Lentivirus Produzione

Questa procedura inizia con la trasduzione di cellule 293T mediante lentivirus, plasmide e vettori di impacchettamento virale; il sopranatante virale viene raccolto dopo un periodo di incubazione di almeno 48 ore. Il sopranatante filtrato viene concentrato mediante ultracentrifugazione. Il pellet virale viene risospeso in PBS per determinare il titolo virale: diluire innanzitutto il virus concentrato in mezzo completo, quindi eseguire una diluizione seriale per infettare le cellule con il lentivirus.

Ciao, sono Shein Wong del laboratorio di Michael McManus presso il Centro per il Diabete dell'Università della California di San Francisco. Sono Michael McManus. Oggi vi mostreremo un procedimento per la produzione di lentivirus.

Utilizziamo questa procedura in laboratorio per produrre lentivirus destinati all'interferenza dell'RNA. Cominciamo. Per iniziare questo protocollo, preparare il DNA con cui trasfettare le cellule 2 9 3 T.

Prima diluire il reagente di trasfezione FU gene sei in un tubo da 1,5 millilitri mescolando 30 microlitri di Fuji sei con 600 microlitri di mezzo privo di siero. Prestare attenzione a non far toccare il Fuji alle pareti del tubo mentre lo si aggiunge al mezzo; incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Successivamente, nel coperchio del tubo, mescolare quattro microgrammi di plasmide lentivirale con 1,33 microgrammi.

Ogni vettore di impacchettamento virale di terza generazione. Il plasmide lentivirale contiene il DNA. Il virus si inserirà nel genoma di ogni cellula che infetta, mentre i vettori di impacchettamento contengono i geni per tutte le altre proteine necessarie per produrre un virus lentivirale; chiudere il coperchio e mescolare capovolgendo il tubo alcune volte.

Incubare il DNA e il reagente di trasfezione da 15 a 20 minuti a temperatura ambiente. A questo punto è possibile trasfettare le cellule 2 9 3 con il DNA preparato, utilizzando cellule che sono state seminate 24 ore prima e che hanno raggiunto una confluenza del 50-70%. Nell'ambiente sterile della cappa a flusso laminare, pipettare tutto il DNA preparato sulla piastra contenente le cellule 2 9 3, mescolando delicatamente inclinando la piastra avanti e indietro. Reintrodurre le cellule nell'incubatore e lasciare proseguire la produzione virale per 48-96 ore prima del raccolto. Durante l'incubazione, le cellule 2 9 3 producono lentivirus il cui genoma contiene una copia di RNA del DNA di interesse.

Ora è il momento di raccogliere il virus. Togliere le cellule dall'incubatore. Avere pronti nella cappa a flusso laminare un filtro per siringa da 0,4 o cinque micron, una siringa monouso da 10 millilitri e un tubo da centrifuga UltraClear Beckman.

Utilizzare la siringa monouso per rimuovere il sopranatante, che ora contiene il virus. Applicare un filtro per siringa da 0,45 micron alla punta e filtrare il virus in un tubo centrifuga UltraClear Beckman. Il filtro permette il passaggio dei soli virus, escludendo le cellule; dopo il filtraggio, incubare tutte le cellule produttrici di virus prima di smaltirle.

Immergere piastre di coltura, siringhe e filtri in una soluzione di candeggina al 10% per 45 minuti. Ora che hai raccolto e filtrato il virus, è il momento di concentrarlo mediante ultracentrifugazione. Utilizza DMEM privo di siero per bilanciare tutti i tubi contenenti il virus in modo che differiscano tra loro di non più di 0,2 grammi.

Successivamente, caricare le provette bilanciate nei secchi del rotore SW 41 TI o SW 28. Chiudere ermeticamente i secchi del rotore e agganciarli al rotore. Quindi posizionare il rotore all'interno dell'ultracentrifuga.

Centrifugare il virus per circa 90 minuti a quattro gradi Celsius a 25.000 giri al minuto in un rotore SW 41 TI, oppure a 24.000 giri al minuto in un rotore SW 28. Al termine della centrifugazione, tornare nell'ambiente sterile per colture cellulari e capovolgere il tubo per versare il surnatante in un contenitore contenente candeggina al 10%. Utilizzare un fazzoletto di carta Kim per assorbire il liquido in eccesso intorno al pellet e capovolgere il tubo in un rack adatto per non più di cinque minuti, fino al momento in cui si è pronti a risospendere il pellet.

