Name: Transfection DNA dei mammiferi muscoli scheletrici con In Vivo Elettroporazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 56 s
Description: Impara la trasfezione di plasmidi DNA nei muscoli scheletrici di topi vivi mediante elettroporazione in vivo. Questo metodo consente la visualizzazione dell'espressione proteica tramite microscopia a fluorescenza.

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Ringraziamo il Dott. T. Otis, Dipartimento di Neurobiologia, UCLA, per condividere l&#39;impianto TPLSM con noi, il Dr. C. Fahlke, Istituto di Fisiologia, RWTH Aachen, in Germania, per la donazione del tipo pEYFP-ClC1 plasmide, e il signor . R. Serrano per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti NIH / NIAMS concede AR047664 e AR54816.

Le procedure sperimentali per elettroporazione in vivo dei muscoli FDB e IO <ol><li> Prima di avviare il protocollo di elettroporazione in vivo, i plasmidi di espressione mammifero deve essere amplificato per produrre la concentrazione nel range di 2-5 mg al Nota plasmide / l di TE:. Rotazione abbiamo utilizzare i kit di amplificazione commerciale e seguire le procedure del produttore &#39;. Plasmidi di espressione commerciale portando il lavoro di promotore CMV, molto bene nel muscolo scheletrico in trasfezioni vivo. </li><li> Aliquota il volume necessario (10-20 mL) della soluzione di plasmide e salvarlo in due provette Eppendorf da 0,5 ml (una per ogni piede del mouse). </li><li> Preparare una soluzione contenente 2 mg / ml di ialuronidasi in Tyrode sterile. </li><li> Utilizzando una scatola anestetizzare, profondamente anestetizzare un mouse utilizzando 4% isoflurano in O2 con una macchina approvata gas anestetico. Mettere l&#39;animale su una piastra elettrica (37 ° C) e mantenere l&#39;anestesia utilizzando una maschera di roditori. Monitorare la profondità dell&#39;anestesia per riflesso dito pizzico. </li><li> Sotto osservazione con un microscopio dissezione, iniettare 10 ml di soluzione ialuronidasi sotto pastiglie dei piedi di un piede del mouse utilizzando un 1 &quot;lungo 33 ago sterile calibro. Penetrare la pelle in un punto vicino al tallone del piede e far avanzare l&#39;ago per via sottocutanea verso la base delle dita dei piedi per ~ 1 / 4 &quot;. </li><li> Ripetere la procedura con l&#39;altro piede, se lo si desidera. </li><li> Scollegare l&#39;anestesia e posizionare il mouse in una gabbia. Permettergli di recuperare pienamente l&#39;anestesia. </li><li> Dopo un&#39;ora, anestetizzare l&#39;animale per la seconda volta e mettetelo sulla rampa di riscaldamento. Seguendo la stessa procedura descritta per la soluzione ialuronidasi, iniettare un totale di 20-50 mg di DNA plasmidico (a seconda delle dimensioni del costrutto plasmide). Il volume di iniezione totale dovrebbe essere inferiore a 20 microlitri / piedi. Nota: quando L μ 15-20 è necessario, è consigliabile chiudere la pelle nel punto di entrata dell&#39;ago con il tessuto-colla. </li><li> Scollegare l&#39;anestesia e posizionare il mouse in una gabbia. Permettergli di recuperare pienamente da anestesia e attendere per 10-15 minuti. </li><li> Anestetizzare l&#39;animale per la terza volta e posizionarlo sulla rampa di riscaldamento. </li><li> Seleziona un piede dell&#39;animale. Posizionare un placcati in oro aghi dell&#39;agopuntura sotto la pelle al tallone, ed un secondo alla base delle dita dei piedi. Gli elettrodi sono orientate parallelamente tra loro e perpendicolari all&#39;asse lungo del piede. </li><li> Collegare il capo degli aghi (elettrodi) allo stimolatore elettrico utilizzando micro-clip connettori. Electroporate i muscoli mediante l&#39;applicazione di 20 impulsi, 20 ms di durata / cad, a 1Hz. A seconda della distanza degli elettrodi, gli impulsi di ampiezza della tensione &#39;è regolata (attraverso il monitoraggio con un oscilloscopio) per generare un campo elettrico di circa 100 Nota V / cm. Nessun contrazioni