L'esaurimento delle popolazioni di cellule specifiche da deplezione del complemento

L'esaustione del complemento è un metodo rapido, efficace ed economico per purificare popolazioni di cellule immunitarie. L'esaustione del complemento inizia quando vengono aggiunti a una popolazione cellulare anticorpi monoclonali IgM o IgG, che bersagliano un tipo cellulare specifico. In questo esempio, bersaglieremo le cellule T per l'esaustione.

Viene quindi aggiunto il sistema del complemento, che innesca una cascata proteolitica responsabile della morte delle cellule T. La popolazione cellulare viene quindi sottoposta a centrifugazione e lavaggio, e filtrata per eliminare le cellule morte e i detriti. Questo metodo di deplezione mediante complemento porta tipicamente all'eliminazione dal 95 al 100% della popolazione cellulare bersaglio.

Ciao, sono Bonnie Dittle. Sono un'investigatrice presso l'Istituto di Ricerca del Sangue del Blood Center of Wisconsin situato a Milwaukee. Oggi vi mostrerò la tecnica di esaurimento del complemento, un metodo rapido ed economico per l'eliminazione di specifiche popolazioni cellulari.

Utilizziamo questa tecnica nel mio laboratorio per arricchire notevolmente le popolazioni di cellule immunitarie, che successivamente impieghiamo in diversi saggi biologici, inclusi quelli che coinvolgono l'attivazione cellulare e l'analisi dell'espressione proteica. Cominciamo dunque. Prima di iniziare l'esperimento, preparare aliquote di 0,5 o un millilitro di complemento di coniglio e conservarle in un congelatore a meno 20 o meno 80 gradi.

Assicurarsi di titolare il complemento a una diluizione ottimale compresa tra 1:10 e 1:20. Un'ottima fonte commerciale di complemento, che utilizziamo regolarmente, è fornita da Pereze Biologicals. Per questa procedura, gli anticorpi monoclonali di tipo mouse e rap sono generalmente efficaci nell'attivazione del complemento, ma non tutti gli anticorpi sono adatti. Gli anticorpi IgM sono generalmente i più efficienti per la lisi cellulare indotta dal complemento.

Gli anticorpi IgG sono i secondi più efficienti e vengono utilizzati tipicamente perché la maggior parte degli anticorpi monoclonali sono IgG; è necessario titolare ogni anticorpo per un uso ottimale in una densità cellulare di 10 alla settima cellule per millilitro, valore determinato empiricamente. La maggior parte degli anticorpi viene impiegata nell'intervallo compreso tra 0,1 e 10 microgrammi per millilitro. Per l'eliminazione dei linfociti T splenici, utilizziamo un anticorpo monoclonale specifico per TH uno.

Per iniziare l'esaurimento del complemento, diluire le cellule in mezzo di coltura cellulare contenente siero fetale bovino inattivato termicamente al 5%, in modo che la popolazione cellulare iniziale sia pari a due per 10 alla settima cellule per millilitro. Ad esempio, cinque per 10 alla settima cellule devono essere diluite in 2,5 millilitri di mezzo. Questo volume di cellule corrisponde alla metà del volume finale e pertanto presenta una concentrazione doppia rispetto a quella utilizzata durante l'esaurimento, che sarà pari a una per 10 alla settima cellule per millilitro.

In questo momento, conservare fino a un milione di cellule in modo che l'esaurimento possa essere quantificato al termine dell'esperimento. Inoltre, scongelare la quantità necessaria di complemento a temperatura ambiente. Abbiamo riscontrato che una diluizione di 1 a 15 è appropriata quando si utilizza il complemento di coniglio di Pereze Biologicals per 50 milioni di cellule; in tal caso, 1,5 millilitri di Eloqua congelato sono sufficienti.

Ora aggiungere la quantità appropriata di anticorpo alla sospensione cellulare e mescolare. Per sterilizzare il complemento, utilizzare un filtro a siringa con punta a bassa adesione proteica. Riempire la siringa con uno o due millilitri di mezzo.

Prima di aggiungere il complemento a cinque volte 10 alla settima cellule, avremo bisogno di 340 millilitri di complemento per una diluizione 1:15. Quindi filtrare il complemento direttamente nel tubo contenente le cellule e l'anticorpo. Ora regolare il volume finale nel tubo in modo che le cellule abbiano una concentrazione di una volta 10 alla settima cellule per millilitro.

Successivamente, lasciare incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un bagno termico per un'ora. Ricordare di mescolare le cellule ogni 15 minuti mediante inversione delicata. Al termine dell'incubazione, centrifugare le cellule a una velocità che non comprometta la vitalità cellulare.

Quindi, nuovamente sotto cappa, eliminare il soprannatante. Successivamente, lavare le cellule due volte con 10 millilitri di mezzo. Osservare come i detriti cellulari si accumulano, con alcuni che aderiscono alle pareti dei tubi in polistirene.

Dopo l'ultimo lavaggio, filtrare le cellule attraverso un filtro sterile in nylon da 70 micron. Infine, verificare la purezza delle cellule confrontando la popolazione cellulare di interesse prima e dopo il flusso di esaurimento.

La citometria e l'immunohistochemia sono metodi preferiti per determinare la purezza cellulare prima dell'esperimento. Quando si utilizza un anticorpo monoclonale altamente efficiente nell'attivare il complemento, il primo ciclo di deplezione mediante complemento eliminerà le cellule di oltre il 95%. Ad esempio, utilizzando la citometria a flusso per misurare la percentuale di cellule T alfa-beta in una preparazione di cellule pleuriche di topo, abbiamo riscontrato che esse contenevano il 32,2% di cellule T alfa-beta dopo la deplezione con complemento mediante anti-CD51, espresso da tutte le cellule T ma non dagli altri leucociti. La popolazione di cellule TCR beta è stata ridotta del 95%, raggiungendo una concentrazione finale dell'1,56%.

Vi ho appena mostrato un metodo rapido ed efficace per esaurire popolazioni cellulari specifiche utilizzando anticorpi specifici per l'antigene in un esaurimento mediato dal complemento. Quando eseguite questa procedura, ricordate di testare ogni anticorpo per verificarne l'efficacia e di titolare il vostro complemento in un esperimento pilota prima di iniziare. È tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.