Assemblaggio, carico, allineamento e di una cella analitica del campione Ultracentrifuga
5 novembre 2009
Il ultracentrifuga analitica (AUC) delle cellule del campione tiene campione e tampone di riferimento e durante gli esperimenti, ed è esposto a alto vuoto e velocità del rotore fino a 60.000 giri al minuto. Questo video dimostra l'attenzione rigorosa ai dettagli necessari per l'assemblaggio, il caricamento e l'allineamento di questa componente molto importante di un esperimento AUC.
Ciao, sono Andrea Balbo. Lavoro nel gruppo di Peter Shucks presso il National Institutes of Health. In questo video, vi mostreremo le nostre procedure per l'assemblaggio, il caricamento e l'allineamento del rotore di una cella campione per ultracentrifuga analitica.
Iniziamo. Raccolto. Ecco i componenti di una cella campione per ultracentrifuga analitica All'interno dell'alloggiamento della cella è impilato un campo di carbone a doppio settore da 12 millimetri, il fulcro dell'epone che sarà inserito tra due gruppi di finestre. Ogni gruppo finestra è costituito da una guarnizione della finestra, un rivestimento della finestra e una finestra tenuta all'interno del supporto della finestra.
Questi pezzi verranno quindi fatti scorrere verso il basso all'interno dell'alloggiamento della cella allineando le loro sedi delle chiavette con la chiave che si trova all'interno del cilindro dell'alloggiamento, una guarnizione dell'alloggiamento e quindi un anello a vite ha chiuso la cella del campione con una pressione di coppia compresa tra 120 e 140 pollici libbre. Dopo aver caricato il campione in riferimento, due guarnizioni del tappo dell'alloggiamento e un tappo dell'alloggiamento sigillano i fori di caricamento della cella per evitare artefatti di scansione, perdite e rotture durante gli esperimenti, è fondamentale che tutti i componenti siano puliti, asciutti, privi di polvere, privi di polvere e nelle migliori condizioni possibili, esaminati spesso e sostituiti quando necessario. Avrai anche bisogno di quanto segue, un'ultracentrifuga analitica, un rotore a quattro fori in titanio, una bilancia da laboratorio, una chiave dinamometrica con quadrante leggibile e un supporto dinamometrico, un contrappeso e pesi di contrappeso, un cacciavite a testa piatta, un paio di pinze, un pipettatore da 200 microlitri dotato di una punta per pipetta lunga e conica, strumenti di allineamento e lubrificante per spin coat.
Iniziamo la costruzione della cella campione mettendo insieme due gruppi di finestre. Per prima cosa posizionare una guarnizione della finestra nella parte inferiore del supporto della finestra. Quindi posiziona il rivestimento della finestra, o talvolta viene chiamato cuscino per finestra, all'interno del supporto della finestra in modo che l'apertura del rivestimento sia opposta alla sede della chiavetta del supporto con una leggera angolazione.
Quindi posizionare la finestra nel supporto, allineando il segno di graffio sulla finestra con la sede della chiavetta del supporto della finestra. Premere delicatamente sui bordi su entrambi i lati della finestra. Per garantire una corretta tenuta e un twerking accurato della cella del campione, rivestiamo leggermente la guarnizione dell'alloggiamento nell'anello della vite.
Con il lubrificante spin coat, stendere una piccolissima quantità di spin coat tra il pollice e l'indice. Rivestire le filettature dell'anello a vite con un sottile film invisibile di spin coat. Allo stesso modo rivestire la guarnizione dell'alloggiamento.
Rimuovere il lubrificante visibile. Per iniziare l'assemblaggio della cella del campione. Far scorrere un gruppo finestra con la finestra rivolta verso l'alto verso di sé nell'alloggiamento della cella allineando la sede della chiavetta con la chiave dell'alloggiamento.
Allineare la scanalatura centrale con la chiave dell'alloggiamento e lasciarla cadere delicatamente sopra il gruppo finestra all'interno dell'alloggiamento. Non utilizzare mai alcun tipo di strumento per spingere il pezzo centrale nell'alloggiamento della cella. Ciò potrebbe causare danni permanenti al pezzo centrale con conseguenti esperimenti di conservazione delle perdite.
Ruotare il secondo gruppo finestra in modo che la finestra sia rivolta verso il pezzo centrale e lontano da sé. Allineare la scanalatura con la chiave dell'alloggiamento e farla scorrere verso il basso sopra il centrotavola. Posizionare la guarnizione dell'alloggiamento sulla parte superiore.
