Name: Isolamento e di espansione su vasta scala di umano adulto cellule progenitrici endoteliali che formano colonie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-28T07:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Scopri un metodo senza siero animale per isolare e espandere cellule progenitrici endoteliali che formano colonie (ECFC) dal sangue periferico umano adulto. Questo protocollo utilizza lisato piastrinico umano poolato per ridurre i rischi di immunizzazione.

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Gli autori ringraziano il Dott. Katharina Schallmoser per la fornitura di pHPL e Margaretha Frühwirth e Daniela Thaler per un&#39;eccellente assistenza tecnica.

A.) ECFC ISOLATON GIORNO 1: <ol><li> Prima di iniziare con l&#39;esperimento preparare la cultura della crescita delle cellule endoteliali medio a medio-2 (EGM-2). Supplemento 500ml endoteliale basale medio-2 con eparina (1 ml di 1000 U / ml), 5 ml soluzione 100x di penicillina / streptomicina (tutti Sigma, St. Louis, MO, <a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a> ), L-glutamina (concentrazione 2 mM finale ), e 50 ml pool lisato piastrinico umano (pHPL). Quindi aggiungere 0,2 ml di idrocortisone, 2 ml hFGF-B, 0,5 ml di VEGF, EGF 0,5 ml, 0,5 ml di IGF-1 e 0,5 ml di acido ascorbico (fornito come SingleQuots, tutti Lonza, Walkersville, MD; <a href="http://www.lonzabioscience.com/">http://www.lonzabioscience. com /</a> ). Sterile filtrato del mezzo attraverso un m-pori 0,2 dimensioni 500 ml vuoto filtro Millipore. Dal pHPL forme coaguli piccoli potrebbe essere necessario due filtri per un mezzo. Preriscaldare filtrata EGM-2 a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua </li><li> Raccogliere i campioni di sangue da disegno 5 ml di sangue periferico umano adulto dalla vena cubitale in una 6ml senza conservanti sodio-eparina tubo sangue vacutainer. Si dovrebbe trattare i campioni di sangue entro un massimo di due ore. </li><li> Iniziate preparando una compressa da 75 cm 2 (T75; Costar) recipiente con un tappo di sfiato, pipetta da 25 ml e due 5 pipette ml in un banco a flusso laminare. </li><li> Pre-compilati 15 ml preriscaldata integrato EGM-2 nel pallone con la pipetta da 25 ml. Ora aprite la fiala di sangue e campioni tutti e 5 ml con la pipetta 5 ml nel pallone. Sciacquare la fiala vuota di sangue con 5 ml di ulteriori EGM-2 con la seconda pipetta da 5 ml. Il volume totale entro il T75 è di 25 ml. Chiudere il ventilato-cap del pallone e mettere in termostato a 37 ° C, 5% CO 2 e il 95% di umidità per 24 ore. </li></ol> 2 ° GIORNO: <ol><li> Dopo circa 24 ore (durante la notte) è necessario rimuovere il medio impasto sangue per liberarsi di cellule non aderenti. Per questo preparare due pipette 25 ml e tre 5 pipette ml nel flusso laminare, pre-riscaldare 20 ml di integrare EGM-2 (preparato il giorno precedente) e 30 ml di PBS a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Rimuovere il pallone con il campione dal termostato e rimuovere tutti i surnatante con una pipetta 25 ml. Fare attenzione a non graffiare la superficie pallone evitare di danneggiare qualsiasi potenziale colonia. Lavare la superficie interna delle cellule fiasco aderenza tre volte con delicatezza l&#39;aggiunta di 10 ml di pre-riscaldato PBS e inclinando il pallone da un lato all&#39;altro. Rimuovere la PBS immediatamente ogni volta e scartare. </li><li> Aggiungere 20 ml di fresca pre-riscaldato EGM-2 al pallone e rimetterlo a dell&#39;incubatore. Questo processo deve essere eseguita il più veloce e gentile possibile, per le cellule collegate non a staccarsi. ECFCs staccare facilmente se sono tenuti in PBS o a temperatura ambiente per lungo. </li><li> Schermo attraverso il pallone sistematicamente ogni due giorni a partire da due giorni con un basso ingrandimento di un microscopio ottico in cerca di escrescenza ECFC. Quando una colonia si trova segno sulla parte superiore sul lato esterno del pallone che indica la posizione della colonia. Si noti che il flaks non dovrebbe essere al di fuori dell&#39;incubatore per più di 5 minuti. </li></ol> GIORNO 5: <ol><li> Il quinto giorno dopo la semina effettuare un cambiamento completo di media per rimuovere le cellule non aderenti. A tal fine pre-riscaldare 