Name: Sistema automatico per le misure di fluorescenza singola molecola di superficie, immobilizzato Biomolecole (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-02T16:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Scopri il metodo FRET a singola molecola per studiare la dinamica degli acidi nucleici immobilizzati su superficie. Questa tecnica automatizzata con microscopio confocale consente l'analisi in tempo reale delle interazioni molecolari.

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Ringraziamo Chandran Sabanayagam per il suo aiuto nello sviluppo del sistema, Joshua Edel per la consulenza sulla progettazione del dispositivo a microfluidi e lo staff del Rowland Institute presso la Harvard University per la lavorazione di pezzi di setup. Riconosciamo utili discussioni con i membri del gruppo Meller presso l&#39;Istituto Rowland e alla Boston University, e membri del gruppo T. Ha &#39;s a UIUC per ottenere informazioni utili. Infine, apprezziamo il sostegno finanziario della National Science Foundation (PHY-0701207) e l&#39;Istituto Nazionale della Salute (GM075893).

1 - Assemblaggio della cella microfluidica La cella microfluidica è costituito da fondendo una fantasia, 2 mm di spessore, polidimetilsilossano (PDMS) disco di una scivolata appena pulita copertura quarzo. Il disco contiene quattro PDMS 30 camere microlitri rettangolare a cui si accede da ingresso e uscita flessibile capillari collegato ad un serbatoio di buffer e una pompa a siringa, rispettivamente, per il flusso controllato di buffer. La cella di flusso è supportato dalla sua parte posteriore da una finestra di vetro e collocato su una misura titolare cella che contiene un elemento termoelettrico raffreddato ad acqua per regolare la temperatura. <ol><li> Per rendere la fantasia PDMS disco, miscelare 10 parti di base di silicone elastomero con 1 agente parte la cura, mescolate bene e lasciate degasaggio per 1 ora nel vuoto. </li><li> Delicatamente versare la miscela nello stampo elastomero cellula microfluidica. Nel nostro caso, questo è un 1 &quot;wafer di silicio con quattro strisce (1x10 1x10 4 x 3 x 300 micron) a base di photoresist negativo. Lasciare questo per la cura su un piatto caldo a 70 ° C per due ore. </li><li> Con attenzione buccia del disco curata PDMS dallo stampo usando una lama di rasoio. Fusibile il disco su un&#39;&#39;1 finestra di vetro (contenente 8 x 2 mm di diametro fori già predisposti alle due estremità dei canali) da plasma ossidanti entrambe le superfici per 30 secondi. Fondere le vetrate sul lato piatto del disco PDMS (il lato non contenente i canali). </li><li> Inserire un 2-pollice di lunghezza tubo flessibile capillare di silice fusa attraverso il foro di ogni finestra di vetro fino a quando non raggiunge il canale. Inserimento di un ago e poi segue con il capillare può facilitare questo processo. Sigillare i fori di vetro della finestra con un rapido indurimento composto colata di silicone come Kwik-Cast. </li><li> Sciacquare i canali con etanolo e acqua, e plasma-attivare la cellula insieme ad una appena pulita, da 1 pollice slittamento quarzo circolare copertura per 30 secondi. Si consiglia di pulire questo vetrino utilizzando piranha *. Fondere il vetrino sul lato della cella che contiene i canali, sigillando le camere. </li><li> Lasciare la cella assemblata a curare tutta la notte a temperatura ambiente. </li></ol> * Piranha è una soluzione di H 2 O 2 e H 2 SO 4 a 1:2.5 proporzioni. Per pulire il copri-oggetto, immergerle in piranha a 90 ° C per 20 min. 2 - Attivare la superficie di immobilizzazione molecola Per gli studi di acido nucleico, più semplice il regime di immobilizzazione superficie consiste in primo rivestimento un bicchiere o slittamento quarzo con copertura biotinilato albumina sierica bovina (BSA) e poi con streptavidina. Questo permette al campione biotinilato di essere immobilizzato con alta specificità per i giorni a temperatura ambiente. <ol><li> Collegare il tubo flessibile per i capillari per l&#39;iniezione del buffer facile utilizzando una siringa e l&#39;ago. </li><li> Iniettare una soluzione di 0,1 mg / ml di BSA biotinilati nel buffer A (10 mM TRIS-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, filtrata utilizzando filtri 0,02 micron), nel canale e incubare per almeno 30 min. </li><li> Flusso di 300-500 ml di tampone A di togliere qualunque BSA libera biotinilato dal canale, facendo attenzione a non intrappolare bolle d&#39;aria all&#39;interno della camera. </li><li> Iniettare una soluzione di 0,1 mg / ml di streptavidina nel buffer A e incubare per 15 min. Poi ripetere il passo 3. </li><li> Flusso attraverso una soluzione 3-5 pM del campione biotinilato. Eseguire una scansione della superficie per verificare la copertura di molecole fluorescenti. Se necessario, aumentare la concentrazione del campione per ottenere una migliore copertura. Incubare per 10 minuti e ripetere il passo 3. </li></ol> La cella microfluidica è montato su un palcoscenico motorizzata xy permettendo grossolane (fino a 25 mm) movimento utilizzando otticamente codificati motori DC, e fine (1 nm) utilizzando due moto a circuito chiuso attuatori piezoelettrici (Physik Instrumente modello M-014 o simili). Questo può essere fatto prima o dopo aver attivato la superficie per l&#39;immobilizzazione del campione. 