L'uso del kit di rilevamento a fluorescenza della proteasi per determinare l'attività della proteasi

Questo protocollo inizia aggiungendo in una provetta da microcentrifuga il buffer di incubazione, la soluzione di caseina FXI e il campione contenente la proteasi di interesse, quindi mescolando delicatamente e incubando a 37 gradi Celsius per 60 minuti al buio. Per arrestare la reazione proteolitica al termine del periodo di incubazione, aggiungere la soluzione di acido tricloroacetico (TCA), mescolare delicatamente e incubare nuovamente a 37 gradi Celsius per 30 minuti al buio. Questo passaggio provocherà la precipitazione del substrato non reagito.

Centrifugare il campione per 10 minuti. A 10.000 G, rimuovere il soprannatante, che contiene i frammenti marcati di FXI solubili in acido. Trasferire il soprannatante in una piastra a pozzetti singoli o multipli, diluire con tampone per saggio e leggere il campione su un fluorimetro.

Ciao, sono Carrie Cup Vineyard e sono una scienziata presso la nostra struttura Sigma Aldridge DeKalb a St. Louis, Missouri. Oggi vi mostrerò un procedimento per la determinazione dell'attività proteasica fluorometrica. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio di controllo qualità per determinare un'attività proteasica bassa.

Iniziamo. Per questa procedura, il buffer di incubazione, il buffer per il saggio e la soluzione di acido tricloroacetico 0,6 N (TCA) sono forniti pronti all'uso. Aliquotare la soluzione di Cain marcata con fite in volumi più piccoli e conservarla a meno 20 gradi Celsius, avendo cura di proteggerla dalla luce utilizzando viali ambrati o avvolgendo provette trasparenti nella pellicola di alluminio.

Quotare il substrato fite Cain riduce la necessità di cicli ripetuti di congelamento e scongelamento; cicli ripetuti di congelamento e scongelamento o agitazione vigorosa o mescolamento del fite Cain potrebbero portare alla separazione del fite dal Cain, causando un fondo più elevato. Se si esegue la calibrazione del fluorimetro o si determina il range lineare per il segnale del fit e, preparare la soluzione di controllo del fit. Preparare la soluzione fresca ricostituendola nel buffer del saggio alla concentrazione appropriata.

Una volta pronto, proteggere la soluzione dalla luce. Infine, preparare il controllo della tripsina proteasi aggiungendo 100 microlitri di acido cloridrico uno millimolare al flaconcino contenente la tripsina liofilizzata, e mescolare brevemente per assicurarsi che la tripsina sia completamente disciolta. Conservare la tripsina in condizioni acide aumenta la sua stabilità.

Si noti che la soluzione di controllo della tripsina è sensibile alla temperatura e non è stabile a basse concentrazioni. Successivamente, iniziare a preparare tutti i campioni per il saggio, che includono campioni di prova, controllo e bianco durante l'intero saggio. Mantenere i campioni protetti dalla luce per ciascun campione di prova.

Unire in una provetta da microcentrifuga 20 microlitri di buffer di incubazione, 20 microlitri del substrato fitc-chiastico e 10 microlitri del campione da analizzare. È possibile utilizzare una provetta trasparente da microcentrifuga, purché il campione venga incubato al buio. Si noti inoltre che i campioni con elevata attività proteasica dovranno essere diluiti.

Il campione di controllo con tripsina viene utilizzato come controllo positivo per verificare che il saggio stia funzionando correttamente, al fine di determinare il limite di rilevamento o per creare una curva standard generale. Per preparare il controllo con tripsina, mescolare una parte di tripsina acidificata con nove parti di buffer di incubazione o con il buffer utilizzato per i campioni in prova, e omogeneizzare bene. La concentrazione finale di lavoro della tripsina è di 20 microgrammi per millilitro. Se si utilizza una proteasi specifica diversa, preparare la soluzione di controllo con quella proteasi specifica e un buffer appropriato.

