Name: Lentivirus Produzione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-02T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Impara la produzione di lentivirus per la terapia genica utilizzando cellule 293T umane. Questo metodo include trasfezione, ultracentrifugazione e determinazione del titolo virale per applicazioni di ricerca.

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Parte 1: Transfection di HEK 293 cellule di produrre lentivirus * 24 ore prima della trasfezione, piatto 2,5 X 10 6 celle in un piatto di 10 centimetri per una confluenza del 50-70% il giorno successivo. <ol><li> Avviare questo protocollo preparando il DNA con la quale si verrà poi trasfezione proprio le cellule per fare virus. In primo luogo, diluire FuGENE 6 Transfection Reagent Roche, un reagente lipidi che compongono le cellule prendono il DNA. In un tubo da 1,5 ml, pipetta 30μl FuGENE 6 in 600ul mezzo privo di siero (SFDMEM). Fare attenzione a non lasciare FuGENE toccare il lato del tubo in condizioni di fornitura nel mezzo. Lasciate che questo FuGENE e mescolare SFDMEM e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. </li><li> Nel tappo del tubo, mescolare 4 microgrammi lentivirale plasmide con 4 mg ogni 3 ° generazione di vettori di imballaggio virale (pMDL, pRSV e pVSV-G). Il plasmide lentivirale contiene il DNA del virus si inserisce nel genoma di ogni cellula che infetta, mentre i vettori di imballaggio contengono geni per tutte le altre proteine ​​necessarie per fare un lentivirus. </li><li> Chiudere il coperchio e mescolare invertendo il tubo di un paio di volte. </li><li> Incubare per 15-20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Pipettare intero contenuto del tubo in 293 piastre. Mescolare delicatamente piastra inclinazione avanti e indietro. </li><li> Ritorno alle cellule di dell&#39;incubatore e consentire la produzione virale di proseguire per 48-96 ore prima del raccolto. </li><li> Durante l&#39;incubazione, le 293 cellule trascrivere il DNA di interesse da parte del plasmide lentivirale, creando una copia di RNA del costrutto lentivirali. Hanno anche trascrivere e tradurre i geni nei vettori imballaggio in proteine ​​virali. Queste proteine ​​procedere a fare virus contenente la versione di RNA del costruire lentivirali, che il virus si riverseranno trascrivere e inserire nel genoma di tutte le cellule che infetta. </li></ol> Parte 2: Harvest lentivirali <ol><li> Dopo il periodo di incubazione, le cellule prendono fuori dell&#39;incubatore e utilizzare un usa e getta, siringa da 10 ml per rimuovere il supernatante, che ora contiene il virus. Ci saranno circa 10 ml di sopranatante. </li><li> Collegare un filtro 0.45μM siringa per la punta e filtrare il virus in un tubo Ultracentrifuga Beckman. Il filtro consente solo i virus, e non le cellule di passare. </li><li> Prima di gettare, incubare tutte le cellule che producono virus, piastre di coltura, siringhe e filtri nel 10% di candeggina per 45 minuti. </li></ol> Parte 3: Concentrazione lentivirali tramite ultracentrifugazione <ol><li> Carico provette in SW-41Ti o SW-28 secchi rotore. </li><li> Usa DMEM senza siero per bilanciare tutti i virus contenenti tubi a 0,2 g all&#39;interno. </li><li> Tenuta chiusa secchi rotore e agganciarli sul rotore prima di mettere dentro il rotore ultracentrifuga </li><li> Spin il virus per 90 minuti in un&#39;ultracentrifuga a 4 ° C a 25.000 giri al minuto in un SW-41Ti rotore o 24.000 rpm in un rotore SW-28. </li><li> In una cappa colture di tessuti, invertire i tubi a testa in giù a versare il surnatante in un contenitore contenente il 10% di candeggina. </li><li> Utilizzare un Kimwipe per assorbire il liquido in eccesso in tutto il pellet e invertire il tubo in un rack conveniente per non più di cinque minuti. </li><li> Per risospendere il pellet virale, utilizzare una punta filtro per aggiungere 100 ul di PBS sterile per il tubo, poi pipetta su e giù per circa 20 volte. </li><li> Lasciare il virus a 4 ° C durante la notte per completare la risospensione. Si può memorizzare prepara virale a 4 gradi per circa 1 settimana a -80 gradi per un massimo di un anno. Ricordate di trattare tutti i tubi vuoti con il 10% di candeggina prima di smaltimento. </li><li> Se si intende utilizzare la preparazione virale per più di una settimana 1, fanno