centrifuga. Raccolta di campioni mediante centrifugazione per 3 minuti. Rimuovere i supporti ed aspirare il liquido in eccesso. Pesare pellet e bottiglia (in genere di rendimento tra i 1-2 grammi) e poi congelare il flash in azoto liquido. Aggiungi un equivalente volume a peso pellet di tampone &#39;macinazione&#39; per i pellet congelato in azoto liquido (tampone fosfato isotonico (PBS, Gibco), 10% glicerolo, inibitori della proteasi (SigmaFAST compresse inibitore della proteasi, Sigma) e gli inibitori della fosfatasi HALT (Thermo Scientific )). </li><li> Congelare la nave macinazione in azoto liquido. Attendere che l&#39;azoto liquido cessa bollente. Trasferire il pellet alla nave di rettifica, con cuscinetti a sfera congelata. </li><li> Grind a 600 giri al minuto con un min 1 ciclo di 20 secondi con una inversione di direzione per 3 minuti. Ricongelare la nave macinazione in azoto liquido. Ripetere 4 volte per 15 minuti il ​​tempo totale di macinazione. </li><li> Raccogliere la grindate congelato in un luogo ghiaccio 50ml tubo Falcon asciutto. Conservare a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Ottenere una soluzione 10 ml di urea 8M, bicarbonato di ammonio 0,1 M, 0,1 M Tris pH 8.6. Aggiungere 3 volumi del buffer di urea al 1 ° volume del grindate congelati (per esempio 3mls del buffer di urea aggiunto a un grammo 1 pellet con 1 ml di tampone PBS). Immediatamente sonicare la miscela con un sonicatore punta della sonda (2 - 10 impulsi al secondo). Tenere la punta vicino al fondo della provetta per evitare formazione di schiuma nella soluzione. Il grindate dovrebbe immediatamente andare in soluzione. </li><li> Cancella il lisato per centrifugazione per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Trasferire il supernatante in tubi di fresco. </li><li> Fai una nuova aliquota di 0,5 M Tris [2-carbossietil] fosfina (TCEP). Aggiungi a campione a 1:100 per una concentrazione 5mM finale. Incubare a 37 ° C per 1 h. </li><li> Alchilazione di cisteine ​​ridotte. Lasciare raffreddare a temperatura ambiente. Fai una nuova aliquota di Iodoacetamide 1M. Tenere al buio (ci avvolgere il tubo in alluminio). Aggiungere a una concentrazione finale di 20 mm. Incubare al buio per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Placare la Iodoacetamide con DTT 20 mM da uno stock 1M a temperatura ambiente per 1 h. </li><li> Quantificare la proteina con una Bradford standard o BCA test (non descritto). Prelevare un campione per l&#39;analisi di SDS PAGE seguito. </li><li> Per convalidare l&#39;incorporazione degli isotopi pesanti, usare 100 ml di lisato ridotto e alchilata. Diluire 1:4 con dH 2 O, ultrasuoni e aggiungere tripsina a 50:1 proteine ​​tripsina. Digest per un minimo di 4 ore, campione secco giù in una velocità di vac e poi desalt con colonne Ultramicrospin C18 (il gruppo Nest). <ol><li> Idrato colonna con 100 ml di Acetonitrile </li><li> Equilibrare con 200 microlitri TFA 0,1%. </li><li> Risospendere campione secco in 200 microlitri TFA 0,1%. Caricare sulla colonna. Centrifugare a ~ 200 xg o la velocità minima necessaria per il flusso attraverso la colonna. </li><li> Lavare due volte con 200 microlitri TFA 0,1%. </li><li> Eluire con due volte con 50 microlitri Acetonitrile 60%, 0,1% TFA. </li><li> Campione secco a una velocità di vac. </li><li> Campione Risospendere in 20 microlitri di acido formico 0,1%. Run 2 microlitri su uno spettrometro di massa. Controllare l&#39;incorporazione di arginina e lisina isotopi pesanti da uno spostamento 10 e 8 Dalton nelle rispettive m / z spettri. L&#39;incorporazione di ogni amminoacido deve essere tra 96 ​​- 98%. </li></ol></li><li> Mix importi equivalenti (mg di proteine) dei campioni isotopi pesanti e leggeri. </li><li> Diluire il campione 1:4 con 20% di metanolo. </li><li> Aggiungi tripsina a 1:200. Incubare per una notte a 37 ° C. </li><li> Controllare che la digestione è andato a compimento da SDS PAGE. Run 2 e 4 ml di campione predigestione e 8 unod 16 microlitri della tripsina posta digerire. Visualizzate dalla colorazione Coomassie che la digestione è completa. Se non è completa, sonicare il campione con un breve sonicatore punta della sonda e digerire di nuovo con tripsina. </li><li> Secco