in risposta agli stimoli devono essere osservate se il livello di l&#39;anestesia è adeguata. </li><li> Se lo si desidera, ripetere le procedure sopra nel piede controlaterale dell&#39;animale. </li><li> Rispedire l&#39;animale verso la sua gabbia e una volta completamente ripreso dall&#39;anestesia mantenerlo sotto osservazione. Nota: se il procedimento è andato normalmente, l&#39;animale deve riacquistare la piena mobilità entro 30 minuti e poi è pronto per essere inviato di nuovo alla stanza animale presso il vivaio. Le iniezioni di ialuronidasi e del DNA in pastiglie dei piedi non hanno evidenti effetti negativi sugli animali. Una volta recuperato l&#39;anestesia, i topi sono in grado di passeggiare normalmente intorno alla gabbia. Come precauzione aggiuntiva, aggiungere l&#39;acqua potabile del Carprofen animale a 0,0027 mg / ml per 2 giorni come analgesico. </li><li> Espressione della proteina possono essere analizzati 2-8 giorni dopo la transfezione. Tuttavia, l&#39;espressione costante di molte proteine ​​è stato osservato per mesi. </li></ol> NOTA: Tutte le procedure di animali sono stati approvati dal Comitato degli animali del Cancelliere UCLA di ricerca come previsto dalla legge sulla protezione degli animali e la politica PHS sulla cura umanitaria ed uso di animali da laboratorio. Rappresentante dei risultati: La corretta attuazione delle procedure di elettroporazione in vivo sopra descritto dovrebbe comportare la trasfezione di plasmidi efficace nei muscoli FDB e IO. Tuttavia, l&#39;efficienza di espressione di proteine ​​transgeniche varianti dipenderà il plasmide, la dimensione e la complessità delle proteine, le proprietà funzionali della proteina, e una serie di altre variabili fuori dal nostro controllo. Come illustrato nella figura 1 per un muscolo FDB elettroporate in presenza di un plasmide commerciale (PMR-mCherry) che codifica per la proteina mCherry, la maggior parte delle fibre muscolari sono transfettate con il nostro protocollo, come illustrato dal fatto che la maggior parte di loro mostra fluorescenza rossa. Questo non esclude la possibilità che le singole fibre presentano diversi gradi di espressione della proteina, o che le fibre non sono pochi transfettate in tutti e 3. Dovrebbe be ha osservato che l&#39;espressione efficiente di grandi quantità di proteine ​​fluorescenti come mCherry, EGFP, ECFP e EYFP, non mettere in pericolo l&#39;eccitabilità delle fibre muscolari &#39;ed eccitazione-contrazione proprietà di accoppiamento. In realtà, essi sono indistinguibili da quelli nei muscoli farsa transfettate (risultati non mostrati). Approcci pratici utilizzati per verificare l&#39;espressione di proteine ​​localizzate fluorescente-tag nelle fibre muscolari scheletriche. La localizzazione intracellulare del novo di proteine ​​espresse transgenici è regolarmente valutata dal simultanea acquisizione, utilizzando la, le immagini TPLSM fluorescente dei tag rispettivi e le immagini dei marcatori ben identificato di strutture cellulari. Il più tipico di questi ultimi sono: a) generazione di seconda armonica (SHG) immagini, che nascono dalla anisotropia miosina del sarcomero A bande (centrata sulla M-linee) e 9,10, b) di-8-ANEPPS fluorescenza immagini, che può essere ottenuta con l&#39;etichettatura e la superficie trasversale tubolare (T-tubulo) sistema delle membrane delle fibre muscolari con questo dye11 impermeant potenziometrica. Nelle immagini a fluorescenza delle fibre muscolari colorati con di-8-ANEPPS, il T-tubuli appaiono come bande strette di fluorescenza orientata circa ortogonale all&#39;asse lungo della fibra. Queste bande sono inegualmente distanziati gli uni dagli altri: sono separate da una distanza lunga che si estende in tutto il M-linee e uno corto che si estende in tutta la linea Z-11. Espressione e localizzazione di α-actinina-EGFP nelle fibre muscolari scheletriche. Un esempio di espressione di una variante tag della