Isolamento e di espansione degli animali siero gratuito di cordone ombelicale umano derivato cellule stromali mesenchimali (MSC) e cellule endoteliali progenitrici formanti colonia (ECFCs)

Questo protocollo descrive l'isolamento e la successiva espansione delle cellule stromali mesenchimali e le cellule endoteliali che formano colonie senza l'uso di siero animale per generare le coppie a fini di trapianto autologo sperimentali.

Il cordone ombelicale umano è una fonte facilmente accessibile di cellule progenitrici. In questo articolo, descriviamo un protocollo per l'isolamento e la successiva espansione dei progenitori endoteliali e CFCs, una sottopopolazione di cellule all'interno della parete del vaso e cellule progenitrici mesenchimali. MSC derivate da un singolo cordone ombelicale umano.

Per prima cosa usando le forbici longitudinalmente, tagliare lungo la vena ombelicale umana e raschiare le cellule dalla superficie interna del vaso. Trasferisci le cellule dal raschietto in un pallone e attendi la crescita della colonia. Alcune delle cellule raschiate mostreranno un fenotipo progenitore e prolifereranno pesantemente fino a formare grandi colonie.

Una volta che queste cellule sono proliferate, i CFC possono essere espansi in nuovi flaconi. Per ulteriori analisi, una popolazione di cellule mesenchimali può anche essere isolata dal cordone ombelicale umano. Tagliare parti del cordone in piccoli pezzi e trasferirli su una piastra di coltura sterile.

Dopo alcuni giorni, la crescita delle cellule stromali sarà visibile attorno ai pezzi di tessuto del cordone intervascolare. Trasferisci queste cellule in nuovi palloni ed espandile per ulteriori analisi. Questo protocollo consente di ottenere due tipi di lignaggi di cellule progenitrici da un singolo cordone di materiale di partenza entro tre o quattro settimane.

Ciao, sono Andreas Danish del laboratorio del Dr.T Strong in un'unità di ricerca sulle cellule staminali presso l'Università di Medicina di Grads in Austria. Oggi vi mostreremo una procedura per l'isolamento, l'espansione e l'analisi di cellule mesenchimali ed endoteliali umane a partire da un unico codice ombelicale. Solo una nota sulla terminologia.

Le nostre cellule sono chiamate cellule stromali mesenchimali multipotenti, o MSE e cellule pro formanti colon endoteliale o CSCs. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la funzione e la biologia delle cellule progenitrici non ematiche. Quindi iniziamo.

Prima delle fasi di isolamento cellulare, pulire la cappa di coltura tissutale a flusso laminare con inadina e raccogliere piastre di coltura cellulare sterili. Fiasche per colture cellulari, strumenti chirurgici sterilizzati con PBS, raschietti per cellule, un portatubi, strisce da 25 millilitri per animali domestici e una siringa da cinque millilitri dotata di un ago con estremità smussata. Ricordarsi di preriscaldare il terreno di coltura cellulare alfa MEM ed EGM two in un bagno d'acqua a 37 gradi.

Ora trasferisci il cordone ombelicale nel flusso laminare e lavalo due volte in PBS. Per rimuovere il sangue contaminante, utilizzare una siringa sterile da cinque millilitri per incannulare la vena del cordone ombelicale su un lato. Ora sciacquare la vena ombelicale con PBS fino a quando il liquido non fuoriesce.

L'altra estremità del cavo diventa completamente trasparente senza tinta rossa. Iniziare l'isolamento delle cellule progenitrici formanti colonie endoteliali riempiendo un pallone di 75 centimetri quadrati con 15-20 millilitri di terreno preriscaldato EGM two. Posiziona il cordone in una nuova piastra riempita con PBS sterile e usa le forbici chirurgiche per tagliare il cordone in due pezzi lunghi ciascuno circa cinque centimetri.

Ora inserisci una lama delle forbici chirurgiche e taglia la vena longitudinalmente. A questo punto, un assistente può usare una pinza per trattenere la vena mentre vengono eseguiti ulteriori tagli. Posizionare il cordone con la vena aperta in una nuova piastra.

Senza PBS, utilizzare un raschietto cellulare per strofinare la superficie interna della vena su un'area di almeno un centimetro. Lavare il raschietto nel terreno EGM two per rilasciare le cellule del vaso strofinate nel pallone. Questa procedura dovrà essere ripetuta fino a 10 volte.

Chiudere il pallone e metterlo in un'incubatrice impostata a 37 gradi, 5% di anidride carbonica e 95% di umidità. Ora che gli e CFC sono stati isolati, passiamo alle MSC. Ora che lo strato endoteliale è stato raschiato via, usa un bisturi sterile per tagliare il cordone in pezzi molto piccoli.

Da uno a due millimetri. Massimo utilizzo di pinze sterili per trasferire questi pezzi in una piastra di coltura pre-etichettata. Lasciare la piastra aperta per almeno cinque minuti prima di riempirla con del terreno per permettere ai pezzi di aderire alla superficie di plastica.

Utilizzando la velocità più bassa possibile, aggiungere delicatamente da 30 a 35 millilitri di MEM alfa modificato preriscaldato. Chiudere il piatto e metterlo in un'incubatrice impostata a 37 gradi con il 5% di anidride carbonica e il 95% di umidità. La crescita delle cellule stromali mesenchimali dai pezzi del cordone ombelicale richiederà da tre a sette giorni, dopodiché le cellule possono essere espanse.

Nel frattempo, ECFC può essere espanso, come si vedrà nel passaggio successivo. Il giorno successivo, usa un microscopio invertito per esaminare le cellule. Se la procedura di raschiamento è stata eseguita correttamente, i primi cluster di cellule proliferanti saranno completamente visibili.

