Lentivirus Produzione
October 2nd, 2009
Per rendere lentivirus, vettori di DNA sono transfettate in 293 cellule umane. Dopo la raccolta e concentrando il surnatante, titolo del virus è determinata dalla espressione fluorescenza con un citometro a flusso.
Questa procedura inizia con il sezionamento di 2 9 3 cellule T con lentivirus, plasmidi e vettori di imballaggio virale, il surnatante virale viene raccolto dopo un periodo di incubazione di almeno 48 ore. Il laccio viene filtrato per essere concentrato con un'ultracentrifuga dopo l'ultracentrifugazione. Il pellet virale viene risospeso con PBS per ottenere il titolo virale, prima diluire il virus concentrato in un terreno completo, quindi eseguire una diluizione seriale per infettare le cellule con lentivirus.
Ciao, sono Shein Wong del laboratorio di Michael McManus presso il Diabetes Center dell'Università della California di San Francisco. Sono Michael McManus. Oggi vi mostreremo una procedura per la produzione di lentivirus.
Utilizziamo questa procedura in laboratorio per produrre lentivirus per l'interferenza dell'RNA. Quindi iniziamo. Per iniziare questo protocollo, preparare il DNA con cui trasfettare le 2 9 3 cellule T.
Per prima cosa, diluire il reagente di trasfezione FU gene six in una provetta da 1,5 millilitri mescolando 30 microlitri di Fuji six con 600 microlitri di terreno privo di siero. Fare attenzione a non lasciare che Fuji tocchi il lato della provetta mentre la si inserisce nella temperatura ambiente di incubazione media per cinque minuti. Successivamente, nel tappo della provetta, mescolare quattro microgrammi di plasmide lentivirale con 1,33 microgrammi.
Ogni terza generazione vettori di confezionamento virale. Il plasmide lentivirale contiene il DNA. Il virus si inserirà nel genoma di ogni cellula infettata, mentre i vettori di imballaggio contengono i geni per tutte le altre proteine necessarie per produrre un virus della lenticchia, chiudere il coperchio e mescolare capovolgendo il tubo alcune volte.
Incubare il DNA e il reagente di trasfezione per 15-20 minuti a temperatura ambiente. Ora è il momento di trasfettare 2 9 3 cellule con il DNA che hai preparato, usa le cellule che hai placcato con 24 ore di anticipo e che hanno raggiunto il 50-70% di fluenza nella cappa di coltura tissutale, pipettare tutto il DNA preparato sulla piastra 2 9 3 mescolata delicatamente inclinando la piastra avanti e indietro, Rimettere le cellule nell'incubatore e lasciare che la produzione virale continui per 48-96 ore prima del prelievo. Durante l'incubazione, le 2 9 3 cellule producono lentivirus i cui genomi contengono una copia RNA del DNA di interesse.
Ora è il momento di raccogliere il virus. Togli le tue cellule dall'incubatore. Tenere a portata di mano nella cappa per coltura tissutale un filtro per siringa da 0,4 o cinque micron, una siringa monouso da 10 millilitri e una provetta da centrifuga UltraClear Beckman.
Utilizzare la siringa monouso per rimuovere il surnatante, che ora contiene il virus. Collegare un filtro per siringa da 0,45 micron alla punta e filtrare il virus in una provetta da centrifuga UltraClear Beckman. Il filtro consente il passaggio solo dei virus e non delle cellule prima di scartare, incubare tutte le cellule produttrici di virus.
Piastre di coltura, siringhe e filtri in candeggina al 10% per 45 minuti. Ora che hai raccolto e filtrato il virus, è il momento di concentrare prima il virus mediante ultracentrifugazione. Utilizzare DMEM privo di siero per bilanciare tutte le provette contenenti virus entro 0,2 grammi l'una dall'altra.
Quindi, caricare le provette da centrifuga bilanciate nei secchi del rotore SW 41 TI o SW 28. Sigillare i secchi del rotore e agganciarli al rotore. Quindi posizionare il rotore all'interno dell'ultracentrifuga.