il campione giù in una velocità di vac. Quando aggiungete a secco 200 ml di filtrato dH 2 O e agitare fino a pellet va in soluzione. Campione secco giù in una velocità di vac. Risospendere di nuovo con dH 2 O. Campione secco di nuovo. </li><li> Risospendere il pellet in 0,1% Acido Trifluoracetic (TFA, Sigma). Verificare che il pH è di circa 3 con strisce pH. Se necessario acidificare con il 10% TFA. </li><li> Pellet qualsiasi precipitato. </li><li> Desalificare i campioni su un set-Pak Waters Vac 500 mg colonna C18. Non sovraccaricare queste colonne. L&#39;importo massimo è di 5 mg, ma è meglio caricare un po &#39;meno. Dividere il campione tra i più colonne, se necessario. <ol><li> Idratare la colonna con 5 ml di acetonitrile al 100%. Centrifugare a ~ 200 xg o la velocità minima necessaria per il flusso attraverso la colonna. </li><li> Equilibrare colonna con 5ml TFA 0,1%. Carico del campione. Raccogliere il flusso e caricare di nuovo. </li><li> Lavare con 5 ml di TFA 0,1%. Ripeti. </li><li> Eluire con 2 ml Acetonitrile 60%, 0,1% TFA. </li><li> Campione secco giù in una velocità di vac. </li></ol></li></ol> Frazionamento peptide e isolamento di fosfopeptidi <ol><li> Peptidi sono frazionati su una colonna HILIC. Usiamo un Tosoh TSK-Gel Amide-80 4,6 millimetri x 25 cm colonna analitica con una colonna di guardia. Prendete il vostro tempo con questo passaggio, eseguire la colonna per 2 ore a 90% A eseguire due gradienti vuoto prima di caricare il vostro campione. Il carico massimo su una colonna è pensato che questo formato da circa XX, di solito non caricare più di 5 mg per ciclo. </li><li> Solvente A - 98% ACN/0.1% TFA Solvente B - 2% ACN/0.1% TFA Carico nel 90% A oltre 20 &#39;, 90% A 85% A più di 5&#39;, 85% A 60% A più di 40 &#39;, 60% A 0% A più di 5&#39;, 0% A 90% su A 5 &#39;. </li><li> La portata è 1ml/min e le frazioni sono stati raccolti ad intervalli di 2 minuti dall&#39;inizio al 85% A 60% Un gradiente. </li><li> Combina frazioni di ridurre il numero di frazioni a 10. Frazioni aumentato probabilmente resa maggiore copertura del phosphoproteome. </li></ol> Arricchimento del fosfopeptidi <ol><li> Fosfopeptidi sono arricchiti con PHOS-Select Gel Affinità di ferro. Noi la nostra aliquota resina IMAC per evitare congelamento ripetuto scongelamento. Fai 50 ml di acido acetico 250 mm, Soluzione al 30% del carico ACN. Portare il pH a 2,7 con HCl. Risospendere pellet in 500 ml di soluzione di carico. Controllare il pH, regolare con HCl o NaOH, se necessario. </li><li> Prelavaggio 200 ml di perline IMAC in una colonna appropriata. Noi usiamo colonne di rotazione Molbiotec. Aggiungere 15 ml di una sospensione al 50% (gel per caricare soluzione) per ogni frazione, e incubare i campioni per 30 &#39;con il fine più di rotazione finale. Mantenere il flusso per l&#39;analisi. </li><li> Lavare i campioni 3 volte con soluzione di carico e una volta con 500 microlitri filtrata dH 2 O. </li><li> Peptidi eluire con 2 - 3 minuti con 400 ml di 50 mM Na 2 HPO 4 (pH 8,4) buffer. Trasferire in un flaconcino di vetro. </li><li> Acidificare a pH 3 con 5 microlitri di acido formico al 100%, il flash congelare in azoto liquido, e campione essiccato giù in una velocità di vac. </li><li> Fosfopeptidi risospendere in 200 ml di 0,1% TFA e C18 pulito come descritto sopra. Secco giù campioni eluiti in una velocità vac. </li><li> Risospendere peptidi in 20 microlitri di 0.1% di acido formico. Utilizzare 2 microlitri per analisi spettrometro di massa o, se necessario. </li></ol> Note Per gran parte di questo protocollo si dovrà lavorare &#39;cieco&#39;. La lisi cellulare può essere monitorato da western blotting e saggi di Bradford e BCA, e la digestione tripsina può anche essere facilmente valutata. La colonna HILIC si diede una traccia simile a questa, o come visibile da altri [1, 2] a seconda della macchina cromatografia liquida che viene utilizzata. I campioni sono monitorati mediante spettrometria di massa, i campioni di prova su macchine poco costose come LCQs o MALDIs prima di andare in analisi dei costi in alto su una massa ad alta precisione, macchine ad alta risoluzione. Infine, se si un&#39;asciugatura giù un campione con acido in essa, l&#39;uso di vetro.