Sostituire il mezzo E GM two per rimuovere tutte le cellule e le particelle non attaccate. Continua a espandere le celle e a scambiare un terzo del terreno due volte a settimana. Dopo 10-12 giorni, si osserveranno regolarmente colonie endoteliali molto grandi.

Ora, rimuovere il terreno e lavare con PBS per eliminare l'uso rimanente di proteine. 0,05% tripsina 0,7 millimolare EDTA per staccare le cellule. Quando si trasferiscono le cellule in nuovi recipienti di coltura, assicurarsi di scegliere palloni di dimensioni adeguate per ottenere una bassa densità di semina.

Ciò contribuirà a un'ulteriore espansione. Il nostro laboratorio di solito ritira la progenie da più di 20 grandi colonie in quattro fiasche da duecentoventicinque centimetri quadrati. Non dimenticare di sostituire un terzo del terreno due volte a settimana.

Un protocollo simile viene utilizzato per l'espansione MSC nella sezione successiva. Una volta trascorsi da tre a sette giorni, utilizzare un microscopio invertito per verificare la comparsa di cellule a forma di fuso vicino al tessuto attaccato. Quando c'è una crescita cellulare sufficiente, i pezzi tendono ad attaccarsi perdendo il contatto con la plastica.

Dopo 10-12 giorni, rimuovere i pezzi di tessuto. Staccare le MSC dalla plastica utilizzando una soluzione di tripsina EDTA e trasferire le cellule in nuovi palloni di coltura preriempiti di terreno di dimensioni e numero appropriati per garantire una bassa densità di semina durante l'espansione cellulare. Sarà necessario sostituire un terzo del terreno due volte alla settimana una volta che entrambi i tipi di cellule saranno stati espansi.

La colorazione seguita dalla citometria a flusso può essere eseguita per rilevare l'espressione di marcatori di superficie cellulare indicativi di fenotipi progenitori e determinare che non vi è contaminazione con cellule ematopoietiche. Seminare i CFC raccolti puri a una densità di placcatura molto bassa di tre o 10 cellule per centimetro quadrato in piastre di coltura cellulare per garantire la crescita di una singola colonia: scambiare un terzo del terreno due volte a settimana dopo 14 giorni. La fine della cultura.

Rimuovere il mezzo. Lavare due volte con PBS e fissare le colonie con una soluzione di fissazione ghiacciata Per 15 minuti in frigorifero, scartare la soluzione di fissaggio e lasciare le piastre aperte ad asciugare per 10 minuti. Reidratare le cellule con acqua distillata per 10 minuti.

Aggiungere la soluzione di ematina di Harris e colorare le colonie fisse per 12 minuti. Rimuovere la soluzione di ematina e sciacquare le piastre con acqua di rubinetto. Per eliminare la soluzione colorante rimanente.

Scatta foto di ogni colonia utilizzando uno stereomicroscopio e importa file in formato jpeg o TIFF sul tuo computer. Apri le foto con il software di immagine J e analizza il numero esatto di cellule di ogni colonia come descritto nell'animazione seguente. Aprire il software J image e importare l'immagine di una colonia utilizzando la funzione di apertura del file nel menu a discesa.

Procedi utilizzando il processo. Sottrai la funzione di sfondo. Utilizzare la funzione di selezione ellittica o pennello nel menu immagine J per contrassegnare il margine della colonia.

Cancella l'immagine circostante utilizzando la funzione di modifica cancella esterno e ritaglia l'immagine selezionando il ritaglio dell'immagine. Regolare manualmente la soglia utilizzando la funzione di regolazione della soglia dell'immagine in modo che tutte le celle siano completamente colorate. Rosso. Conta il numero di celle della colonia selezionando.

Analizzare, analizzare le particelle. Scegliere le impostazioni appropriate ottimizzate per ogni tipo di cella e selezionare OK Se eseguito correttamente. Questo protocollo consente l'isolamento di una popolazione praticamente pura di cellule che condividono le caratteristiche delle cellule progenitrici endoteliali e mesenchimali umane, che sono autologhe tra loro perché derivate dallo stesso cordone.

A partire dal quinto giorno, le cellule mesenchimali a forma di fuso appariranno da sotto il pezzo del cordone attaccato alla piastra di coltura. Dopo uno o due giorni, i primi gruppi di cellule progenitrici o ed eCFC diventano visibili al microscopio invertito. Questa enorme colonia di e CFC in rapida crescita si è formata dopo 11 giorni.

Sia le MSC che le E CFC possono essere approvate e ulteriormente ampliate. Si consiglia un'analisi successiva di tutti i prodotti di coltura utilizzando la citometria a flusso per confermare il fenotipo appropriato. Ricorda che sia la linea endoteliale che quella mesenchimica reagiscono agli anticorpi specifici per CD 73, CD 1 46, CD 29 e CD 1 0 5.

Si noti che le MSC esprimevano quello della coscia, che è stato rilevato utilizzando un anticorpo anti CD 90. I CFC E sono positivi per CD 31, che è anche chiamata molecola di adesione delle cellule endoteliali piastriniche o pcam. È ben noto che l'espressione dell'immunoreattività di CD 34 nel cordone ombelicale da parte degli E CFC può essere ridotta attraverso colture ripetute.

I marcatori delle cellule del sangue come CD 45, H-L-A-D-R e CD 14 sono rimasti negativi per entrambi i tipi di cellule. La gerarchia delle cellule progenitrici tra i CFC E può essere valutata utilizzando il software Image J contando il numero accurato di cellule di ogni singola colonia. Abbiamo appena mostrato come isolare, espandere e analizzare mazze ed ECE da un codice ombelicale umano durante l'esecuzione di questa procedura.

È importante lavorare in condizioni sterili e verificare il fenotipo e la purezza prima di utilizzare le cellule negli studi successivi. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.