proteina strutturale del muscolo α-actinina è illustrato nella figura 2. Questa proteina è nota per essere una componente importante della Z-line e, come tale, è normalmente utilizzato come marcatore di questa structure12. Noi transfettate muscoli FDB e IO con il plasmide pEGFPN1-α-actinin1 codifica per l&#39;uomo (non-muscolare) α-actinina tag al terminal C con EGFP. Sei giorni dopo la transfezione, abbiamo scoperto che, valutata dalla distribuzione EGFP fluorescenza, α-actinina è in gran parte espressa a bande strette equidistanti lungo l&#39;asse della fibra. Una banda per singolo sarcomero è visto (figure 2A e 2D). La colocalizzazione di queste bande con la Z-linee è dimostrato dal confronto tra la distribuzione della fluorescenza EGFP con l&#39;SHG (Figura 2B) e di-8-ANEPPS (Figura 2E) immagini. Come mostrato dall&#39;immagine sovrapposizione (Figura 2C), α-actinina-EGFP band si alternano con le bande SHG, indicando che si trovano a metà strada tra due consecutivi M-band, in coincidenza con la posizione di Z-linee. Nelle fibre muscolari transfettate colorati con di-8-ANEPPS, α-actinina-EGFP bande sono visti centrate tra ogni coppia di T-tubuli (fig. 2F) che sono noti a fianco le linee Z (cioè separati da una distanza più breve), indicando così che transgenico α-actinina è rivolto a Z-line. Espressione di DHPRα1s tag al N-terminale con EGFP L&#39;efficienza di trasfezione muscolari con pEGFPC1.1 DHPR α-1s è verificata nelle immagini TPLSM (ad esempio Figura 3A) che mostra che la maggior parte delle fibre esprimere EGFP-DHPRα1s (una proteina transmembrana). La caratteristica più importante di fibre trasfettate è il doppio fasciato pattern di fluorescenza EGFP (Figure 3A e 3B), come ci si aspetterebbe se questa proteina è stato mirato al T-tubuli. Può anche essere osservato in Figura 3 che, mentre le fibre diverse visualizzare diversi livelli di intensità di fluorescenza, il modello a bande di fluorescenza di una singola fibra sembra essere mantenuta omogenea lungo la fibra. A maggiore ingrandimento (Figura 3B), si può chiaramente vedere che la spaziatura irregolare tra bande è simile a quello osservato in fibre colorate di-8-ANEPPS (es. Figura 2E). Le immagini sovrapposte (Figura 3B e 3E) mostrano che le bande SHG si trovano all&#39;interno della più ampia spaziatura tra EGFP-DHPRα1s band, che conferma che questa proteina è al T-tubuli. Ulteriori misure di FRET con la non-fluorescenti anione lipofili DPA-(dati non riportati) dimostrano inoltre che la porzione EGFP si trova pochi nanometri del foglietto interno della membrana del T-tubuli &#39;. Localizzazione e valutazione funzionale dell&#39;espressione di EYFP-ClC1 Fibre transfettate con pEYFP-ClC1, che codifica per una costruzione EYFP-tag (al N-terminale) del canale cloruro muscolo scheletrico (ClC1), display EYFP bande di fluorescenza (Figura 4A) con un modello simile a quello osservato per EGFP-DHPRα1s &#39;espressione (Figura 3A) e corrispondente al T-tubulo intese come illustrato con colorazione di-8-ANEPPS (2E Figura). Come previsto, la sovrapposizione di EYFP-ClC1 (Figura 4A) e le immagini SHG (Figura 4B), come mostrato nella sovrapposizione (Figura 4C), mostrano che le bande SHG sono centrati, alle distanze o di grandi dimensionif EYFP tra bande di fluorescenza. Al fine di valutare se l&#39;espressione di EYFP-ClC1 si traduce in un significativo aumento della conduttanza di riposo delle fibre muscolari, come previsto dalla sovraespressione di canali del cloro funzionale, abbiamo fibre muscolari enzimaticamente dissociato dal muscolo FDB transfettate e studiato le loro proprietà elettrofisiologiche utilizzando due microelettrodi sperimentale descritto in precedenza 6,11,13. La Figura 5 mostra i risultati di due fibre: uno che esprime una grande quantità di EYFP-ClC1 come valutato da misure globali intensità di fluorescenza in un microscopio a fluorescenza normale (non mostrato), e l&#39;altro è un