aliquote minime di 5-20μl per futuri esperimenti e 1 aliquota del 3 per 5μl per la titolazione. Congelare e conservare le aliquote a meno 80. </li></ol> Parte 4: Titolazione lentivirali in citometria a flusso <ol><li> Il passo successivo consiste nel determinare il titolo virale mediante citometria di flusso. Questo metodo funziona solo nei casi in cui il plasmide lentivirale contiene un gene fluorescente reporter. L&#39;idea è che quando il virus infetta una cellula, introduce il DNA lentivirale plasmide nel genoma di quella cella. La cellula infettata poi trascrivere e tradurre i geni che hai incluso nel plasmide lentivirale, e se hai incluso un gene fluorescente giornalista, le cellule infette si fluorescenza. Il livello di fluorescenza rappresenta la potenza, o titolo, del virus. </li><li> Per ogni titolo virale di essere titolati, diluire 3 ml di virus concentrati in 1,5 ml di mezzi completi (DMEM, pen-streptococco, glutammina, FBS). </li><li> In pozzi 1-6 in una singola riga di una piastra 96 ​​pozzetti, eseguire le seguenti diluizioni seriali: a tutti i 6 pozzi aggiungere 100 ml di DMEM completo dei media. Per il primo e aggiungere 100μl di media con nessun virus (questo è il vostro controllo senza macchia), al secondo e aggiungere 100 ml di virus diluito (che è equivalente a 1 ml di virus diluito), al terzo e aggiungere 100 uldel mix dal secondo pozzo, al quarto e 100 ml dal 3 così, al quinto e aggiungere 100μl dal pozzo 4, e al sesto e aggiungere 100 microlitri dal 5 bene. Finalmente prendere 100ul fuori dal pozzo 6 e scartare in candeggina. Una diluizione seriale è stata effettuata in cui ogni bene è la metà del volume del virus rispetto a quella precedente. </li><li> Portare il volume totale in tutti i pozzetti di 200μl. Notare che questi sono diluizioni solo suggerito, che dovrebbe funzionare bene per la titolazione dei virus più concentrata. Se il virus è bassa del titolo, o non concentrata che si possano desiderare per regolare il diluizioni. </li><li> Trattare qualsiasi virus inutilizzato diluito con 10% di candeggina per 45 minuti prima di scartare in un contenitore per rifiuti a rischio biologico. </li><li> Aggiungi ~ 15.000 sano, attivamente dividendo 293 cellule per ciascuno dei 6 pozzi. Un piatto unico a 96 e può essere usato per titolo 16 preparazioni virali. </li><li> Ritorno alle cellule di grado incubatore 37 con 5% di CO 2 e permettere l&#39;infezione di procedere per almeno 48 ore. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, le cellule vengono analizzate per l&#39;espressione giornalista (nel nostro caso fluorescenza) con un citometro a flusso. Particelle virali sono quantificato mediante la percentuale di cellule fluorescenti per bene. </li></ol> Calcolare il numero di unità infettive per ml con la seguente formula: <div style="text-align:center;"> (Numero di cellule per bene il giorno di infezione delle cellule giornalista X positivo) X 1000 ______________________________________________________ ml di vettore aggiunto al bene </div> Parte 5: Risultati Rappresentante: Dopo una di 48 ore dopo la trasfezione periodo di incubazione, la piastra di 293 cellule dovrebbe essere di circa il 90% fluorescenti. Un&#39;alta percentuale di cellule fluorescenti è indice di una elevata percentuale di cellule che producono virus. Dopo la centrifugazione, il pellet virale è appena visibile quando risospendere. Questo è normale come il pellet è chiara e molto piccolo. Nell&#39;interpretazione dei risultati citofluorimetro, si noti che si può raggiungere solo titolo calcoli precisi quando infetta (fluorescenti), le cellule hanno ricevuto più di una integrazione virale per cellula. Al fine di garantire che questo è il caso, utilizzare le cellule con il tasso di infezione &lt;15% per i calcoli. Cellule con tassi di infezione più elevati hanno probabilmente ricevuto più integrants virale per cellula. Le diluizioni suggerito al punto 2 dovrebbe produrre diversi campioni all&#39;interno di questa gamma di infezione. Idealmente, usare diversi campioni di generare una trama di titolazione (linea retta) da cui si può calcolare il titolo finale, ma si può calcolare titolo utilizzando un unico campione, se necessario. Ci si può aspettare titolo di 1,0 x 10 7 TU / ml per un-concentrato virus e 1,0 x 10 8 TU / ml per virus concentrati.