20 ml di EGM-2 a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua e preparare due pipette 25 ml. </li><li> Rimuovere il terreno completo con una pipetta 25 ml e aggiungere fresco, pre-riscaldata EGM-2 completate, non appena possibile. Le cellule non devono essere lasciati senza prodotto per più di un minuto per evitare l&#39;essiccamento. Mettere nuovamente dentro l&#39;incubatrice e ripetere lo screening del pallone tutti i giorni. </li><li> Nutrire le cellule, sostituendo il 30% dei media da parte fresca integrato EGM-2 volte alla settimana. </li></ol> GIORNO 14-28: <ol><li> Le colonie tipiche con morfologia ciottoli dovrebbe apparire intorno al giorno 12. Segna la parte superiore esterna del pallone ad indicare la posizione di ogni colonia. Lasciare le colonie a crescere fino a 28 giorni a meno che le singole cellule iniziano a staccarsi. Una volta, le colonie principali sono stati identificati possono essere raccolto tra i giorni 14 e 28, a seconda delle loro dimensioni. </li></ol> B.) ECFC VENDEMMIA <ol><li> Preriscaldare 5 ml 0,05% tripsina / EDTA, 20 ml di PBS e 5ml fresca integrato EGM-2. </li><li> Rimuovere completamente medio dal pallone in un tubo Falcon (fare attenzione a non toccare la superficie del pallone per evitare di danneggiare qualsiasi colonia potenziali) e lavare accuratamente le cellule con 10 ml di PBS preriscaldata. </li><li> Aggiungere 5 ml di tripsina / EDTA e incubare per 5 minuti in incubatrice. Le cellule non devono essere esposti a tripsina per più di 7 minuti dal momento che diventa tossica. Accuratamente toccando i lati del pallone aiuta le cellule a staccarsi. Spegnere l&#39;attività della proteasi tripsina con l&#39;aggiunta di circa 10 ml del mezzo utilizzato conservato cultura. </li><li> Rimuovere sospensione cellulare in un 50 ml Falcon tubo. Sciacquare il pallone una volta con 10 ml di PBS, che è successivamente aggiunto alla sospensione cellulare raccolto. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 g per 7 minuti a 4 ° C per raccogliere le cellule e rimuovere la tripsina. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare immediatamente in 1 ml di PBS. Tenere su ghiaccio. </li><li> Determinare il numero di cellule, come descritto in un protocollo di JOVE di R. Ricardo e K. Phelani 5. </li></ol> C.) ECFC ESPANSIONE <ol><li> Supplemento 500 ml EGM-2, come descritto in A 1.1). Pre-riscaldamento a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Per circa 2500 cm 2 di spazio cultura preparare una o 11 T220 (225 cm 2) o 15 T175 (175 cm 2) o uno a quattro strati fabbrica di cellule (CF-4; Nunc, Naperville, Illinois; <a href="http://www.nuncbrand.com/">http://www.nuncbrand . com</a> ). Inoltre avrete bisogno di due nuove sfiato-cap e un imbuto speciale sterile in panchina flusso laminare. </li><li> Per ECFCs seme con una densità di cellule di partenza di 100 c / cm 2 calcolo del numero delle cellule è necessaria. Per una CF-4 252.800 cellule sono risospese in 500 ml di fresca EGM-2 e versato nella CF-4 con l&#39;imbuto sterile. Chiudere uno sfogo con lo sfiato-cap e inclinare il CF-4 da un lato longitudine, consentendo una distribuzione uniforme del mezzo tra tutte e 4 le farine. Poi inclinare la camera posteriore e aprire il coperchio del sfiato-cap. Luogo CF-4 in incubatrice. </li><li> Cambia il 20% della media almeno una volta alla settimana fino CF-4 è confluenti. </li><li> Celle di raccolta, come descritto in B.) utilizzando 70 ml di tripsina / EDTA e circa 200 ml di PBS. </li></ol> RAPPRESENTANTE RISULTATI Usando questo metodo isolamento abbiamo osservato una formazione primaria colonia al giorno 12. In uno studio precedente erano in grado di recuperare una media di 4,0 ± 0,8 ECFC-colonie derivate da ogni ml di sangue periferico. ECFCs 4 ha mostrato un aspetto tipico di ciottoli. Dopo l&#39;espansione su larga scala, con una densità di semina di 100 cellule / cm 2, abbiamo ottenuto&gt; 1 x 10 8 cellule in un totale di circa 30 giorni da 3 maschi e 1 volontari di sesso femminile (età compresa tra i 26 e 50 anni). ECFC colto in queste condizioni hanno dimostrato di essere proliferativa, funzionale e stabile genomicamente. 4 Inoltre cellule possono essere conservate (nel 10% DMSO) in azoto liquido per un ulteriore uso. 3,4