Far girare il virus per circa 90 minuti a quattro gradi Celsius a 25.000 giri/min in un rotore SW 41 TI, o 24.000 giri/min in un rotore SW 28. Dopo la centrifugazione, rimettere nella cappa di coltura tissutale e capovolgere la provetta per versare lo SNAT in un contenitore contenente il 10% di candeggina. Usa una salvietta Kim per assorbire il liquido in eccesso attorno al pellet e capovolgi il tubo in una comoda griglia per non più di cinque minuti fino a quando non sei pronto per risospendere il pellet.
Per risospendere il pellet virale, utilizzare un puntale filtrante per aggiungere 100 microlitri di PBS sterile prefiltrato alla provetta. Quindi pipettare su e giù circa 20 volte. Lasciare il virus a quattro gradi durante la notte per completare la risospensione.
È possibile conservare i preparati virali a quattro gradi per circa una settimana e a meno 80 gradi per un massimo di un anno. Ricordarsi di trattare tutti i tubi vuoti con il 10% di candeggina prima di scartarli. Se intendi utilizzare il preparato virale per più di una settimana, si conserverà in frigorifero.
Preparare aliquote minime da cinque a 20 microlitri per esperimenti futuri e un'aliquota da tre a cinque microlitri per la titolazione, congelare e conservare le aliquote a circa meno 80. Il passo successivo è determinare il titolo virale. Se hai incluso un gene reporter fluorescente nel tuo plasmide lentivirale, le cellule infette saranno fluorescenti e potrai determinare il titolo virale utilizzando la citometria a flusso.
Per iniziare, diluire tre microlitri di virus concentrato in 1,5 millilitri di terreno completo in pozzetti, da uno a sei. In una singola fila di una piastra a 96 pozzetti. Eseguire le seguenti diluizioni seriali su tutti e sei i pozzetti a 100 microlitri di DM.To completo nel primo pozzetto aggiungere 100 microlitri di terreno senza virus.
Questo è il tuo controllo senza macchie. Al secondo, aggiungi bene 100 microlitri del virus diluito al terzo. Bene aggiungere 100 microlitri del mix dal secondo pozzetto al quarto.
Bene aggiungere 100 microlitri dal terzo pozzetto al quinto. Bene aggiungere 100 microlitri dal quarto pozzetto e al sesto. Bene aggiungere 100 microlitri dal quinto.
Bene, infine, prendi 100 microlitri dal sesto pozzetto e scarta e candeggina, porta il volume totale in tutti i pozzetti a 200 microlitri con DMEM. Ad ogni diluizione, la concentrazione virale diminuisce della metà. Si noti che queste sono solo diluizioni suggerite, che dovrebbero funzionare bene per la titolazione della maggior parte dei virus concentrati.
Se il tuo virus è a basso titolo o non concentrato, potrebbe essere necessario regolare le diluizioni. Trattare qualsiasi virus diluito inutilizzato con candeggina al 10% per 45 minuti prima di gettarlo in un contenitore per rifiuti a rischio biologico. Aggiungere circa 15.000 cellule T sane che si dividono attivamente 2 9 3 a ciascuno dei sei pozzetti.
È possibile utilizzare una singola piastra da 96 pozzetti per titolare 16 preparati virali, rabboccare i pozzetti a 200 microlitri, rimettere le cellule nell'incubatore e consentire all'infezione di procedere per almeno 48 ore. Dopo l'incubazione, analizzare la fluorescenza cellulare utilizzando un citometro a flusso. È possibile utilizzare la percentuale di cellule fluorescenti per pozzetto per determinare il titolo o il numero di particelle virali infettive per millilitro di virus aggiunto.
Calcolare il numero di unità infettive per millilitro con la seguente formula quando si interpreta il flusso. Risultati del citometro. Si noti che è possibile ottenere calcoli accurati del titolo solo quando le cellule infette non hanno ricevuto più di un'integrazione virale per cellula.
Per garantire che ciò avvenga, utilizzare celle con un tasso di infezione inferiore al 15% per i calcoli. Le cellule con tassi di infezione più elevati avranno probabilmente ricevuto più integr virali per cellula. La diluizione suggerita nella seconda fase dovrebbe produrre diversi campioni all'interno di questo intervallo di infezione.