<ol><li>Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+concentration+of+pseudotyped+HIV-1-based+gene+transfer+vectors.%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors.</a> Gene Therapy. , 72-7211 (2000).</li>
<li>Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>DMEM cell HEK 293T penicillina-streptomicina glutammina soluzione salina tampone al fosfato FBS</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagente per trasfezione FuGENE 6 pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Candeggina</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari da 10 cm piastre per colture cellulari da 96 pozzetti</td><td>Falcon BD</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta multicanale</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punte filtrate per pipetta</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube Eppendorf da 1,5 ml siringa filtro per siringa (0,45-&amp;mu;m)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube per ultracentrifuga</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per colture cellulari al 5% di CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotore Beckman SW41T.I</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga Beckman</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Array</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lentivirus produzione

Lentivirus Production

Interferenza dell&#39;RNA (RNAi) è un sistema di silenziamento genico nelle cellule viventi. In RNAi, i geni omologhi in sequenza a breve RNA interferenti (siRNA) sono ridotti al silenzio a livello post-trascrizionale di stato. RNA tornante breve, precursori di siRNA, può essere espressa tramite lentivirus, consentendo RNAi in una varietà di tipi di cellule. Lentivirus, come il virus di immunodeficienza umana, sono in grado di infettare sia che divide e non divisione delle cellule. Ci descrivono una procedura che a lentivirus pacchetto. Imballaggio si riferisce alla preparazione di virus competente da vettori del DNA. Lentivirali sistemi di produzione vettoriali sono basati su un sistema &#39;split&#39;, in cui il genoma virale naturale è stata suddivisa in costrutti individuali plasmide helper. Questa divisione dei diversi elementi virale in quattro vettori separati diminuisce il rischio di creare una replica-virus in grado di ricombinazione casuale del genoma lentivirali. Qui, un vettore contenente i shRNA di interesse e di tre vettori imballaggio (p-VSVG, pRSV, pMDL) sono transitoriamente trasfettate in 293 cellule umane. Dopo almeno un periodo di 48 ore di incubazione, il surnatante contenente virus viene raccolto e concentrato. Infine, titolo del virus è determinata dalla giornalista (fluorescenti), espressione con un citometro a flusso.

Per rendere lentivirus, vettori di DNA sono transfettate in 293 cellule umane. Dopo la raccolta e concentrando il surnatante, titolo del virus è determinata dalla espressione fluorescenza con un citometro a flusso.

Lentivirus Produzione

L'interferenza dell'RNA (RNAi) è un sistema di silenziamento genico nelle cellule viventi. Nell'RNAi, i geni con sequenze omologhe ai piccoli RNA interferenti (siRNA) sono...