<ol><li>Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+activated+endothelial+cells+in+sickle+cell+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia.</a> N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).</li>
<li>Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li>
<li>Schallmoser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+large-scale+expansion+of+functional+mesenchymal+stem+cells+from+unmanipulated+bone+marrow+without+animal+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum.</a> Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).</li>
<li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+large-scale+expanded+endothelial+colony-forming+cells+function+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo.</a> Blood. , (2009).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+and+Determining+the+Viability+of+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Counting and Determining the Viability of Cultured Cells.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

Questo isolamento romanzo e il metodo di espansione è un processo semplice ed efficiente che è più efficiente e meno che richiede tempo, evitando qualsiasi separazione cellulare (gradiente di densità non necessario) e meno costoso rispetto alle tecniche convenzionali. Usando contatto pHPL agli antigeni della specie bovina e putativo xenoimmunization successivo è esclusa. Durante il periodo di cultura piccoli coaguli si possono formare, causata dal pHPL. Sulla base della nostra esperienza di questi coaguli di non effetto...

<table><tbody><tr><td>Mezzo basale per endoteliali-2</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td>500 ml</td></tr><tr><td>SingleQuots EGM-2</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td>EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, idrocortisone, acido ascorbico</td></tr><tr><td>Eparina senza conservanti</td><td>Biochrom AG</td><td></td><td>10 U/ml per EGM-2</td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>2 mM per EGM-2</td></tr><tr><td>Penicillina e Streptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>100 U/mL di penicillina e&lt;br/&gt;100&amp;#x03BC;g/mL di streptomicina per&lt;br/&gt;EGM-2</td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA 1 mM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>7 ml per fiala T75&lt;br/&gt;70 ml per CF-4</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell factory a quattro strati (CF-4)</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imbuto sterile</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiala da coltura T75cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; (con tappo ventilato)</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubi vacutainer da 6 mL (eparina sodica senza conservanti)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>precaricati con 108 UI/6 ml di&lt;br/&gt;eparina sodica senza conservanti</td></tr><tr><td>Tubi Falcon da 50 ml</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stripette da 5 ml</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stripette da 25 ml</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Squeezer</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro sterile con pori da 0,2</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>2x 500 ml per EGM-2</td></tr></tbody></table>

isolamento e di espansione su vasta scala di umano adulto cellule progenitrici endoteliali che formano colonie

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Questo lavoro introduce una nuova strategia di recupero per le cellule progenitrici endoteliali formanti colonia (ECFCs) da eparinato ma per il resto non manipolata adulto periferici umani all&#39;interno di una media di 12 giorni. Dopo l&#39;espansione su larga scala&gt; 1x10 8 ECFCs può essere ottenuto per ulteriori test. Vantaggiosamente utilizzando pHPL il contatto delle cellule umane con antigeni siero bovino può essere escluso. Mediante citometria di flusso ed immunoistochimica delle cellule isolate può essere caratterizzato come ECFC e la loro funzionalità in vitro per formare strutture di tipo vascolare possono essere testati in un test di Matrigel. Inoltre queste cellule possono essere iniettati per via sottocutanea in un modello murino di forma funzionale, vasi perfusi in vivo. Dopo un lungo periodo di espansione e la proliferazione crioconservazione, la funzione e la stabilità genomica sembrano essere conservati. 3,4 Questo animale-proteina isolamento libero e il metodo di espansione è facilmente applicabile a generare una grande quantità di ECFCs.