Continuare a preparare il campione di controllo unendo 20 microlitri di tampone di incubazione, 20 microlitri di substrato fz cain e 10 microlitri del controllo tripsina in un tubo da microcentrifuga. Si raccomanda di eseguire almeno un campione di controllo contenente cinque nanogrammi di tripsina per ogni saggio oppure di utilizzare una diluizione seriale. L'ultimo campione è il bianco, preparato unendo 20 microlitri di tampone di incubazione, 20 microlitri del substrato Fitz Caine e 10 microlitri di acqua ultrapura in un tubo da microcentrifuga.

Con i tre tipi di campioni pronti, mescolare delicatamente ogni provetta e incubare a 37 gradi Celsius al buio per 60 minuti. Prestare attenzione a non mescolare troppo vigorosamente, poiché una turbolenza eccessiva potrebbe causare un elevato fondo fluorescente e ridurre la sensibilità del saggio. È possibile prolungare l'incubazione fino a 24 ore per aumentare la sensibilità, ma incubazioni più lunghe non sono consigliate in quanto la caseina FXI potrebbe iniziare a degradarsi.

Anche in questo caso, per evitare un elevato fondo di fluorescenza al termine dell'incubazione, utilizzare un'adeguata attrezzatura di protezione per aggiungere 150 microlitri della soluzione di TCA in ogni provetta da microcentrifuga. Dopo l'incubazione con la TCA, si dovrebbe osservare un alone bianco nella provetta, corrispondente alla miscela precipitata, non digerita e insolubile di cain; mescolare delicatamente e incubare a 37 gradi Celsius al buio per 30 minuti. Al termine dell'incubazione con la soluzione di TCA, centrifugare le provette per 10 minuti a 10.000 G a temperatura ambiente.

Il surnatante contiene i frammenti di Cain marcati con un colorante fluorescente solubili in acido, utilizzati per la misurazione della fluorescenza. Prelievarlo delicatamente dalla parte superiore del tubo in modo da non aspirare alcun precipitato del pellet nella punta della pipetta, poiché ciò causerebbe un risultato falso positivo durante il successivo rilevamento fluorescente per misurare l'attività della proteasi. Combinare 10 microlitri del surnatante di TCA con un millilitro di buffer per il saggio in un tubo e mescolare delicatamente. Inoltre, diluire lo standard di FE per l'analisi aggiungendo 10 microlitri di FE a un millilitro di buffer per il saggio. Lo standard di controllo FE e la tripsina forniscono un livello di fluorescenza che il campione non deve superare. La soluzione di surnatante di TCA e buffer per il saggio può essere conservata al buio a una temperatura compresa tra 2 e 8 gradi Celsius per un massimo di 24 ore prima di misurare la fluorescenza.

Se la misurazione viene effettuata utilizzando un vete, trasferire un millilitro della soluzione in un vete adatto; se si devono analizzare un elevato numero di campioni, è possibile utilizzare una piastra a 96 pozzetti e un lettore fluorimetrico per acquisire i dati fluorimetrici. In questo saggio, la fluoresceina isotiocianato viene fornita come controllo per una possibile calibrazione dello strumento. Qui viene mostrato un intervallo rappresentativo di linearità del segnale FS e ottenuto seguendo la procedura descritta.

L'utilizzo di questo kit con un tempo di incubazione di 30 minuti per il primo passaggio di incubazione produce questa curva standard tipica per campioni di tripsina e di controllo compresi tra 1,5 nanogrammi e 25 nanogrammi. Le misurazioni della fluorescenza sono state effettuate in una piastra a multi-pozzetti. Il limite di rilevazione del saggio corrisponde alla quantità di proteasi che genera una lettura di fluorescenza significativa superiore al valore ottenuto con il campione bianco.

Oggi vi abbiamo mostrato come utilizzare il kit Sigma Aldridge per la determinazione della proteasi per rilevare l'attività proteasica fluorimetrica in un campione biologico. Sebbene questo kit sia ottimizzato per il vostro utilizzo, è importante ricordare che, per le vostre specifiche proteasi, potrebbero essere necessarie lievi modifiche. Questo è tutto.

Grazie per averci seguito e buona fortuna con i vostri esperimenti.