Questa procedura inizia con la trasduzione di cellule 293T mediante lentivirus, plasmide e vettori di impacchettamento virale; il sopranatante virale viene raccolto dopo un periodo di incubazione di almeno 48 ore. Il sopranatante filtrato viene concentrato mediante ultracentrifugazione. Il pellet virale viene risospeso in PBS per determinare il titolo virale: diluire innanzitutto il virus concentrato in mezzo completo, quindi eseguire una diluizione seriale per infettare le cellule con il lentivirus.Ciao, sono Shein Wong del laboratorio di Michael McManus presso il Centro per il Diabete dell'Università della California di San Francisco. Sono Michael McManus. Oggi vi mostreremo un procedimento per la produzione di lentivirus.Utilizziamo questa procedura in laboratorio per produrre lentivirus destinati all'interferenza dell'RNA. Cominciamo. Per iniziare questo protocollo, preparare il DNA con cui trasfettare le cellule 2 9 3 T.Prima diluire il reagente di trasfezione FU gene sei in un tubo da 1,5 millilitri mescolando 30 microlitri di Fuji sei con 600 microlitri di mezzo privo di siero. Prestare attenzione a non far toccare il Fuji alle pareti del tubo mentre lo si aggiunge al mezzo; incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Successivamente, nel coperchio del tubo, mescolare quattro microgrammi di plasmide lentivirale con 1,33 microgrammi.Ogni vettore di impacchettamento virale di terza generazione. Il plasmide lentivirale contiene il DNA. Il virus si inserirà nel genoma di ogni cellula che infetta, mentre i vettori di impacchettamento contengono i geni per tutte le altre proteine necessarie per produrre un virus lentivirale; chiudere il coperchio e mescolare capovolgendo il tubo alcune volte.Incubare il DNA e il reagente di trasfezione da 15 a 20 minuti a temperatura ambiente. A questo punto è possibile trasfettare le cellule 2 9 3 con il DNA preparato, utilizzando cellule che sono state seminate 24 ore prima e che hanno raggiunto una confluenza del 50-70%. Nell'ambiente sterile della cappa a flusso laminare, pipettare tutto il DNA preparato sulla piastra contenente le cellule 2 9 3, mescolando delicatamente inclinando la piastra avanti e indietro. Reintrodurre le cellule nell'incubatore e lasciare proseguire la produzione virale per 48-96 ore prima del raccolto. Durante l'incubazione, le cellule 2 9 3 producono lentivirus il cui genoma contiene una copia di RNA del DNA di interesse.Ora è il momento di raccogliere il virus. Togliere le cellule dall'incubatore. Avere pronti nella cappa a flusso laminare un filtro per siringa da 0,4 o cinque micron, una siringa monouso da 10 millilitri e un tubo da centrifuga UltraClear Beckman.Utilizzare la siringa monouso per rimuovere il sopranatante, che ora contiene il virus. Applicare un filtro per siringa da 0,45 micron alla punta e filtrare il virus in un tubo centrifuga UltraClear Beckman. Il filtro permette il passaggio dei soli virus, escludendo le cellule; dopo il filtraggio, incubare tutte le cellule produttrici di virus prima di smaltirle.Immergere piastre di coltura, siringhe e filtri in una soluzione di candeggina al 10% per 45 minuti. Ora che hai raccolto e filtrato il virus, è il momento di concentrarlo mediante ultracentrifugazione. Utilizza DMEM privo di siero per bilanciare tutti i tubi contenenti il virus in modo che differiscano tra loro di non più di 0,2 grammi.Successivamente, caricare le provette bilanciate nei secchi del rotore SW 41 TI o SW 28. Chiudere ermeticamente i secchi del rotore e agganciarli al rotore. Quindi posizionare il rotore all'interno dell'ultracentrifuga.Centrifugare il virus per circa 90 minuti a quattro gradi Celsius a 25.000 giri al minuto in un rotore SW 41 TI, oppure a 24.000 giri al minuto in un rotore SW 28. Al termine della centrifugazione, tornare nell'ambiente sterile per colture cellulari e capovolgere il tubo per versare il surnatante in un contenitore contenente candeggina al 10%. Utilizzare un fazzoletto di carta Kim per assorbire il liquido in eccesso intorno al pellet e capovolgere il tubo in un rack adatto per non più di cinque minuti, fino al momento in cui si è pronti a risospendere il pellet.Per risospendere il pellet virale, utilizzare una punta filtrante per aggiungere 100 microlitri di PBS sterile prefiltrato al tuo tubo. Quindi aspirare e dispensare su e giù circa 20 volte. Lasciare il virus a quattro gradi durante la notte per completare la risospensione.