<ol><li>Albuquerque, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multidimensional+chromatography+technology+for+in-depth+phosphoproteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).</li>
<li>McNulty, D. E., Annan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+chromatography+reduces+the+complexity+of+the+phosphoproteome+and+improves+global+phosphopeptide+isolation+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).</li>
<li>Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).</li>
<li>Ross, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Gruhler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteomics+applied+to+the+yeast+pheromone+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).</li>
<li>Wilson-Grady, J. T., Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+analysis+of+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome analysis of fission yeast.</a> J Proteome Res. 7 (3), 1088-1097 (2008).</li>
<li>Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCX%2FIMAC+enrichment+approach+for+global+phosphorylation+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).</li>
<li>Jensen, S. S., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+impact+of+some+experimental+procedures+on+different+phosphopeptide+enrichment+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).</li>
<li>Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+from+peptide+mixtures+using+titanium+dioxide+microcolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).</li>
<li>Pinkse, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+isolation+at+the+femtomole+level+of+phosphopeptides+from+proteolytic+digests+using+2D-NanoLC-ESI-MS%2FMS+and+titanium+oxide+precolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns.</a> Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).</li>
<li>Tao, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteome+analysis+using+a+dendrimer+conjugation+chemistry+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry.</a> Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).</li>
<li>Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+to+the+analysis+of+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).</li>
<li>Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+isolation+of+distinct%2C+overlapping+segments+of+the+phosphoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome.</a> Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).</li>
</ol>

Questo metodo produrrà un arricchimento di fosfopeptidi che può essere analizzato quantitativamente. Un certo numero di parametri possono essere modificati in questo protocollo, ma l&#39;aspetto più importante da ricordare è per preservare la vostra fosforilazione. Preparazione delle cellule per la quantificazione può essere ottenuto in molti modi diversi, ad esempio se non si possono etichettare le cellule in vivo, i tag come ICAT [3] o ITRAC [4] può essere utilizzato estrazione messaggio per etichettare in mo...

<table><tbody><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-Arginina-&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;,&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>608033</td><td></td></tr><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-Lisina-&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>609021</td><td></td></tr><tr><td>GIBCO&amp;#8482; Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) 7,4 (10X) liquida</td><td>Invitrogen</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Compresse SigmaFAST Inibitore di Proteasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail Inibitore di Fosfatasi Pierce Halt</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>Macinatore a palle Retsch PM100</td><td>Retsch</td><td>20.540.0001</td><td></td></tr><tr><td>Vaso di macinazione in acciaio inossidabile Retsch da 125 ml</td><td>Retsch</td><td>01.462.0148</td><td></td></tr><tr><td>Colonna Ultramicrospin C18</td><td>The Nest Group</td><td>SUM SS10</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak Vac 500 mg C18</td><td>Waters</td><td>WAT043395</td><td></td></tr><tr><td>Colonna analitica TSK-Gel Amide-80 4,6 mm x 25 cm</td><td>Tosoh Corp.</td><td>13071</td><td>Questa è la colonna cromatografica HILIC.</td></tr><tr><td>Colonna di protezione 4,6 mm di diametro interno x 1 cm</td><td>Tosoh Corp.</td><td>19021</td><td>Si raccomanda questa colonna di protezione per prolungare la vita della colonna HILIC.</td></tr><tr><td>Gel di affinità per ferro PHOS-Select&amp;#8482;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9740</td><td>Questa è la resina IMAC. Aliquotare e conservare.</td></tr></tbody></table>

