Preparazione Stendere cromosomiche di cellule staminali embrionali umane per cariotipo

Introduzione. Salve. Siamo dell'Istituto di Scienze Biometriche dell'Università Federale di Faja in Brasile. In questo video prepareremo vetrini cromosomici di cellule staminali embrionali umane per rilevare possibili alterazioni cromosomiche miracolose. Sebbene sia stato dimostrato che le cellule staminali embrionali umane presentano un cariotipo stabile e ben distribuito, numerosi studi hanno riportato che, a seconda delle condizioni di coltura, tendono ad acquisire anomalie cromosomiche come l'aggiunta di cromosomi interi o di parti di cromosomi.

La caratterizzazione dell'integrità genetica degli HASS in vitro è fondamentale considerando i loro impieghi essenziali negli studi di embriogenesi e nei test farmacologici. Inoltre, per future proposte terapeutiche, le alterazioni cromosomiche rappresentano una preoccupazione reale poiché sono spesso associate alla carcinogenesi. Cominciamo dunque.

Trattare le cellule con ate. In questa procedura, lo utilizziamo. Gli otto o nove ha linea curata in F 12 integrato con il 20% di sostituto del siero senza conteggio e 80 a nove grammi per millilitro di fattore di crescita dei fibroblasti. Iniziare rimuovendo il flacone coltura dall'incubatore e, sotto una cappa a flusso laminare, aggiungere coit a una concentrazione finale di 0,1 microgrammo per millilitro.

L'aggiunta di Coit alla media induce mitoka, riposo e metafase. Quando i cromosomi sono ben condensati e possono essere visualizzati più facilmente al microscopio, assicurarsi di utilizzare tecniche sterili per evitare contaminazioni. Dopo aver aggiunto Coit, conservare la fiala e reinserire le cellule nell'incubatore.

Dopo il periodo di incubazione, le cellule non sono ancora pronte per essere fissate. Non è necessario lavorare in condizioni sterili. Iniziare aspirando il mezzo e, al termine, aggiungere della tripsina.

Aggiungere lo 0,05% di DTA al matraccio. Assicurarsi di aggiungere una quantità sufficiente di triptasi da coprire completamente la superficie inferiore delle cellule. Chiudere il matraccio e agitare delicatamente per distribuire in modo uniforme.

La tripsina permette alle cellule di incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo i cinque minuti di incubazione a temperatura ambiente, le cellule non dovranno più essere attaccate alla superficie inferiore del fiasco e sarà necessario inattivare la tripsina aggiungendo il mezzo di coltura contenente siero oppure aggiungendo delicatamente siero sulle cellule. Rimuovere con attenzione il tappo del fiasco e aggiungere il mezzo di coltura o il siero, facendo scorrere il liquido lungo la superficie inferiore del fiasco, coprendo le cellule.

Pipettare su e giù la sospensione cellulare diverse volte per dissociare completamente le cellule. Trasferire le cellule in un tubo conico da 15 millilitri, ma prima assicurarsi che le cellule siano state ben dissociate e che la sospensione non contenga grumi cellulari visibili. Una volta completato il trasferimento, chiudere il tubo con il tappo e centrifugare.

Piegare la sospensione per cinque minuti. Dopo la centrifugazione a 800 giri al minuto, dovrebbe formarsi una pellicola cellulare sul fondo del tubo. Avere cura di non disturbare la pellicola cellulare.

Aspirare la sospensione utilizzando una pipetta P1000 fino a quando ne rimangono circa 200 microlitri. Questo volume è mediano rispetto a Resus. Sospendere il pellet in Resus.

Sospendere il pallet. Agitare delicatamente il tubo con le dita diverse volte. Verificare che le cellule siano state ben sospese controllando che non rimangano grumi di cellule nella soluzione.

A questo punto, la soluzione dovrebbe essere torbida. Successivamente, è necessario aggiungere cinque millilitri di una soluzione di cloruro di potassio 75 millimolare preriscaldata a 37 gradi Celsius. La soluzione ipotonica deve essere aggiunta molto lentamente lungo la parete del tubo mentre si ruota il tubo.

Dopo aver aggiunto i primi tre millilitri, chiudere saldamente il tubo e con attenzione. Omogeneizzare la sospensione cellulare con una soluzione ipotonica ruotando delicatamente il tubo in posizione orizzontale e facendolo girare lentamente.

Procedere aggiungendo lentamente i rimanenti due millilitri nello stesso modo di prima. Lo scopo della soluzione ipotonica è aumentare il volume cellulare per permettere ai cromosomi di disintrecciarsi. Pertanto, questo periodo di incubazione è cruciale per ottenere buone distribuzioni cromosomiche. Una volta aggiunti tutti e cinque i millilitri, chiudere il tubo e incubare le cellule in un bagno termostatato a 37 gradi Celsius per 15 minuti.