Per risospendere il pellet virale, utilizzare una punta filtrante per aggiungere 100 microlitri di PBS sterile prefiltrato al tuo tubo. Quindi aspirare e dispensare su e giù circa 20 volte. Lasciare il virus a quattro gradi durante la notte per completare la risospensione.

È possibile conservare i preparati virali a quattro gradi per circa una settimana e a meno 80 gradi per un periodo massimo di un anno. Ricordare di trattare tutti i tubi vuoti con una soluzione di candeggina al 10% prima dello smaltimento. Se si prevede di utilizzare il preparato virale per un periodo superiore alla settimana, è possibile mantenerlo in frigorifero.

Preparare aliquote minime di cinque a 20 microlitri per esperimenti futuri e un’aliquota di tre a cinque microlitri per la titolazione; congelare e conservare le aliquote a circa meno 80 °C. Il passo successivo consiste nel determinare il titolo virale. Se è stato inserito un gene reporter fluorescente nel plasmide lentivirale, le cellule infettate emetteranno fluorescenza e sarà possibile determinare il titolo virale mediante citometria a flusso.

Per iniziare, diluire tre microlitri di virus concentrato in 1,5 millilitri di mezzo completo in pozzetti da uno a sei, disposti in una singola fila di una piastra a 96 pozzetti. Eseguire le seguenti diluizioni seriali in tutti e sei i pozzetti aggiungendo 100 microlitri di DM completo. Al primo pozzetto aggiungere 100 microlitri di mezzo senza virus.

Questo è il controllo non colorato. Al secondo pozzetto, aggiungere 100 microlitri del virus diluito al terzo. Aggiungere 100 microlitri della miscela dal secondo pozzetto al quarto.

Aggiungeremo 100 microlitri dal terzo pozzetto al quinto. Aggiungeremo 100 microlitri dal quarto pozzetto al sesto. Aggiungeremo 100 microlitri dal quinto pozzetto.

Prelevare infine 100 microlitri dalla sesta pozzetta e scartarli, quindi aggiungere della soluzione di candeggina per portare il volume totale in tutte le pozzette a 200 microlitri con DMEM. Ad ogni diluizione, la concentrazione virale si riduce della metà. Si noti che queste sono solo diluizioni suggerite, che dovrebbero funzionare bene per la titolazione della maggior parte dei virus concentrati.

Se il tuo virus ha un titolo basso o non è concentrato, potresti dover aggiustare i tuoi diluizioni. Tratta qualsiasi virus diluito non utilizzato con candeggina al 10% per 45 minuti prima di smaltirlo in un contenitore per rifiuti biologici. Aggiungi circa 15.000 cellule 293T sane e in attiva divisione a ciascuna delle sei pozzette.

È possibile utilizzare una singola piastra a 96 pozzetti per titolare 16 preparazioni virali, portare i pozzetti a 200 microlitri, reinserire le cellule nell'incubatore e lasciare procedere l'infezione per almeno 48 ore. Al termine dell'incubazione, analizzare la fluorescenza cellulare mediante citometria a flusso. È possibile utilizzare la percentuale di cellule fluorescenti per pozzetto per determinare il titolo o il numero di particelle virali infettive per millilitro di virus aggiunto.

Calcolare il numero di unità infettive per millilitro utilizzando la seguente formula durante l'interpretazione dei risultati del citometro a flusso. Si noti che è possibile ottenere calcoli accurati del titolo solo quando le cellule infette hanno ricevuto non più di un'integrazione virale per cellula.

Per garantire che ciò sia vero, utilizzare cellule con un tasso di infezione inferiore al 15% per i calcoli. Le cellule con tassi di infezione più elevati probabilmente avranno ricevuto più integrazioni virali per cellula. La diluizione suggerita al passaggio due dovrebbe produrre diversi campioni entro questo intervallo di infezione.

Utilizzare idealmente diversi campioni per generare un grafico di titolazione dal quale calcolare il titolo finale. La formula calcolata a partire della retta lineare interpolata può essere utilizzata per determinare il titolo virale, ma se necessario è possibile calcolare il titolo utilizzando un singolo campione. È possibile attendersi un titolo di uno per dieci alla settima unità transducente per millilitro per il virus non concentrato e di uno per dieci alla ottava unità transducente per millilitro per il virus concentrato.

Abbiamo appena mostrato come produrre lentivirus durante questa procedura. È importante rispettare tutte le normative di sicurezza biologica e smaltire correttamente i rifiuti. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.