L'ideale sarebbe utilizzare diversi campioni per generare un grafico di titolazione da cui è possibile calcolare il titolo finale. La formula calcolata dalla linea lineare adattata può essere utilizzata per calcolare il titolo virale, ma è possibile calcolare il titolo utilizzando un singolo campione, se necessario. Ci si può aspettare un titolo di una volta per 10 al settimo di unità di trasduzione per millilitro per il virus non concentrato, e di una volta 10 all'ottava unità di trasduzione per millilitro per il virus concentrato.
Ti abbiamo appena mostrato come produrre lentivirus quando esegui questa procedura. È importante rispettare tutte le norme di biosicurezza e smaltire correttamente i rifiuti. Quindi questo è tutto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.
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Panoramica
Questo articolo descrive la procedura per la produzione di lentivirus utilizzando cellule umane 293. Il processo prevede la trasfezione delle cellule con vettori di DNA, la raccolta del surnatante virale e la determinazione del titolo virale attraverso l'espressione di fluorescenza.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Virologia
- Terapia genica
- Biologia cellulare
Sfondo
- I lentivirus sono strumenti preziosi per il trasferimento genico.
- Le cellule umane 293 sono comunemente utilizzate per la produzione virale.
- Comprendere il titolo virale è cruciale per applicazioni efficaci.
- L'espressione di fluorescenza consente la quantificazione delle particelle virali.
Obiettivo dello studio
- Dimostrare un metodo affidabile per la produzione di lentivirus.
- Fornire approfondimenti sui processi di trasfezione e raccolta.
- Facilitare l'uso dei lentivirus nelle applicazioni di ricerca e terapeutiche.
Metodi utilizzati
- Trasfezione di cellule 293T con lentivirus e vettori di packaging.
- Incubazione per almeno 48 ore per consentire la produzione virale.
- Raccolta e filtrazione del surnatante virale.
- Ultracentrifugazione per concentrare il virus.
Risultati principali
- Produzione riuscita di lentivirus da cellule 293T.
- Concentrazione efficace delle particelle virali mediante ultracentrifugazione.
- Accurata determinazione del titolo virale attraverso diluizione seriale.
- Dimostrazione dell'affidabilità della procedura per applicazioni future.
Conclusioni
- Il metodo delineato è efficiente per la produzione di lentivirus.
- La determinazione del titolo basata sulla fluorescenza è efficace.
- Questo protocollo può essere adattato per varie esigenze di ricerca.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Lentivirus production enables robust gene silencing and functional genomics studies across diverse cell types, supporting early discovery and target validation in biopharma R&D. Quantitative titering via flow cytometry ensures reproducibility and scalability for downstream screening and mechanistic studies. This capability underpins predictive confidence and risk-adjusted decision-making at key portfolio inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables stable gene knockdown for interrogation of gene function in disease-relevant systems.
- Supports mechanistic de-risking by allowing precise modulation of target expression.
- Facilitates functional target validation through reproducible delivery of shRNA constructs.
Screening & Assay Development
- Provides standardized lentiviral stocks for consistent assay development and compound screening.
- Delivers quantitative viral titers to ensure reproducible infection rates across experiments.
- Enables scalable production for high-throughput screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Supports continuity from in vitro discovery to preclinical model validation when gene silencing is required.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling pathway interrogation in relevant cell systems.
- Reduces biological ambiguity in preclinical studies through controlled gene modulation.
Pipeline & Workflow Integration
Lentivirus production integrates into the discovery-to-preclinical continuum, providing a reusable platform for gene modulation and functional studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification via targeted gene knockdown.
- Screening: Supplies reproducible, titered viral stocks for assay readiness and quantitative outputs.
- Analytics: Enables precise measurement of infection efficiency and gene silencing via flow cytometry.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models through consistent gene modulation.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow adaptable across multiple targets and cell systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible lentiviral preparations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust functional studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cell culture, and biosafety procedures.
- Needs access to ultracentrifugation and flow cytometry infrastructure for concentration and titering.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducible viral production and quantification.
- Adaptable to various cell types but may require optimization for specific systems.
- Strict biosafety and waste disposal protocols must be followed throughout the workflow.
