Preparazione del pool lisato piastrinico umani (pHPL) come supplemento efficiente per animali siero-Free Culture sulle cellule staminali umane
30 ottobre 2009
Umano lisato piastrinico è una ricca fonte di fattori di crescita e di un supplemento potente nelle cellule in coltura. Questo protocollo presenta il processo di preparazione di un ampio pool di lisato piastrinico umano partendo da plasma ricco di piastrine, eseguendo numerosi cicli di gelo-disgelo e riducono i frammenti delle piastrine.
Questo protocollo descrive il processo di preparazione di una grande quantità di lisato piastrinico umano, a partire da plasma ricco di piastrine. Eseguendo un ciclo di congelamento-scongelamento, le piastrine vengono lisate. Successivamente, almeno 10 unità di lisato piastrinico umano vengono aggregate in un unico lotto di lisato piastrinico umano aggregato, o PHPL.
Questo volume di circa tre litri viene ulteriormente suddiviso in aliquote e nuovamente congelato per esaurire i frammenti piastrinici. Queste aliquote vengono scongelate, trasferite in provette e centrifugate. Il soprannatante è il PHPL privo di frammenti piastrinici, contenente fattori di crescita derivati dalle piastrine utilizzati come supplemento per le colture cellulari.
Il pellet rimanente di frammenti piastrinici viene scartato. Ciao, sono Kadina Sharmo del laboratorio del Dott. TRO dell'unità di ricerca sulle cellule staminali presso l'Università Medica di Grads. Oggi vi mostreremo un procedimento per la preparazione di un pool di isolati piastrinici umani.
Partiremo dal plasma ricco di piastrine, eseguiremo diversi cicli di congelamento e scongelamento, quindi elimineremo i frammenti piastrinici. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per ottenere un supplemento sufficiente per colture cellulari, come alternativa al siero fetale bovino. Cominciamo dunque.
Questo protocollo inizia con il plasma ricco di piastrine, chiamato PRP. Questo plasma potrebbe essere stato preparato mediante aferesi con Cy o ottenuto da strati buffy. Le persone che operano al di fuori del campo della medicina trasfusionale dovrebbero acquistare il PRP da una banca del sangue locale o da un altro fornitore autorizzato.
Verificare la sterilità dell'unità di PRP trasferendo 20 millilitri da ciascuna unità in un piccolo sacchetto collegato e staccando il sacchetto mediante il saldatore. Questo aliquota può essere inviata immediatamente dopo la preparazione a un laboratorio di microbiologia per il test di sterilità. È importante congelare le unità di PRP a almeno meno 20 gradi nel sacchetto originale di conservazione.
Una volta che i test batterici risultano negativi, si può procedere al passaggio successivo. Fare attenzione a non far scaldare eccessivamente il lisato piastrinico umano, ora chiamato HPL, immergendo le unità di HPL in un bagno d'acqua a 37 gradi fino alla scomparsa dei coaguli di ghiaccio. Dopo questo ciclo di congelamento e scongelamento, le piastrine devono essere lisate per preparare un prodotto standardizzato per ciascun pool di lisato piastrinico.
Raccogliere da 10 a 15 unità di PRP scongelate. Collegare ogni borsa HPL consecutivamente alla borsa doppia di raccolta, quindi trasferire l'HPL in queste due borse. Scollegare le borse HPL vuote utilizzando il saldatore.
Mescolare il contenuto delle due buste per ottenere un volume finale di tre-quattro litri di lisato piastrinico umano in pool, ora denominato PHPL. Collegare una busta più piccola ed estrarre un campione di 20 millilitri di PHPL per verificare la sterilità del prodotto in pool.
Aliquotare campioni di PHPL per ulteriori lavorazioni collegando sacche piccole alla sacca doppia per il pooling. Trasferire volumi di circa 250 millilitri nelle sacche di stoccaggio più piccole, quindi scollegare le sacche riempite utilizzando il saldatore. Eseguire ora un ulteriore ciclo di congelamento-scongelamento per aumentare il tasso di frammentazione delle piastrine e la quantità di fattori di crescita rilasciati.
Eseguire questa operazione congelando le piccole buste contenenti porzioni di PHBL a meno 20 gradi. Successivamente scongelare le buste in un bagno d'acqua a 37 gradi. All'interno della cappa a flusso laminare.