fosfoproteomica quantitativa in acidi grassi stimolati saccharomyces cerevisiae</em

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Questo protocollo descrive la crescita e la stimolazione, con l&#39;oleato di acidi grassi, degli isotopi pesanti e leggeri cellule di S. cerevisiae. Le cellule sono a terra con un procedimento cryolysis in una smerigliatrice mulino a sfere e la conseguente grindate portato in soluzione mediante solubilizzazione urea. Questa procedura permette la lisi delle cellule in uno stato metabolicamente inattivo, conservando la fosforilazione e la prevenzione riorientamento della phosphoproteome durante la lisi cellulare. Dopo la riduzione, alchilazione, tripsina digestione delle proteine, i campioni sono dissalati su colonne C18 e la complessità del campione ridotto di frazionamento mediante cromatografia di interazione idrofilica (HILIC). Colonne HILIC preferenzialmente trattenere le molecole idrofile che ben si adatta per fosfoproteomica. Peptidi fosforilata tendono ad eluire successivamente nel profilo cromatografico che le controparti non fosforilata. Dopo frazionamento, fosfopeptidi sono arricchite usando la cromatografia in metallo immobilizzato, che si basa sulla carica a base di affinità per l&#39;arricchimento fosfopeptide. Al termine di questa procedura i campioni sono pronti per essere analizzato quantitativamente mediante spettrometria di massa.

Descrizione di una procedura di fosforilazione quantitativa, utilizzando cryolysis, solubilziation urea, frazionamento HILIC e arricchimento IMAC di peptidi fosforilati.

Fosfoproteomica quantitativa in acidi grassi Stimolati Saccharomyces cerevisiae</em

Questo protocollo descrive la crescita e la stimolazione, tramite l'acido grasso oleato, di cellule di S. cerevisiae isotopicamente pesanti e leggere. Le cellule vengono macinate...

La fosforilazione è un meccanismo chiave di segnalazione cellulare che regola processi che vanno dalla localizzazione proteica alla trascrizione del DNA, e lo studio esclusivo dei fosfoproteini mediante spettrometria di massa rappresenta un interessante avanzamento nel campo della ricerca sulla segnalazione e sulla proteomica. Le cellule marcate in modo differenziale vengono lisate mediante omogeneizzazione in un macinino a sfera, quindi ridotte, alchilate, mescolate e digerite. I peptidi ottenuti dalla digestione vengono frazionati mediante cromatografia ad interazione idrofila e i peptidi fosforilati vengono arricchiti dalle frazioni tramite arricchimento con iMac.Le frazioni arricchite in peptidi fosforilati vengono quindi identificate mediante msm. Ms. Hi, sono Ramsey Celine del gruppo E presso l'Istituto di Biologia della Persistenza. Oggi vi mostreremo un procedimento per l'estrazione di peptidi fosforilati marcati metabolicamente.Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare quantitativamente il proteoma della fossa. Cominciamo dunque. Questa procedura inizia con la coltivazione di cellule di lievito isotopicamente leggere e pesanti.Prima di tutto, inoculare 100 millilitri di terreno ricco con una singola colonia di cellule di lievito. Far crescere questa coltura tutta la notte fino a un OD 600 di 1,0. Successivamente, utilizzarla per seminare due colture di un litro di terreno minimo contenente un complemento completo di amminoacidi e integrato con 20 milligrammi per litro di isotopi.Coltivare colture da un litro con arginina e lisina normali o con isotopi pesanti per 18 ore fino a un OD 600 di 1,8. È fondamentale che le cellule attraversino almeno nove generazioni per garantire l'incorporazione completa degli isotopi marcati. Quando le cellule hanno completamente incorporato gli isotopi marcati, centrifugare le cellule cresciute nel mezzo contenente arginina e lisina normali dal punto di vista isotopico.Per ottenere un pellet cellulare, lavare il pellet con acqua sterile e risospendere in un mezzo contenente oleato con arginina e lisina isotopicamente normali, quindi stimolare per 85 minuti. Questo produce un campione stimolato con oleato isotopicamente leggero. L'altra coltura, cresciuta in un mezzo con arginina e lisina isotopicamente pesanti, non viene