non-transfettate controllo. Il record di tensione a 5A Figura (ottenuto dalla fibre muscolari che esprimono EYFP-ClC1) dimostra che a causa della conduttanza eccessivo di riposo, la fibra è quasi non-eccitabili. Impulsi di stimolo di corrente fino a 400nA (0,5 ms) necessario per essere utilizzato in modo da ottenere una risposta molto piccolo attivo (no, 5A Figura overshoot). Dopo la sostituzione della soluzione Tyrode esterno su uno contenente 500 mM del bloccante dei canali del cloruro 9-ACA, 200 impulsi nA di corrente sono stati sufficienti a provocare un potenziale d&#39;azione (Figura 5B), anche se molto più lento e più ampio rispetto a quelli registrati in fibra di controllo ( Figura 5C). Come previsto, l&#39;aggiunta di 9-ACA aveva effetti minimi su questa fibra di controllo (Figura 5D). <img src="/files/ftp_upload/1520/1520fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" /> Figura 1. Efficienza Transfection delle in-vivo metodo di elettroporazione. Brightfield (A) e di fluorescenza (B) le immagini di un muscolo FDB transfettate con PMR-mCherry. Giorni dopo il protocollo di elettroporazione: 12 giorni. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1520/1520fig1.jpg">cliccare qui</a> per una versione più grande della figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Espressione e targeting di α-actinina-EGFP in fibre FDB. Pannelli A e B sono fluorescenza EGFP e immagini SHG, rispettivamente, di una fibra che esprimono α-actinina-EGFP. Panel C è una sovrapposizione delle immagini in A e B. I pannelli D ed E sono immagini di fluorescenza di un&#39;altra fibra che esprimono α-actinina-EGFP e colorati con di-8-ANEPPS, rispettivamente. Pannello F è la sovrapposizione di immagini in D ed E. giorni dopo l&#39;elettroporazione protocollo: 6 giorni. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Espressione e targeting di EGFP-DHPRα1s in fibre FDB. Un pannello, immagine EGFP fluorescenza di un gruppo di fibre che esprimono EGFP-DHPRα1s. Pannello B è un ampliamento della piazza in un pannello per mostrare meglio il modello a bande di espressione della proteina. Panel C è l&#39;immagine SHG corrispondente all&#39;immagine in pannello A. Pannello di D è la sovrapposizione delle immagini A e C. Pannello di E è un allargamento della zona indicata nel pannello di D. Giorni dopo il protocollo di elettroporazione: 20 giorni. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Espressione e targeting di EYFP-ClC1 in fibre FDB. Pannelli A e B sono fluorescenza EYFP e immagini SHG, rispettivamente, di fibre che esprimono EYFP-ClC1. Pannello C è la sovrapposizione delle immagini in pannelli A e B. Pannello di D è un profilo di intensità misurata lungo la linea bianca evidenziata nell&#39;immagine in pannello Giorni C. dopo il protocollo di elettroporazione: 7 giorni. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Fibre valutazione elettrofisiologici esprimere transgenici EYFP-ClC1. Pannelli A e B sono record tensione da una fibra che esprime EYFP-ClC1 in risposta ad impulsi di corrente, prima e dopo il trattamento con 9-ACA, rispettivamente. Pannelli C e D sono i record di tensione (potenziali di azione) ha provocato in risposta ad impulsi di corrente in modo non transfettate fibra prima e dopo il trattamento con 9-ACA, rispettivamente.

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Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Descriviamo qui la procedura dettagliata da seguire per raggiungere trasfezioni efficace di plasmidi DNA in fibre muscolari scheletriche di elettroporazione in vivo. I principali vantaggi del nostro approccio sono la semplicità di implementazione, e la sua minima invasività che si traduce in rischio per la salute trascurabile per gli animali. In realtà, i protocolli sopra descritti elettroporazione non implicano molto di più di due iniezioni sottocutanee per piede, seguito da un protocollo di stimolazione elett...