È possibile conservare i preparati virali a quattro gradi per circa una settimana e a meno 80 gradi per un periodo massimo di un anno. Ricordare di trattare tutti i tubi vuoti con una soluzione di candeggina al 10% prima dello smaltimento. Se si prevede di utilizzare il preparato virale per un periodo superiore alla settimana, è possibile mantenerlo in frigorifero.Preparare aliquote minime di cinque a 20 microlitri per esperimenti futuri e un’aliquota di tre a cinque microlitri per la titolazione; congelare e conservare le aliquote a circa meno 80 °C. Il passo successivo consiste nel determinare il titolo virale. Se è stato inserito un gene reporter fluorescente nel plasmide lentivirale, le cellule infettate emetteranno fluorescenza e sarà possibile determinare il titolo virale mediante citometria a flusso.Per iniziare, diluire tre microlitri di virus concentrato in 1,5 millilitri di mezzo completo in pozzetti da uno a sei, disposti in una singola fila di una piastra a 96 pozzetti. Eseguire le seguenti diluizioni seriali in tutti e sei i pozzetti aggiungendo 100 microlitri di DM completo. Al primo pozzetto aggiungere 100 microlitri di mezzo senza virus.Questo è il controllo non colorato. Al secondo pozzetto, aggiungere 100 microlitri del virus diluito al terzo. Aggiungere 100 microlitri della miscela dal secondo pozzetto al quarto.Aggiungeremo 100 microlitri dal terzo pozzetto al quinto. Aggiungeremo 100 microlitri dal quarto pozzetto al sesto. Aggiungeremo 100 microlitri dal quinto pozzetto.Prelevare infine 100 microlitri dalla sesta pozzetta e scartarli, quindi aggiungere della soluzione di candeggina per portare il volume totale in tutte le pozzette a 200 microlitri con DMEM. Ad ogni diluizione, la concentrazione virale si riduce della metà. Si noti che queste sono solo diluizioni suggerite, che dovrebbero funzionare bene per la titolazione della maggior parte dei virus concentrati.Se il tuo virus ha un titolo basso o non è concentrato, potresti dover aggiustare i tuoi diluizioni. Tratta qualsiasi virus diluito non utilizzato con candeggina al 10% per 45 minuti prima di smaltirlo in un contenitore per rifiuti biologici. Aggiungi circa 15.000 cellule 293T sane e in attiva divisione a ciascuna delle sei pozzette.È possibile utilizzare una singola piastra a 96 pozzetti per titolare 16 preparazioni virali, portare i pozzetti a 200 microlitri, reinserire le cellule nell'incubatore e lasciare procedere l'infezione per almeno 48 ore. Al termine dell'incubazione, analizzare la fluorescenza cellulare mediante citometria a flusso. È possibile utilizzare la percentuale di cellule fluorescenti per pozzetto per determinare il titolo o il numero di particelle virali infettive per millilitro di virus aggiunto.Calcolare il numero di unità infettive per millilitro utilizzando la seguente formula durante l'interpretazione dei risultati del citometro a flusso. Si noti che è possibile ottenere calcoli accurati del titolo solo quando le cellule infette hanno ricevuto non più di un'integrazione virale per cellula.Per garantire che ciò sia vero, utilizzare cellule con un tasso di infezione inferiore al 15% per i calcoli. Le cellule con tassi di infezione più elevati probabilmente avranno ricevuto più integrazioni virali per cellula. La diluizione suggerita al passaggio due dovrebbe produrre diversi campioni entro questo intervallo di infezione.Utilizzare idealmente diversi campioni per generare un grafico di titolazione dal quale calcolare il titolo finale. La formula calcolata a partire della retta lineare interpolata può essere utilizzata per determinare il titolo virale, ma se necessario è possibile calcolare il titolo utilizzando un singolo campione. È possibile attendersi un titolo di uno per dieci alla settima unità transducente per millilitro per il virus non concentrato e di uno per dieci alla ottava unità transducente per millilitro per il virus concentrato.Abbiamo appena mostrato come produrre lentivirus durante questa procedura. È importante rispettare tutte le normative di sicurezza biologica e smaltire correttamente i rifiuti. Questo è tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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