Cellule progenitrici endoteliali formanti colonia (ECFCs) sono uno strumento promettente per studiare l&#39;omeostasi vascolare e la riparazione.<sup&gt; 1,2</sup&gt; Questo documento introduce un nuovo metodo di siero animale libero per l&#39;isolamento e l&#39;espansione del ECFC da eparinizzato adulti sangue umano periferico con un pool di lisato piastrinico umano (pHPL) diminuendo il rischio di immunizzazione anti-bovino.

Isolamento e di espansione su vasta scala di umano adulto cellule progenitrici endoteliali che formano colonie

Questo articolo introduce una nuova strategia di recupero per le cellule progenitrici endoteliali capaci di formare colonie (ECFC) da sangue adulto eparinato ma altrimenti non manipolato...

Coltivando semplicemente il sangue totale in un mezzo ottimizzato privo di siero animale. In un fiasco da 75 centimetri quadrati, le E CFC aderiscono alla superficie del fiasco per rimuovere la maggior parte dei globuli rossi e bianchi. Lavare il fiasco al primo giorno ed eliminare le cellule residue cambiando il mezzo totale al quinto giorno.Continuare a esaminare le colonie ogni due giorni, oppure, se più comodo, tre volte alla settimana. Si dovrebbero osservare le prime colonie intorno al giorno 12. Salve, mi chiamo Nicole Hoffman del laboratorio dell'Unità di Ricerca sulle Cellule Staminali dell'Università Medica grots.Oggi vi mostreremo un processo semplificato per l'isolamento e l'amplificazione di cellule progenitrici formanti colonie endoteliali, o ECFC, dal sangue periferico umano adulto. Nel nostro laboratorio, utilizziamo questo processo per studiare la funzione e la biologia delle ECFC in vitro e in vivo. Cominciamo dunque.In questa sezione si inizia con la preparazione e la sterilizzazione per filtrazione del mezzo di crescita per cellule endoteliali due, che verrà utilizzato per la coltura. I CEF preriscaldano 20 millilitri di mezzo in un bagno d'acqua a 37 gradi. Prelieva cinque millilitri di sangue periferico umano adulto dalla vena cubitale in un tubo vacutainer da sei millilitri contenente eparina sodica senza conservanti.I campioni di sangue devono essere processati entro due ore dal prelievo in una cappa a flusso laminare. Utilizzare una fiasca da 75 centimetri quadrati con tappo ventilato, una pipetta da 25 millilitri e due pipette da cinque millilitri in una cappa a flusso laminare. Usare una pipetta da 25 millilitri per riempire preliminarmente la fiasca con 15 millilitri di E GM due supplementato preriscaldato.Aprire il flacone del sangue e utilizzare la pipetta da cinque millilitri per trasferire direttamente tutti e cinque i millilitri di sangue nel matraccio. Utilizzare la pipetta per risciacquare il flacone vuoto del sangue con i rimanenti cinque millilitri di pre-war E GM due. Aggiungere questo volume al matraccio.Chiudere il tappo forato del matraccio, che ora dovrebbe contenere 25 millilitri. Posizionare il matraccio in un incubatore impostato a 37 gradi, 5% di anidride carbonica e 95% di umidità per 24 ore. Il giorno successivo preriscaldare 20 millilitri di e GM due integrato e 30 millilitri di PBS in un bagno d'acqua a 37 gradi e disporre 2 pipette da 25 millilitri e tre pipette da 10 millilitri in una cappa a flusso laminare.Rimuovere il matraccio contenente il campione dall'incubatore e utilizzare una pipetta da 25 millilitri per rimuovere la miscela di sangue e mezzo che contiene le cellule non aderenti. Prestare attenzione a non graffiare la superficie del matraccio con la pipetta. Per evitare di staccare le cellule aderenti, aggiungere delicatamente 10 millilitri di PBS preriscaldato sulla superficie interna del matraccio dove le cellule sono aderenti, quindi inclinare il matraccio da un lato all'altro.Rimuovere immediatamente e scartare il PBS. Ripetere questa operazione, eseguendo due lavaggi. Successivamente, procedere rapidamente e con delicatezza.Per evitare il distacco delle cellule, aggiungere 20 millilitri di EGM-2 fresco preriscaldato al flacone e riposizionarlo nell'incubatore. Avendo cura di non tenere il flacone fuori dall'incubatore per più di cinque minuti, utilizzare un microscopio ottico a basso ingrandimento per controllare ogni due giorni la fuoriuscita di ECFC dal flacone. A partire dal secondo giorno fino al quinto giorno dopo la semina, preriscaldare 20 millilitri di EGM-2 in un bagno d'acqua a 37 gradi e preparare 2 pipette da 25 millilitri.Lavorare rapidamente per evitare che il campione si secchi. Utilizzare questi materiali per sostituire il mezzo con e GM due fresco, pre-riscaldato e supplementato, che rimuoverà le cellule non aderenti. Riposizionare la fiala nell'incubatore e ripetere il processo di screening ogni giorno.Sostituire il 30% del mezzo con EGM appena integrato, due volte alla settimana. Tipiche colonie con morfologia a selciato dovrebbero apparire intorno al giorno 12.Segnare il lato esterno superiore del pallone per indicare la