transfection dna dei mammiferi muscoli scheletrici con in vivo elettroporazione

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Un crescente interesse per la biologia delle cellule è quello di esprimere forme transgenically modificato di proteine ​​essenziali (ad esempio, costruisce fluorescente tag e / o varianti mutanti) al fine di indagare la loro distribuzione endogene e rilevanza funzionale. Un approccio interessante che è stato implementato per soddisfare questo obiettivo in cellule altamente differenziate è il<em&gt; In vivo</emTrasfezione&gt; di plasmidi con vari metodi in tessuti specifici, come il fegato<sup&gt; 1</sup&gt;, Muscolo scheletrico<sup&gt; 2,3</sup&gt;, E anche il cervello<sup&gt; 4</sup&gt;. Vi presentiamo qui una descrizione dettagliata dei passi che devono essere seguite per trasfezione efficiente materiale genetico nelle fibre del<em&gt; Flessore breve delle dita</em&gt; (FDB) e<em&gt; Interassea</em&gt; (IO) i muscoli di topi adulti con un<em&gt; In vivo</emElettroporazione&gt; approccio. I parametri sperimentali sono stati ottimizzati in modo da massimizzare il numero di fibre muscolari transfettate, riducendo al minimo i danni dei tessuti che possano compromettere la qualità e la quantità delle proteine ​​espresse in singole fibre. Abbiamo verificato che l&#39;attuazione della metodologia descritta in questo documento si traduce in un rendimento elevato di proteine ​​solubili, cioè EGFP e ECFP<sup&gt; 3</sup&gt;, Calpaina, FKBP12, β2a-DHPR, ecc proteine ​​strutturali, cioè minidystrophin e α-actinina, e proteine ​​di membrana, cioè α1s-DHPR, RyR1, cardiaco Na / Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Scambiatore Na NaV1.4 canale, SERCA1, ecc, se applicato a FDB, IO e altri muscoli di topi e ratti. L&#39;espressione efficace di alcune di queste proteine ​​è stata verificata con biochimiche<sup&gt; 3</sup&gt; E prove funzionali<sup&gt; 5</sup&gt;. Tuttavia, di gran lunga l&#39;approccio più comune di conferma da noi utilizzati sono standard microscopia a fluorescenza e 2-fotone microscopia a scansione laser (TPLSM), che permettono di identificare non solo l&#39;espressione generale, ma anche la localizzazione dettagliata intracellulare, di costrutti proteina fluorescente tag. Il metodo potrebbe essere ugualmente usato per trasfettare plasmidi che codificano per l&#39;espressione di proteine ​​di rilevanza fisiologica (come mostrato qui), o per interferenza RNA (siRNA), volto a sopprimere l&#39;espressione di proteine ​​normalmente espresse (non ancora testato da noi). Va notato che la transfezione delle fibre muscolari e FDB IO è particolarmente rilevante per lo studio della fisiologia dei mammiferi in quanto le fibre muscolari enzimaticamente dissociato da questi muscoli sono attualmente uno dei modelli più adatti per indagare i meccanismi di base di accoppiamento eccitabilità e di eccitazione-contrazione sotto condizioni di pinza di corrente o tensione<sup&gt; 2,6-8</sup&gt;.

Si descrivono le modalità dettagliate per la trasfezione efficiente di DNA plasmidico nelle fibre dei muscoli piedi di topi dal vivo utilizzando elettroporazione e la successiva visualizzazione di espressione della proteina usando la microscopia a fluorescenza.

Transfection DNA dei mammiferi muscoli scheletrici con In Vivo Elettroporazione

Un interesse crescente nella biologia cellulare è l'espressione di forme transgenicamente modificate di proteine essenziali (ad esempio, costrutti marcati con proteine fluorescenti e/o mutanti...

