Isolamento di cellule della cavità peritoneale mouse
28 gennaio 2010
La cavità peritoneale nei mammiferi contiene diverse popolazioni di cellule immunitarie cruciali per risposte immunitarie innate. Un metodo efficiente isolamento è necessario per le analisi biochimiche e funzionali di queste cellule. Qui forniamo un metodo completo per l'isolamento di cellule cavità peritoneale nel topo.
L'isolamento delle cellule della cavità peritoneale inizia con il posizionamento di un topo eutanasizzato sulla schiena. Il tegumento esterno del peritoneo viene inciso e delicatamente ritratto per esporre il tegumento interno; quindi si inietta PBS con il 3% di FBS nella cavità peritoneale e si massaggia dolcemente il peritoneo. Il liquido contenente le cellule peritoneali viene raccolto e posto in un tubo da 15 millilitri su ghiaccio.
Le cellule vengono lavate una volta e contate con un emocitometro. Ciao, sono Oji del laboratorio del dottor Bon presso l'Istituto di Ricerca del Sangue del Blood Center del Wisconsin. Oggi vi mostreremo un procedimento per isolare le cellule dalla cavità peritoneale di un topo.
Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per ottenere cellule destinate a diversi saggi fenotipici, biochimici e immunologici. Principalmente, siamo interessati alle popolazioni di linfociti B peritoneali. Cominciamo dunque.
Prima di iniziare l'isolamento delle cellule immunitarie dalla cavità peritoneale, preparare tutti i materiali necessari. Procurarsi innanzitutto un secchiello con ghiaccio, una siringa da cinque millilitri con ago da 27 gauge, una siringa da cinque millilitri con ago da 25 gauge, un blocco di polistirolo, spilli per fissare il topo e un vassoio per contenere il blocco di fissaggio, nonché forbici, pinzette e provette per la raccolta prima della dissezione.
Raffreddare preventivamente il PBS contenente il 3% di siero fetale di vitello. Mantenere questi e le provette di raccolta sul ghiaccio per tutta la durata dell'esperimento, dopo la somministrazione dell'anestetico e l'eutanasia appropriata, spruzzare il topo con etanolo al 70% e posizionarlo supino su un blocco di polistirolo o un tappetino da dissezione. Utilizzando pinze e forbici, tagliare la pelle esterna del peritoneo.
Ripiegare delicatamente la pelle per esporre la cute interna che riveste la cavità peritoneale. Facendo attenzione a non perforare alcun organo, inserire lentamente un ago da 27 gauge nel peritoneo. Iniettare cinque millilitri di PBS freddo ghiaccio nella cavità peritoneale.
Ora massaggiare delicatamente il peritoneo per favorire il distacco delle cellule dalla parete peritoneale e farle cadere nella soluzione di PBS. Successivamente, applicare a questo punto una siringa da cinque millilitri con un ago da 25 gauge, con il bisellato rivolto verso l'alto, e inserire l'ago nel peritoneo. Raccogliere il maggior quantitativo possibile di liquido per aumentare il rendimento cellulare.
Mentre si esegue questa operazione, muovere delicatamente la punta per evitare che tessuto adiposo o altri organi ostruiscano l'ago. Rimuovere l'ago e versare la sospensione cellulare in provette di raccolta in polipropilene. Raccogliere il fluido rimanente dalla cavità praticando un'incisione nella parte interna della parete peritoneale.
Utilizzare una pinzetta per tenere la pelle separata mentre si usa una pipetta posteriore in plastica per raccogliere eventuali fluidi residui. Infine, centrifugare la sospensione cellulare per otto minuti a 1500 giri al minuto, eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in cinque millilitri di PBS. Conteggio delle cellule mediante emocitometro.
L'uso dell'esclusione con trippen blue permetterà la determinazione del numero di cellule. Tipicamente, da cinque a dieci milioni di cellule della cavità peritoneale possono essere isolate da un topo non manipolato. Il 50-60% della popolazione totale di cellule sarà costituito da cellule B.
Circa il 40% sarà costituito da macrofagi e granulociti, e dal 5 al 10% da linfociti T. Abbiamo appena mostrato come isolare le cellule dalla cavità peritoneale di un topo. Quando si utilizza questa procedura, è importante limitare la quantità di sangue nella popolazione di cellule della cavità peritoneale eseguendo l'eutanasia dei topi con attenzione e senza perforare alcun organo all'interno della cavità peritoneale.
Assicurarsi di scartare tutti i campioni che risultino contaminati con sangue. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo dettagliato per isolare le cellule dalla cavità peritoneale di topi, procedura essenziale per lo studio delle risposte immunitarie. Il protocollo è stato ideato per garantire l'integrità delle popolazioni cellulari ai fini di analisi successive.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia
- Biologia cellulare
- Chimica biologica
Sfondo
- La cavità peritoneale ospita diversi tipi di cellule immunitarie.