Al termine del periodo di incubazione di 15 minuti, rimuovere il tubo dal bagno termico. A questo punto, è necessario lavorare sotto cappa, poiché i fumi prodotti dalla soluzione fissativa sono tossici. Se non si dispone di una cappa, assicurarsi di lavorare in un'area ben ventilata.

Rimuovere il tappo del tubo e aggiungere tre gocce della soluzione fissativa. Questa è un rapporto 3:1 di metanolo e acido acetico e deve essere preparata nel giorno dell'uso. Chiudere ermeticamente il tubo e ruotarlo delicatamente in orizzontale, facendolo girare lentamente prima in senso orario, poi in senso antiorario.

Centrifugare il tubo per cinque minuti a 800 giri/min senza freno. È molto importante che il ciclo di centrifugazione si arresti lentamente per evitare la perdita di materiale causata dall'usura cellulare dopo la centrifugazione. Questo cardioproliferato vive in circa 200.

Per semplice sospensione del palato, agitare delicatamente il tubo con le dita più volte. Assicurarsi che le cellule siano state ben sospese verificando che non rimangano grumi cellulari. La soluzione a tre millilitri di soluzione fissativa va aggiunta lentamente lungo la parete del tubo mentre lo si ruota, dopo aver aggiunto i primi tre millilitri.

Chiudere ermeticamente il tubo T e omogeneizzare con attenzione la sospensione cellulare ruotando delicatamente il tubo in posizione orizzontale e facendolo girare lentamente. Assicurarsi di effettuare almeno un'intera rotazione. Per ottimizzare questo processo di miscelazione, aggiungere altro.

Aggiungere due millilitri della soluzione fissante lungo la parete del tubo per raccogliere le cellule. Conservare la sospensione cellulare a quattro gradi Celsius durante la notte. Le cellule fissate possono essere conservate nella soluzione fissante a quattro gradi Celsius per mesi.

Il giorno successivo, lavare le cellule centrifugando per cinque minuti a 800 g senza freno. Rimuovere il soprannatante e lasciare il pellet in circa 200 microlitri. Sospendere il pellet agitando ripetutamente il tubo con le dita.

Assicurarsi che le cellule siano state ben associate e che la sospensione non contenga grumi cellulari visibili. Aggiungere lentamente cinque millilitri di soluzione fissativa fresca lungo la parete del tubo. Chiudere il tubo e omogeneizzare le cellule ruotando delicatamente il tubo in senso orizzontale mentre lo si fa girare lentamente.

Oltre a proteggere le cellule, la soluzione fissativa rimuove i lipidi e denatura le proteine, facilitando così la diffusione dei cromosomi. Centrifugare il campione nel tubo per cinque minuti a 800 RRP M senza freno. Preparazione dei vetrini: al termine della centrifugazione, lasciare una quantità sufficiente di soluzione per omogeneizzare il pellet cellulare.

Questa quantità di liquido può dipendere dal numero di cellule. Agitare delicatamente il tubo con le dita per diverse volte. Assicurarsi che le cellule siano ben dissociate verificando l'assenza di grumi cellulari visibili.

A questo punto, la soluzione dovrebbe essere aggiunta al bersaglio, depositando da 20 a 30 microlitri di sospensione cellulare su un vetrino pulito e asciutto, muovendo la pipetta parallelamente a questa superficie luminosa. Mentre la soluzione fissativa evapora, la superficie luminosa diventa immediatamente granulosa. Esporre questa superficie rivolta verso l'alto al vapore di acqua calda per 30 secondi per far gonfiare le cellule.

Analisi di queste preparazioni. Dopo aver preparato questi vetrini, analizzarli al microscopio a contrasto di fase utilizzando gli obiettivi 10 e quelli pelosi per verificare se la densità cellulare è adatta a ulteriori analisi. Questo vetrino è un esempio di preparato troppo concentrato.

Si noti che i nuclei cellulari sono troppo vicini agli allargamenti della metafase. Se si dispone di un vetrino in cui la densità cellulare è troppo elevata, allora diluire la sospensione cellulare aggiungendo ulteriore soluzione fissativa. Questo vetrino mostra la densità cellulare desiderata.

Si noti che le metafasi sono ben disperse e isolate. Una volta ottenuto un vetrino con una densità cellulare ottimale, non può essere colorato e analizzato. Evitare di selezionare le metafasi vicine al nucleo, poiché i cromosomi potrebbero essere nascosti o ostruiti alla vista.

Cercare metafasi arrotondate, ma assicurarsi che nessun cromosoma sia allineato; scegliere metafasi arrotondate e ben isolate. Come nella diapositiva seguente, cercare di evitare di riportare falsi IES, ovvero il guadagno di cromosomi generato da due o più allargamenti, o la perdita di cromosomi causata da cromosomi allineati.

Speriamo che questo video ti sia utile per i tuoi futuri esperimenti. Se hai dei dubbi, non esitare a contattarci. Buon divertimento e buona fortuna.