posizione di ciascuna colonia. Lasciare crescere le colonie fino al giorno 28, a meno che le singole cellule non inizino a staccarsi. Una volta identificate le colonie primarie, possono essere raccolte tra il giorno 14 e il giorno 28 a seconda delle dimensioni.Riscaldare in anticipo cinque millilitri di una soluzione di tripsina EDTA e 20 millilitri di PBS a 37 gradi. Senza toccare la superficie della fiala, trasferire tutto il mezzo in un tubo falcon. Questo verrà utilizzato successivamente per inibire l'attività della tripsina e lavare con attenzione le cellule con 10 millilitri di PBS preriscaldato.Aggiungere cinque millilitri di tripsina EDTA e incubare la soluzione per circa cinque minuti a 37 gradi oppure fino al distacco delle cellule. Prestare attenzione a non incubare per più di sette minuti, poiché la tripsina può diventare tossica per le cellule dopo l'incubazione; battere leggermente sui lati del fiasco per favorire il distacco delle cellule al termine della reazione. Inibire l'attività della proteasi tripsina aggiungendo circa 10 millilitri del mezzo di coltura usato conservato.Trasferire la sospensione cellulare in un tubo falcon da 50 millilitri. Lavare il fiasco una volta con 10 millilitri di PBS e aggiungere la soluzione di lavaggio alla sospensione cellulare raccolta. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 ×g per sette minuti in una centrifuga refrigerata per raccogliere le cellule e rimuovere la tripsina, scartare il soprannatante e risospendere immediatamente il pellet cellulare in un millilitro di PBS.Mantenere le cellule risospese sul ghiaccio. Determinare il numero di cellule come descritto in un altro protocollo di JoVE di Ricardo e Phelan. Procedere quindi all'espansione delle ECFC.Nel caso in cui vengano recuperate più di 360.000 E CFC, procedere al passaggio di espansione; qualora vengano recuperate meno di 260.000 e CFC, si consiglia di espandere ulteriormente le cellule prima dell'espansione su larga scala. A tale scopo, seminare circa 75.000 EFC in 20 millilitri di E GM due in un’area di coltura cellulare da 75 centimetri quadrati e coltivare per un’altra settimana o fino al raggiungimento della confluenza.Integrare 500 millilitri di E GM due come descritto nel protocollo scritto allegato e preriscaldare questa miscela in un bagno a 37 gradi. Per ogni circa 2.500 centimetri quadrati di spazio di coltura, preparare un cell factory a quattro strati o CA quattro. Inoltre, raccogliere due tappi Tyvek nuovi e un’apposita imbuto sterile e conservarli all’interno della cappa a flusso laminare per seminare le E CFC a una densità cellulare iniziale di 100 cellule per centimetro quadrato.Per prima cosa, calcolare il numero di cellule per ciascun CF4 da 250,2 a 800. Le cellule vengono risospese in 500 millilitri di EGM-2 fresco e versate nel CF4. Utilizzando un imbuto sterile, usare il tappo Tyvek coperto per chiudere un'apertura e inclinare il CF4 su un lato longitudinale per consentire una distribuzione uniforme del mezzo tra tutti e quattro i livelli.Ora la camera può essere inclinata all'indietro e il coperchio del tappo Tyvek può essere aperto. Assicurarsi di proteggere le aperture con due tappi rossi. Questi tappi possono essere acquistati insieme al CF four durante il trasporto verso l'incubatrice.Posizionare la CF four nell'incubatore e rimuovere i tappi rossi per consentire lo scambio gassoso; sostituire il 20% del mezzo con mezzo preriscaldato almeno una volta alla settimana fino a quando la CF four non diventa confluenti. Questo processo dipende dal donatore ed è probabile che si verifichi dopo 10-14 giorni. Infine, le cellule possono essere raccolte come descritto in precedenza utilizzando Tripsina EDTA preriscaldata e il mezzo usato per inibire l'attività della proteasi.Inoltre, utilizzare circa 200 millilitri di PVS per il lavaggio intorno al giorno 12. Le colonie di ECFC inizieranno ad apparire con una tipica morfologia a selciato, come si può osservare in questa colonia, oppure come poche cellule raggruppate, come in questa colonia individuata al giorno 12. Man mano che le colonie crescono, un numero maggiore di cellule assume la tipica morfologia a selciato.Come si può vedere qui, dopo 15 giorni e dopo 18 giorni mediante immunoistochimica, le CFC isolate possono essere caratterizzate con marcatori tipici della superficie cellulare endoteliale come CD146, CD144, CD31 positivi e fattore di von Willebrand. Vi abbiamo appena mostrato come isolare ed espandere cellule progenitrici formanti colonie endoteliali dal sangue periferico umano adulto durante l'esecuzione di questa procedura. È importante ricordare che il tasso di successo di questo protocollo dipende dal donatore e varia dal 50 al 70%. Ecco tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Caratterizzazione fenotipica e funzionale delle cellule endoteliali Colony Forming derivato dal sangue del cordone ombelicale umano