Utilizzare forbici sterili per tagliare e aprire il tubo di ciascun sacchetto, quindi versare il PHPL nei vial da 50 millilitri. Spesso i frammenti piastrinici tendono ad aggregarsi e le piastrine possono anche indurre alloimmunizzazione. Per evitare queste condizioni, rimuovere i frammenti dal PHPL mediante centrifugazione a 4.000 ×g per 15 minuti in una centrifuga refrigerata.
Successivamente, pipettare il sopranatante plasmatico nei contenitori finali per la conservazione e scartare i pellet di piastrine per evitare la presenza di frammenti nelle colture cellulari da congelare. Aliquotare 50 millilitri di PHPL nuovamente a meno 20 gradi fino all'uso successivo. Ora che è stato ottenuto il PHPL privo di frammenti piastrinici, è possibile analizzarne le caratteristiche del lisato.
La funzione e la qualità del lisato piastrinico in pool sono testate in colture cellulari e dimostrate mediante la stimolazione efficiente della proliferazione cellulare, la propagazione di cellule stromali mesenchimali o MSC e di cellule formanti colonie endoteliali, E CFC, che risulta efficace utilizzando PHPL privo di frammenti piastrinici. Si prega di consultare il nostro protocollo scritto per le ricette dei mezzi qui. Due applicazioni per il lisato piastrinico umano in pool.
Nella coltura di cellule stromali mesenchimali, le MSC provenienti dal donatore uno sono state coltivate con PHPL o con PHPL privo di frammenti piastrinici. Come indicato, si osserva una maggiore contaminazione da frammenti rispetto al PHPL privo di frammenti piastrinici. I frammenti piastrinici non supportano in modo sufficiente la crescita delle MSC.
Tutte e tre le immagini sono state acquisite dopo 13 giorni di coltura. Le MSC del donatore due sono state coltivate per nove giorni in PHPL privo di frammenti piastrinici anziché in plasma ricco di piastrine. Si noti che il PRP senza lisi piastrinica non supporta adeguatamente la migrazione delle MSC.
Vedi anche il protocollo JoVE di Andreas Reish, che descrive l'uso di PHPL privo di frammenti per l'isolamento e la coltura di MSC derivati da sangue del cordone ombelicale umano. Ti abbiamo appena mostrato come preparare il PHPL per sostituire completamente il siero animale nelle tue colture di cellule staminali. Quando esegui questa procedura, è importante ricordare di rimuovere i frammenti piastrinici prima di aggiungere eparina e PHPL al mezzo di coltura.
Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
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Panoramica
Questo protocollo descrive la preparazione del lisato piastrinico umano (HPL) a partire dal plasma ricco di piastrine (PRP). Il processo prevede cicli di congelamento-scongelamento per lisare le piastrine e produrre un lisato privo di frammenti piastrinici, ricco di fattori di crescita, da utilizzare come integrazione nella coltura cellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Coltura cellulare
- Biologia delle piastrine
- Ricerca sui fattori di crescita
Sfondo
- Il lisato piastrinico umano è un integratore potente nella coltura cellulare.
- Contiene diversi fattori di crescita essenziali per la proliferazione e la differenziazione cellulare.
- Il processo di preparazione è fondamentale per garantire la qualità e l'efficacia del lisato.
- Il plasma ricco di piastrine costituisce il materiale di partenza per la preparazione dell'HPL.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo dettagliato per la preparazione del lisato piastrinico umano.
- Garantire l'eliminazione dei frammenti piastrinici per ottenere un lisato più puro.
- Facilitare l'utilizzo del lisato piastrinico umano (HPL) in varie applicazioni di coltura cellulare.
Metodi Utilizzati
- A partire dal plasma ricco di piastrine (PRP).
- Eseguire cicli di congelamento-scongelamento per lisare le piastrine.
- Preparazione del lisato piastrinico umano in pool (PHPL).
- Centrifugazione per rimuovere i frammenti piastrinici dal sopranatante.
Risultati principali
- Preparazione con successo di un ampio pool di lisato piastrinico umano.
- Deplezione dei frammenti piastrinici ottenuta mediante centrifugazione.
- Resa di circa tre litri di fattori di crescita derivati dalle piastrine.
- Preparazione adatta per l'integrazione nelle colture cellulari.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un metodo affidabile per la preparazione del lisato piastrinico umano.