L'elettroporazione può essere eseguita in vivo per trasfettare DNA, plasmidi ed esprimere in modo transgenico nei muscoli flessori brevi delle dita (FDB) e interossei (IO) del topo adulto. La procedura inizia con l'anestesia del topo. La superficie plantare di una zampa viene preparata per la prima iniezione di ialuronidasi inserendo l'ago nel tallone e guidandolo sottocutaneamente lungo il piede.Dopo un'ora, l'animale viene nuovamente anestetizzato e il plasma viene iniettato nella stessa regione sottocutanea del piede in cui era stata iniettata l'ialuronidasi. Dopo 10 minuti, vengono posizionati sottocutaneamente aghi da agopuntura placcati in oro come mostrato. Gli impulsi di elettroporazione vengono somministrati dopo aver collegato gli aghi allo stimolatore, se necessario.La procedura può essere ripetuta nel piede controlaterale. Dopo un periodo compreso tra due e otto giorni, l'animale viene sacrificato, i muscoli sono dissecati e la trasfezione della proteina desiderata viene verificata osservando la fluorescenza al microscopio. Ciao, sono Marino DeFranco del laboratorio di Julio Vera del Dipartimento di Fisiologia della Davy Geffen School of Medicine presso l'UCLA.Oggi vi mostreremo un procedimento per la trasfezione in vivo di un plasmide esprimente una proteina transgenica in fibre muscolari di topi adulti. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare l'espressione e la localizzazione di proteine transgeniche, nonché l'effetto dell'iperespressione della proteina sulla fisiologia delle fibre muscolari. Cominciamo dunque.Prima di iniziare i protocolli di elettroporazione in vivo, i plasmidi di espressione per mammiferi devono essere amplificati per ottenere concentrazioni comprese tra due e cinque microgrammi di plasmide per microlitro di tampone TE. Utilizziamo abitualmente kit di amplificazione Qiagen e seguiamo le istruzioni del produttore. Suggeriamo plasmidi di espressione commerciali contenenti il promotore CMV, ad esempio EEG FPC uno o EEG FPN uno di in Vitrogen.Poiché questo promotore funziona molto bene nel muscolo scheletrico, in vivo transections, illustreremo la procedura. Utilizzando P EEG FPN uno, abbiamo preparato in anticipo una soluzione contenente due milligrammi per millilitro di ialuronidasi in tyro sterile. Questa soluzione viene mantenuta a temperatura ambiente fino al momento dell'utilizzo per preparare gli animali.Per la trasfezione, utilizziamo una scatola anestetica collegata a un macchinario per anestesia gassosa omologato e anestetizziamo profondamente l'animale con il 4% di ISO in ossigeno. Una volta anestetizzato, applichiamo un unguento per proteggere gli occhi del topo dall'essiccamento durante le successive procedure anestetiche. Posizionare l'animale su un tappetino riscaldante impostato a 37 gradi Celsius e mantenere l'anestesia utilizzando una maschera facciale odontoiatrica.Monitorare la profondità dell'anestesia verificando il riflesso alla compressione delle dita dei piedi. Quando l'animale è profondamente anestetizzato, utilizzare un ago sterile da un pollice di lunghezza e calibro 33 per iniettare 10 microlitri di soluzione UR elevata sotto la pelle della pianta di un piede del topo, osservando al microscopio stereoscopico; penetrare la cute in un punto vicino al tallone del piede e avanzare l'ago sottocutaneamente verso la base delle dita.Per circa un quarto di pollice, iniettare la soluzione delicatamente per evitare un'eccessiva tumefazione della pelle. Ripetere la procedura con l'altro piede. Se lo si desidera, l'enzima iniettato, nel giro di circa un'ora, ammorbidirà il tessuto connettivo circostante le fibre muscolari attraverso l'idrolisi dell'acido ialuronico.Questo faciliterà la diffusione del plasmide di DNA che verrà iniettato successivamente nello spazio interstiziale tra le fibre. Dopo l'iniezione di ialuronidasi, disconnettere l'anestesia e posizionare il topo in una gabbia. L'animale si riprenderà dall'anestesia in tre o quattro minuti.Dopo un'ora, anestetizzare nuovamente l'animale. Raccogliere 10 microlitri di soluzione plasmidica e posizionare una goccia sul dorso di una piccola barchetta di siero pulita. Prelevare la goccia con la siringa per iniezione e iniettarla nel cuscinetto plantare.Seguendo la stessa procedura descritta per la soluzione di ialuronidasi per proteine più grandi, è