stimolata con oleato e fungerà da campione di riferimento cresciuto in glucosio isotopicamente pesante.Per raccogliere un litro, la coltura viene distribuita tra quattro provette da centrifuga da 250 millilitri. Dopo la centrifugazione, le cellule vengono raccolte in un'unica provetta rimuovendo o trattenendo 100 millilitri del mezzo di coltura, risospendendo le cellule e trasferendole nella provetta successiva. Alla fine, un unico grande pellet viene raccolto in una singola provetta da centrifuga per tre minuti a 4.000 giri al minuto (RPM).Dopo aver rimosso il mezzo, si confronta il peso della bottiglia per centrifuga e del pellet con quello di una bottiglia per centrifuga vuota. Dopo la centrifugazione, rimuovere il mezzo e aspirare il liquido in eccesso dalle bottiglie, pesare i pellet e un rendimento tipico è compreso tra uno e due grammi. Successivamente, congelare rapidamente i pellet in azoto liquido e aggiungere ai pellet un buffer di frantumazione contenente inibitori di proteasi e fosfatasi.Il volume di tampone di macerazione aggiunto deve essere equivalente al peso del pellet. Congelare il contenitore di macerazione in azoto liquido. Quando l'azoto liquido ha cessato di bollire.Utilizzare una spatola per staccare frammenti dal pellet e trasferirli nel contenitore di macinazione contenente sfere d'acciaio congelate. Macinare i pellet a 600 giri/min con un ciclo di 1 minuto e 22 secondi e inversione del senso di rotazione per tre minuti. Ricoagulare nuovamente il contenitore di macinazione in azoto liquido.Ripetere la macinazione altre quattro volte per un totale di 15 minuti. Tempo di macinazione al termine della macinazione per entrambi i campioni. Raccogliere la data della macinazione congelata in provette falcon da 50 millilitri e mantenere congelate in azoto liquido o in ghiaccio secco.Conservare la data della macinazione a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso. L'isolamento e la frazionatura dei peptidi iniziano con la loro alchilazione. Il primo passaggio consiste nel solubilizzare il campione nella soluzione di urea.Portare ogni data di macerazione in soluzione aggiungendo tre volumi di tampone urea a un volume di data congelata. Ad esempio, tre millilitri di tampone RIA vengono aggiunti a un pellet di un grammo. Con un millilitro di tampone PBS.Sonicare immediatamente la miscela con la sonda. Utilizzare la punta della sonda. Mantenere la punta vicino al fondo del tubo per evitare la formazione di schiuma nella soluzione.La data della macinazione deve essere immediatamente aggiunta alla soluzione. Clarificare i lisati mediante centrifugazione a 6.000 giri/min per cinque minuti. A quattro gradi Celsius, trasferire il SUPINATO in provette fresche.Per avviare la reazione di riduzione, aggiungere a ciascun campione 0,5 molar tris, due carbossile LITAL PHOSPHINE o TCEP appena preparato, in un rapporto di diluizione di uno a 100. Per ottenere una concentrazione finale di TCEP di cinque millimolare, incubare i campioni a 37 gradi Celsius per un'ora. Al termine dell'incubazione a 37 gradi Celsius, lasciare raffreddare i campioni a temperatura ambiente.Quindi aggiungere iodioacetamide appena preparato 1 M a una concentrazione finale di 20 millimolari e incubare al buio per un'ora a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione di un'ora, bloccare l'iodoacetamide con DTT 20 millimolare. Lasciare a temperatura ambiente per un'ora.I lisati ridotti e alchilati sono ora pronti per la digestione con tripsina. A questo punto, campioni dei lisati possono essere utilizzati per la quantificazione proteica, analisi SDS-PAGE per verificare il lisamento cellulare e analisi mediante spettrometria di massa per convalidare l'incorporazione degli isotopi pesanti. Per iniziare la digestione con tripsina, mescolare quantità equivalenti dei campioni isotopicamente pesanti e leggeri.Diluire il campione di uno a quattro con metanolo al 20% e aggiungere tripsina in una diluizione di uno a 200. Incubare il campione tutta la notte a 37 gradi Celsius al giorno successivo. Dopo aver verificato la digestione completa mediante elettroforesi SDS-PAGE e colorazione con Coomassie, asciugare il campione in un evaporatore sotto vuoto quando il campione è secco.Aggiungere 200 microlitri di acqua distillata filtrata e vortexare fino a quando il pellet va in soluzione. Essiccare il campione in uno speed vac e risospendere nuovamente