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Segnaliamo un metodo affidabile per isolare e coltivare cellule endoteliali primarie specifiche per il tumore da modelli murini geneticamente modificati.

Isolamento e cultura espansione delle cellule endoteliali tumore-specifici

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L&#39;isolamento di cellule progenitrici endoteliali da volontari sani e il loro potenziale migratori influenzato dal siero campioni dopo cardiochirurgia

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Cellule endoteliali tumorali sono fattori determinanti importanti del microambiente tumorale e il decorso della malattia. Qui, un protocollo per l'isolamento di cellule endoteliali pure e praticabile da carcinoma colorettale umano e colon normale a essere impiegata nella ricerca di droga test e la patogenesi è descritto.

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Qui, presentiamo un protocollo per formare con precisione l'endotelio emogenico dalle cellule staminali pluripotenti umane in una condizione senza alimentatore e xeno. Questo metodo avrà ampie applicazioni nella modellazione della malattia e nello screening per i composti terapeutici.

Differenziazione dell'endotelio endogenico dalle cellule staminali pluripotenti umane in una condizione definita senza alimentatore e Xeno

Il sistema di analisi dell'angiogenesi sferoide di co-cultura tridimensionale è progettato per imitare l'angiogenesi fisiologica. Gli sferoidi della co-coltura sono formati da due precursori di cellule vascolari umane, ECFC e MSC, e incorporati nel gel di collagene. Il nuovo sistema è efficace per valutare i modulatori angiogenici e fornisce informazioni più rilevanti allo studio in vivo.

Sistema di analisi dell'angiogenesi tridimensionale utilizzando Gli spheroidi co-culturali formati da cellule formanti colonia endoteliale e cellule staminali mesenchiche

Presentato qui è un semplice protocollo per la differenziazione diretta delle cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane in circa 1 settimana.

Differenziazione diretta di cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane

Scopri un metodo senza siero animale per isolare e espandere cellule progenitrici endoteliali che formano colonie (ECFC) dal sangue periferico umano adulto. Questo protocollo utilizza lisato piastrinico umano poolato per ridurre i rischi di immunizzazione.

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