Quindi un anello a vite in modo che la parola sia visibile. Usando le dita. Quindi uno strumento di allineamento, serrare a mano l'anello a vite.
A volte il centrotavola non scivola facilmente nel cilindro dell'alloggiamento. È possibile prima allinearlo, quindi posizionare il secondo gruppo finestra sopra di esso. Applicando una leggera pressione verso il basso sul gruppo finestra.
È possibile far scorrere entrambi contemporaneamente nell'alloggiamento della cella. In questo modo, evitiamo di premere direttamente sul centrotavola. Ora è un buon momento per cercare polvere, lanugine e impronte digitali.
Noterai anche gli anelli di Newton che indicano che c'è ancora aria tra il centrotavola e le finestre. Questi scompariranno dopo il serraggio con l'anello della vite sollevato e la parola visibile. Posizionare la cella del campione fino in fondo all'interno della cella.
Pinza di coppia del supporto di coppia. Tenere la cella in posizione applicando una pressione costante sull'impugnatura del supporto di coppia. Con un movimento continuo, serrare l'anello della vite a una velocità compresa tra 120 e 140 pollici per libbra.
Rilasciare l'impugnatura del supporto di coppia e rimuovere con cautela la cella del campione. Carichiamo abitualmente un volume di 400 microlitri in ogni settore del centrotavola da 12 millimetri. Utilizzando una pipetta da 200 microlitri, posizionare la cella del campione con i fori di caricamento sulla parte superiore e la parola sull'anello della vite visibile.
Far scorrere il puntale della pipetta a metà nel settore centrale sinistro attraverso i fori di caricamento ed erogare lentamente 200 microlitri di soluzione di riferimento. Ripetere una volta per un totale di 400 microlitri utilizzando lo stesso puntale della pipetta e la stessa tecnica con attenzione e lentamente. Riempire il settore centrale destro con 400 microlitri di soluzione campione.
È imperativo abbinare il più possibile i volumi delle soluzioni di riferimento e di campionamento. Inserire saldamente il puntale della pipetta sulla pipetta, caricare ed erogare lentamente le soluzioni, evitare di caricare bolle e utilizzare lo stesso puntale per entrambe le soluzioni. Tutto aiuta a mantenere i volumi uguali per sigillare la cella.
Posizionare due guarnizioni rosse del tappo dell'alloggiamento in ciascun foro di caricamento, assicurandosi che siano posizionate con cura tra il pezzo centrale e l'alloggiamento in alluminio. Coprire ogni foro di caricamento con un tappo dell'alloggiamento e serrare a mano con un piccolo cacciavite a testa piatta. Prima di caricare il rotore, assicurarsi che il contrappeso e la cella che si troverà di fronte al contrappeso siano entro 0,5 grammi l'uno dall'altro.
Inizia con un saldo a zero. Innanzitutto, pesare una cella campione che si troverà in posizione opposta al contrappeso. Strappare la bilancia per sottrarre il peso della cella del campione.
Quindi pesare il contrappeso. Qui troviamo che il contrappeso è più leggero di 4,193 grammi rispetto alla cella del campione. Selezionare un contrappeso da quattro grammi e avvitarlo nel foro di fissaggio del contrappeso, assicurandosi che non sporga dall'alto.
Alzare il contrappeso per assicurarsi che il peso finale sia entro 0,5 grammi. Utilizzando un rotore a quattro fori, posizionare il contrappeso in posizione quattro in modo che la freccia bianca sia visibile e punti nella direzione della forza centrifuga. Utilizzando uno strumento di allineamento, assicurarsi che sia completamente all'interno del rotore.
Posizionare la cella campione della bilancia con i tappi dell'alloggiamento rivolti verso il centro del rotore e la parola sull'anello della vite visibile. Ancora una volta, utilizzando uno strumento di allineamento, assicurati che sia completamente all'interno del rotore. Guardando da sotto il rotore.
Allinea l'interno. Tracciare, segnare il segno più vicino al centro del rotore con il segno del tracciatore sul contrappeso Utilizzando uno strumento di allineamento. Allo stesso modo, allineare la cella del campione in posizione due.
Dopo che tutte le celle sono allineate, il rotore è pronto per il posizionamento nella camera della centrifuga.
Panoramica
Questo video dimostra l'assemblaggio, il caricamento e l'allineamento di una cella campione per un'ultracentrifuga analitica (AUC), che è cruciale per gli esperimenti AUC. Si enfatizza una corretta manipolazione e preparazione dei componenti della cella campione per garantire risultati accurati.