- Queste cellule svolgono un ruolo fondamentale nelle risposte immunitarie innate.
- I metodi di isolamento sono fondamentali per studi funzionali e biochimici.
- Comprendere queste cellule può contribuire alla ricerca immunologica.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo affidabile per l'isolamento delle cellule della cavità peritoneale.
- Facilitare lo studio delle popolazioni di cellule immunitarie nei topi.
- Migliorare l'accuratezza degli esami immunologici successivi.
Metodi Utilizzati
- Eutanasia del topo e preparazione per la dissezione.
- Iniezione di PBS con 3% di FBS nella cavità peritoneale.
- Raccolta del liquido contenente le cellule peritoneali.
- Centrifugazione e conteggio delle cellule isolate.
Risultati principali
- Isolato con successo da 5 a 10 milioni di cellule dalla cavità peritoneale.
- Identificato che il 50-60% delle cellule sono cellule B.
- Circa il 40% sono macrofagi e granulociti.
- Il 5-10% delle cellule sono cellule T.
Conclusioni
- Il metodo è efficace per l'isolamento di cellule immunitarie dalla cavità peritoneale.
- Una eutanasia e una dissezione accurate sono fondamentali per evitare contaminazioni ematiche.
- Questa procedura può essere applicata a diversi studi immunologici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento delle cellule immunitarie della cavità peritoneale consente la validazione precoce delle molecole bersaglio fornendo accesso a sottopopolazioni fenotipicamente definite di cellule B e macrofagi. Questo approccio supporta la riduzione del rischio meccanicistica nei percorsi di scoperta, fornendo cellule primarie riproducibili come input per saggi funzionali. Il metodo aumenta la fiducia predittiva nell'identificazione dei composti attivi attraverso il recupero standardizzato di popolazioni immunitarie rilevanti per lo screening di farmaci immunomodulatori.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei sottoinsiemi di cellule B1a e B1b per la verifica di ipotesi terapeutiche in modelli di autoimmunità e di infezione.
- Valore scientifico: Fornisce macrofagi tissutali naïve per la chiarificazione di vie di segnalazione nello studio della risposta immunitaria innata.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante l'isolamento costante di popolazioni cellulari immunitarie per lo screening dell'interazione con il bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per l'analisi fenotipica mediante citometria a flusso e saggi biochimici.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità dei saggi grazie a un rendimento cellulare controllato (5–10 milioni di cellule per topo).
- Valore operativo: Permette una valutazione affidabile dei composti mediante recupero quantitativo di linfociti B (50–60%), macrofagi (40%) e linfociti T (5–10%).
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta la modellizzazione di sistemi rilevanti per le malattie isolando le cellule B1 autororeattive e i sottoinsiemi regolatori produttori di IL-10.
- Valore operativo: Facilita l'allineamento traslazionale dei biomarcatori attraverso l'isolamento delle cellule B1 naturali secernenti IgM.
- Valore operativo: Permette una continuità preclinica fornendo cellule immunitarie primarie per approfondimenti meccanicistici nei modelli di malattia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fornendo cellule immunitarie primarie per la validazione dell'obiettivo, lo sviluppo di saggi e studi meccanicistici preclinici.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l'isolamento di specifici sottogruppi di cellule B e macrofagi.
- Screening: Garantisce la prontezza per saggi attraverso l'isolamento standardizzato e il recupero di popolazioni immunitarie vitali.
- Analisi: Permette il confronto quantitativo dei sottogruppi cellulari mediante conteggio al citometro ematico e metodi di esclusione della vitalità.
- Ricerca Translazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica tramite l'isolamento di cellule B1 associate all'immunità naturale e alla regolazione.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile per l'approvvigionamento di cellule immunitarie in programmi di scoperta in immunologia e oncologia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi grazie all'accesso a sottoinsiemi immunitari caratterizzati fenotipicamente.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante resa cellulare e distribuzione dei sottoinsiemi definiti.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione progettuale riducendo l'ambiguità meccanicistica nella selezione di immunomodulatori.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione aggiustata per rischio grazie a input affidabili di cellule primarie per pannelli di saggi funzionali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione di topi e nella tecnica asettica per prevenire la perforazione degli organi e la contaminazione con sangue.
- È dipendente da strumentazione come siringhe, aghi, centrifuga e emocitometro per l'elaborazione e il conteggio delle cellule.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro nella preparazione di PBS/FBS e nella gestione della catena del freddo per garantire coerenza.
- Comporta considerazioni di adattamento quando applicato a modelli di malattia che alterano la cellularità della cavità peritoneale.
- È limitato dalla necessità di un'eutanasia e di una dissezione accurate per evitare contaminazioni ematiche, che compromettono l'integrità del campione.