in acqua distillata. Dopo l'essiccazione del campione, risospendere nuovamente il pellet in acido trifluoroacetico (TFA) allo 0,1%, verificando che il pH sia circa tre utilizzando strisce per il pH se necessario. Acidificare con TFA al 10% e far precipitare eventuali residui.Il campione digerito con tripsina verrà ora desalato utilizzando una colonna VAC C18 da 500 milligrammi con cartuccia d'acqua. Per iniziare, idratare la colonna con cinque millilitri di acetonitrile al 100%, centrifugando a circa 200 × g o alla velocità minima necessaria affinché il liquido passi attraverso la colonna. Successivamente, equilibrare la colonna con cinque millilitri di TFA 0,1% e caricare il campione.Attenzione a non sovraccaricare la colonna e, se necessario, dividere il campione tra più colonne. Raccogliere il flusso in un contenitore per rifiuti e ricaricare la colonna se necessario, lavando con cinque millilitri di TFA 0,1%. Ripetere questo lavaggio ed eluire con due millilitri di acetonitrile 60% contenente TFA 0,1%. L'EEU deve essere raccolto mediante centrifugazione.Essiccare il campione in un evaporatore sotto vuoto e risospendere il campione essiccato in 200 microlitri di solvente B. Il campione risospeso è ora pronto per la frazionamento dei peptidi. Frazionare i peptidi su una colonna analitica TSK gel AMIDE 80 con colonna di protezione. Procedere con attenzione in questo passaggio.Eseguire la colonna per due ore al 90% di solvente A, quindi eseguire due gradienti vuoti prima di caricare il campione. Di solito non carichiamo più di cinque milligrammi per corsa su una colonna di questa dimensione, nella cromatografia liquida moderna e persino in quella non così moderna. Le macchine permettono l'iniezione automatica del campione, la raccolta delle frazioni, il controllo del flusso e la preparazione automatica delle miscele graduate.Questi sono impostati all'inizio della corsa come descritto. Caricare con il 90% di A per 20 minuti, passare dal 90% di A al 85% di A in cinque minuti, dal 85% di A al 60% di A in 40 minuti, dal 60% di A allo 0% di A in cinque minuti e dallo 0% di A al 90% di A in cinque minuti. Impostare la portata a un millilitro al minuto e raccogliere le frazioni a intervalli di due minuti.Cominciando dal gradiente 85%A a 60%A, combinare le frazioni in modo da ridurre il numero di frazioni a 10; frazioni aumentate produrranno probabilmente una maggiore copertura del proteoma fosforilato. I peptidi fosfo sono arricchiti mediante cromatografia con metalli immobilizzati. Utilizziamo il gel di affinità per fosfati con ferro come resina iMac.Per prima cosa, sospendere i pellet in 500 microlitri di soluzione di carico. Successivamente, aggiungere 15 microlitri di una sospensione al 50% a ciascuna frazione e incubare i campioni per 30 minuti con rotazione end-over-end. Mantenere il flusso per l'analisi.Lavare il campione tre volte con la soluzione di carico e una volta con 500 microlitri di acqua distillata filtrata; dopo i lavaggi, eluire i peptidi per due-tre minuti con 400 microlitri di tampone fosfato di sodio 50 millimolare. Trasferire i peptidi eluiti in un vial di vetro. Aggiungere cinque microlitri di acido formico al 100% ai peptidi per acidificare fino a pH 3, risospendere i peptidi fosforilati in 200 microlitri di TFA 0,1% e desaltare nuovamente mediante una colonna C18 come descritto in precedenza, quindi essiccare i campioni sotto vuoto accelerato.Infine, risospendere i peptidi fosforilati in 20 microlitri di acido formico 0,1%. I campioni sono ora pronti per essere analizzati quantitativamente mediante spettrometria di massa. Qui viene mostrata una traccia cromatica grafica relativa alla frazionatura di peptidi cellulari totali mediante cromatografia H-I-L-I-C.È possibile osservare in questo tracciato che, sebbene i peptidi fosforylati siano presenti in tutta la profilazione di eluizione, la maggior parte dei residui fosforylati viene trattenuta fino quasi alla fine del profilo di eluizione. Abbiamo appena mostrato come macinare le cellule, digerire le proteine, frazionare i peptidi ed arricchire i peptidi fosforylati mediante cromatografia di affinità con metalli immobilizzati. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di preservare la fosforilazione e verificare il pH delle soluzioni Beer.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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