possibile iniettare quantità maggiori di plasma. Si raccomanda di non iniettare più di 20 microlitri qualora fosse necessario somministrare oltre 15 microlitri. Si consiglia di utilizzare una colla tissutale per chiudere la cute nel punto di inserzione dell'ago, al fine di prevenire qualsiasi rischio di fuoriuscita di DNA attraverso il punto di puntura.Scollegare l'anestesia e posizionare il topo in una gabbia. Lasciarlo riprendere completamente dall'anestesia e attendere da 10 a 15 minuti per prepararlo all'elettroporazione. Anestetizzare l'animale come fatto in precedenza.Selezionare un piede dell'animale, posizionare un ago da agopuntura placcato in oro o un elettrodo sotto la pelle al tallone e il secondo alla base delle dita dei piedi. Gli aghi sono orientati parallelamente tra loro e perpendicolarmente all'asse lungo del piede. Gli aghi da agopuntura hanno un diametro di 160 micrometri e una lunghezza di 13 millimetri.Sono venduti singolarmente confezionati e sterili. A seconda della distanza tra gli aghi, regolare l'ampiezza dell'impulso per erogare impulsi di tensione. Generare un campo elettrico di circa 100 volt per centimetro.Regolare la durata dell'impulso a 20 millisecondi e la frequenza a un hertz. Collegare la testa degli elettrodi al stimolatore elettrico utilizzando connettori a microclips. Stimolare i muscoli del piede applicando 20 impulsi elettrici.Monitorare l'andamento della tensione all'interno dell'oscilloscopio. Non si osservano contrazioni significative in risposta agli stimoli. Se il livello di anestesia è adeguato, se così si desidera, mentre l'animale è ancora sotto anestesia.Ripetere la procedura di elettroporazione sopra descritta nell'altro piede; dopo l'elettroporazione, restituire l'animale alla sua gabbia e mantenerlo sotto osservazione. Finché non si sarà completamente ripreso dall'anestesia, l'animale dovrebbe riacquistare piena mobilità entro cinque minuti. Se non si sono verificate reazioni avverse e la procedura è andata normalmente, come ulteriore precauzione, aggiungere all'acqua da bere dell'animale carfin al 0,027 milligrammi per millilitro per due giorni.Come proteina analgesica, l'espressione può essere saggia da due a otto giorni dopo la trasfezione. Tuttavia, è stata osservata un'espressione prolungata di molte proteine per mesi. L'efficienza della trasfezione di un muscolo FDB elettroporato con il plasmide commerciale P EEG FPN, che codifica per la proteina EGFP, può essere facilmente visualizzata mediante luce UV proveniente da una lampada UV portatile o da diodi UV ad alta intensità.Osservando la zampa del topo al microscopio stereoscopico, si può notare che la maggior parte delle fibre muscolari è stata trasfettata con il nostro protocollo, come dimostrato dal fatto che la maggior parte di esse mostra una fluorescenza verde. Il microscopio stereoscopico evidenzia il modello generale di trasfezione del muscolo. Ripetendo questa osservazione.L'utilizzo di un microscopio a fluorescenza episcopica consente la visualizzazione del pattern di espressione di EGFP in fasci di fibre muscolari o persino in fibre singole. L'efficienza dell'espressione della proteina mCherry nelle fibre muscolari FDB può essere valutata confrontando le immagini in campo chiaro e quelle in fluorescenza del muscolo. La localizzazione intracellulare delle proteine transgeniche espresse de novo può essere valutata mediante microscopia a scansione laser a due fotoni a tale scopo.Le immagini delle proteine marcate con fluorescenza e le immagini di marcatori ben identificati delle strutture cellulari vengono acquisite contemporaneamente. I marcatori più tipici delle strutture cellulari sono le immagini di generazione armonica di secondo ordine o SHG, che derivano dall'anisotropia della miosina nei sarcomeri. Le bande A centrate sulle linee M e il colorante.Immagini di fluorescenza dell'annesso, ottenibili etichettando con un colorante fluorescente impermeante le membrane del sistema tubulare trasverso o tubuli T delle fibre muscolari in immagini di fluorescenza di fibre muscolari colorate con il colorante otto anep. I tubuli T appaiono come sottili bande fluorescenti orientate approssimativamente in modo ortogonale rispetto all'asse longitudinale della fibra. Queste bande sono disposte a distanze diseguali l'una dall'altra.Sono separati da una lunga distanza, che