- Il LPU può migliorare significativamente i risultati della coltura cellulare.
- Ulteriori studi possono esplorare le applicazioni del LPU in diversi campi di ricerca.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
I sistemi di coltura privi di siero animale sono fondamentali per promuovere le terapie con cellule staminali verso la traduzione clinica e il rispetto delle normative. Questo protocollo consente la produzione scalabile di lisato piastrinico umano (pHPL) come supplemento definito e privo di componenti xenogene, che favorisce la proliferazione delle cellule stromali mesenchimali e la propagazione delle cellule progenitrici endoteliali. Standardizzando la lisi piastrinica e l'eliminazione dei frammenti, riduce la variabilità tra lotti e migliora la riproducibilità nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta e preclinica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Fornisce un supplemento definito di origine umana che supporta studi meccanicistici delle vie di proliferazione e differenziazione delle cellule staminali.
- Valore operativo: Permette condizioni di coltura costanti tra esperimenti, riducendo la variabilità nei saggi di validazione degli obiettivi.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce un mezzo standardizzato, ricco di fattori di crescita, che supporta letture affidabili nei saggi funzionali sulle cellule staminali.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione dei saggi mediante un lisato privo di frammenti, riducendo al minimo le interferenze derivanti dagli aggregati piastrinici nelle piattaforme di screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Favorisce l'espansione di cellule staminali rilevanti per le malattie in condizioni prive di componenti xenogeni, in linea con i requisiti per biomarcatori traslazionali e modelli preclinici.
- Valore operativo: Consente una produzione scalabile a partire da fonti di donatori raggruppati, supportando il trasferimento tecnologico e lo sviluppo di processi vicini ai criteri GMP.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta fornendo un supplemento privo di siero per la coltura di cellule staminali, dall'iniziale validazione dell'obiettivo fino all'espansione preclinica, sostenendo l'identificazione dei composti promettenti e la riduzione del rischio meccanicistico.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla proliferazione e differenziazione delle cellule staminali fornendo un microambiente costante e definito.
- Screening: Permette test riproducibili di composti o condizioni in saggi basati su cellule staminali grazie a un lisato standardizzato e privo di frammenti.
- Analisi: Fornisce risultati quantificabili come i tassi di proliferazione cellulare e l'efficienza delle unità formanti colonie, consentendo analisi comparative tra diverse condizioni di coltura.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta al lavoro preclinico supportando l'espansione di cellule stromali mesenchimali e progenitrici endoteliali in condizioni clinicamente rilevanti e prive di componenti animali.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un processo riutilizzabile e scalabile per generare un supplemento di grado clinico a partire da plasma ricco di piastrine ottenuto abitualmente, riducendo la dipendenza da sieri animali variabili.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nei risultati della coltura di cellule staminali eliminando componenti sierici animali non definiti e standardizzando il rilascio di fattori di crescita.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità attraverso l'elaborazione di donatori in pool e passaggi standardizzati di congelamento-scongelamento e centrifugazione.
- Valore strategico: Riduce il rischio biologico nello sviluppo di terapie cellulari fornendo un'alternativa di origine umana, priva di componenti xenogeni, al siero fetale bovino.
- Impatto sul portafoglio: Supporta decisioni di avanzamento proporzionate al rischio consentendo la generazione di dati preclinici coerenti in sistemi di coltura definiti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di coltura cellulare sterile, nella manipolazione delle piastrine e nei protocolli di centrifugazione.
- Presuppone l'accesso al plasma ricco di piastrine proveniente da banche del sangue autorizzate o da servizi di trasfusione e l'uso di attrezzature sterili per saldatura o sigillatura per la manipolazione dei sacchetti.
- Necessita di test standardizzati di sterilità sul PRP in ingresso e sul lisato in pool prima e dopo la lavorazione, al fine di garantire la sicurezza della coltura.
- Richiede l'adattamento dei protocolli di coltura per tenere conto delle concentrazioni di fattori di crescita specifiche per ogni lotto, nonostante la strategia di pooling.
- È limitato dalla necessità di sottoporre il campione a numerosi cicli di congelamento-scongelamento e a ripetute centrifugazioni, che aumentano i tempi di lavorazione e richiedono attrezzature specializzate.