Componenti Principali dello Studio
Area della Scienza
- Ultracentrifugazione analitica
- Metodi biofisici
- Tecniche di preparazione del campione
Contesto
- La cella campione AUC è essenziale per condurre esperimenti ad alte velocità del rotore.
- È composta da molteplici componenti che devono essere assemblati con precisione.
- Mantenere la pulizia e il corretto allineamento è fondamentale per evitare artefatti sperimentali.
- Comprendere il processo di assemblaggio è vitale per i ricercatori che utilizzano l'AUC.
Obiettivo dello Studio
- Fornire una guida dettagliata sull'assemblaggio e il caricamento di una cella campione AUC.
- Evidenziare l'importanza di una preparazione meticolosa negli esperimenti AUC.
- Garantire che i ricercatori possano replicare il processo accuratamente.
Metodi Utilizzati
- Assemblaggio di assemblaggi finestra e centripiece nella cella campione.
- Applicazione di coppia per fissare i componenti della cella campione.
- Caricamento di soluzioni di riferimento e campione nella cella.
- Bilanciamento della cella campione con un contrappeso per misure accurate.
Risultati Principali
- L'assemblaggio di successo della cella campione AUC dimostrato nel video.
- Le tecniche di caricamento corrette assicurano bolle minime e volumi uguali.
- Gli aggiustamenti del contrappeso sono cruciali per una prestazione accurata del rotore.
- Indicatori visivi, come gli anelli di Newton, aiutano a valutare la qualità dell'assemblaggio.
Conclusioni
- L'attenzione ai dettagli nell'assemblaggio della cella campione è essenziale per gli esperimenti AUC.
- Seguire le procedure delineate può migliorare l'affidabilità sperimentale.
- Si raccomanda una manutenzione e ispezione regolare dei componenti.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Proper assembly and alignment of analytical ultracentrifuge sample cells are critical for generating reliable biophysical data on protein size, shape, purity, and oligomerization states. Meticulous sample cell preparation minimizes experimental artifacts, ensuring data integrity for target validation and mechanistic studies in early drug discovery. This procedural rigor supports predictive confidence in downstream screening and lead optimization workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise determination of protein oligomerization states and protein-protein interactions, directly informing target validation hypotheses.
- Operational Value: Provides label-free, solution-based assessment of macromolecular properties under near-native conditions.
- Predictive Value: Reduces mechanistic ambiguity in target de-risking by delivering quantitative sedimentation coefficients and shape parameters.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers hydrodynamic size and shape data essential for assay buffer formulation and stability screening.
- Operational Value: Ensures sample integrity and monodispersity, critical for reproducible biochemical and cell-based assays.
- Platform Integration: Supports biophysical characterization of purified targets prior to high-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables assessment of protein complex formation and conformational changes relevant to disease mechanisms.
- Operational Value: Supports lot-to-lot consistency checks of recombinant proteins used in preclinical models.
- Translational Continuity: Bridges biophysical target characterization with functional assays in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The analytical ultracentrifuge sample cell workflow integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing biophysical readouts that inform go/no-go decisions based on target behavior and stability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of target oligomerization and interaction networks, enabling biological de-risking prior to assay development.
- Screening: Ensures target monodispersity and stability, directly impacting assay readiness and data quality in screening campaigns.
- Analytics: Generates quantitative sedimentation coefficient and molecular weight measurements that allow comparison of protein states under varying conditions.
- Translational Research: Connects purified target biophysics to functional validation in preclinical models through consistent material quality.
- Enterprise Reuse: Represents a standardized, reusable capability for biophysical characterization across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target properties, reduction of mechanistic ambiguity, and improved target validation rigor.
- Operational Value: Standardized sample preparation, reproducibility across runs, and scalability across laboratories.
- Strategic Value: Better-informed go/no-go decisions, reduced failure rates due to target instability, and improved capital efficiency in early discovery.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted target prioritization based on biophysical de-risking data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biophysical techniques and precision handling of optical components.
- Dependent on analytical ultracentrifuge instrumentation, torque wrenches, alignment tools, and cleanroom-compatible sample handling.
- Necessitates cross-team standardization of cleaning, assembly, and torque application protocols.
- Involves adaptation considerations for different sample types, buffer conditions, and centerpiece geometries.
- Limited by component fragility; windows and centerpieces are susceptible to damage from particulates, improper torque, or misalignment.