si estende attraverso le linee M, e da una breve distanza, che si estende attraverso la linea Z. Qui viene mostrato un esempio dell'espressione di una variante marcata della proteina strutturale muscolare alfa-actinina. Questa proteina è un componente principale della linea Z ed è comunemente utilizzata come marcatore di questa struttura.Abbiamo trasfettato i muscoli FDB e IO con il plasmide P-E-G-F-P Fpn one alpha actinin, uno codificante per l'alpha actinin umana non muscolare etichettata al C-terminale con EGFP, sei giorni dopo la trasfezione. Abbiamo osservato che l'alpha actinin è espressa principalmente in bande strette equidistanti lungo l'asse della fibra. Si osserva una singola banda per sarcomero.La colocalizzazione di queste bande con le linee Z è evidenziata dal confronto della distribuzione della fluorescenza EGFP con le immagini SHG o D eight annex, come mostrato dall'immagine di sovrapposizione. Le bande di Alpha Acton e EGFP si alternano alle bande SHG, indicando che si trovano a metà strada tra due bande M consecutive, coincidenti con la posizione delle linee Z nelle fibre muscolari trasfettate colorate con d an up Alpha Actinin. Le bande EGFP risultano centrate tra ogni coppia di tubuli T, noti per essere posizionati ai lati delle linee Z. Ciò dimostra che l'alfa-actinina transgenica è indirizzata alla linea Z.L'espressione e il targeting della proteina DHPR alpha 1s marcata con EGFP all'estremità N sono mostrati nella figura tre. La fluorescenza è visibile principalmente come coppie di bande disposte con un modello simile a quello dei T tubuli. L'analisi sovrapposta delle immagini di SHG e di E-G-F-P-D-H-P-R alpha 1s dimostra la presenza di due bande fluorescenti EGFP tra ogni due bande consecutive di SHG, suggerendo che DHPR alpha 1s è stato correttamente indirizzato ai T tubuli. L'immunofissazione, non mostrata, fornisce una prova definitiva del corretto targeting di DHPR alpha 1s ai tubuli trasversali. Fibre trasfettate con P-E-Y-F-P CLC 1, che codifica una costrutto marcato con EYFP all'estremità C-terminale del canale del cloruro del muscolo scheletrico CLC 1, mostrano segnali di fluorescenza EYFP disposti in fasci che corrispondono all'organizzazione dei T tubuli, come illustrato con D otto e immunofissazione.Come previsto, la sovrapposizione delle immagini di EYFP CLC uno e SG mostrata nella sovrapposizione illustra che le bande SHG sono centrate negli ampi spazi tra le bande di fluorescenza di EYFP. Per valutare se l'espressione di EY FP CLC uno determina un aumento significativo della conduttanza a riposo delle fibre muscolari, come previsto dall'overespressione di canali del cloruro funzionali, abbiamo dissociato enzimaticamente le fibre muscolari dal muscolo FDB TRANSFETTATO e ne abbiamo studiato le proprietà elettrofisiologiche utilizzando un apparato sperimentale con due microelettrodi.Questa immagine mostra i risultati ottenuti da due fibre: una che esprime elevate quantità di EYFP clc e un'altra utilizzata come controllo non trasfettato. La prima è stata valutata mediante misurazioni dell'intensità di fluorescenza globale effettuate con un microscopio a fluorescenza standard.Il tracciato di tensione è stato ottenuto dalla fibra muscolare che esprime EY FP CLC one. Un impulso di corrente più grande di quello necessario per eccitare una fibra controllo elicitava solo una piccola risposta rigenerativa nella fibra trasfettata quando la soluzione esterna di Tyrode è stata sostituita con una soluzione contenente 500 micromolar del bloccante del canale per il cloruro nine Racine carboxylic acid o nine A CA. Un impulso più piccolo elicitava un potenziale d'azione, sebbene molto più lento e più ampio rispetto a quelli registrati nella fibra controllo, come previsto.L'aggiunta di nove a CA ha avuto effetti minimi sulla fibra di controllo. Concludiamo che la fibra che esprime EY FP CLC è quasi non eccitabile a causa della conduttanza basale eccessiva al cloruro. Vi abbiamo appena mostrato come trasfettare un plasmide che esprime una proteina transgenica in una fibra muscolare scheletrica vivente mediante elettroporazione, e anche come valutare l'efficienza della trasfezione e la localizzazione e la funzione delle proteine trasfettate.Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.I.

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