3 - Preparazione del Buffer Imaging (IB) L&#39;IB consiste in un sistema enzimatico dell&#39;ossigeno scavenging e un quencher tripletta, come Trolox. Dal momento che l&#39;IB viene svuotata attraverso costantemente durante la notte, almeno 10 ml deve essere preparato in anticipo. <ol><li> Preparare 10 ml di 0,8% w / v D-glucosio, almeno 35 mM TRIS-HCl pH 8,0 e 50 mM NaCl in acqua deionizzata. La maggiore concentrazione di buffer è importante per due motivi: Trolox dissoluzione sarà acidificare la soluzione, e la reazione enzimatica anche abbassare il pH della soluzione nel tempo. Dal momento che questa soluzione ha una lunga durata può essere memorizzato come soluzione stock. </li><li> Sciogliere 5 mg di Trolox nel buffer preparata nella fase 1 con il vortex per un paio di minuti e poi agitando per&gt; 10 min. Trolox non è molto solubile in acqua a pH&gt; 7, in modo da non correre questo passaggio. Filtrare la soluzione con un filtro di 0,2 micron e lasciare degasaggio nel vuoto per 10 minuti. </li><li> Preparare la soluzione &quot;gloxy&quot; enzimatica mescolando wate 60 microlitrir, 20 ml di tampone 5X A, 20 ml di catalasi, glucosio ossidasi 1 mg e 100 ml di 10 mg / ml BSA. Filtrare la soluzione con un filtro di centrifuga 0,22 micron. </li><li> Mescolare delicatamente il tampone dal Punto 2 con la soluzione &quot;gloxy&quot; dal punto 3 evitando la formazione di bolle d&#39;aria. </li><li> Il flusso di IB attraverso il canale ad una velocità costante di 5 microlitri / min con una pompa meccanica siringa per controllare la velocità del flusso. Bolla di gas argon nel serbatoio IB per evitare che l&#39;ossigeno atmosferico da ri-sciogliendo nel buffer. </li></ol> La scansione della superficie, localizzazione molecola e l&#39;acquisizione di tracce singole intensità molecola è controllato da un programma LabView che permette la raccolta automatica dei dati 1. Il programma esegue la scansione 20x20 micron 2 aree risoluzione a 0,2 micron, con un tasso di 0,1 micron / ms. I dati vengono immediatamente lavorati per produrre intensità ponderata posizioni di tutti i pixel sopra i conteggi di fondo. Una volta che le molecole si trovano immobilizzate, vengono spostati uno per uno nel volume confocale e l&#39;intensità del donatore e fluoroforo accettore sono registrati in funzione del tempo fino a quando entrambi photobleach fluorofori. Il palco è poi programmato di passare a una nuova origine 100 micron di distanza, e il processo di scansione si ripete. 4 - Risultati Rappresentante Di seguito alcune immagini che mostrano la cellula assemblato microfluidica prima dell&#39;attivazione di superficie e dopo essere stato montato sul microscopio pronto per l&#39;immobilizzazione molecola. Se il canale è attivato con successo, le scansioni di superficie dovrebbe essere simile a quella illustrata qui sotto le scansioni che mostrano emissione del donatore colorante (verde) e accettore (rosso) dopo l&#39;eccitazione del donatore diretta. Queste molecole sono spostati uno dopo l&#39;altro nel volume di sondaggio e la fluorescenza viene registrata nel corso del tempo fino a quando entrambi photobleach coloranti, come indicato nella traccia singola molecola. Da tracce come queste si può ottenere la FRET efficienza che informa sul istantanea donatore-accettore di separazione, che a sua volta viene utilizzato per esplorare la struttura e la dinamica delle molecole di interesse biologico. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" /> Figura 1: cella Microfluidic con quattro canali, ognuno con ingresso / uscita capillari. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig1.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" border="0" /> Figura 2: Cell montato sul microscopio pronto per le misurazioni. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig2.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 2. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig3tmb.jpg" alt="Figura 3" border="0" /> Figura 3: Impostazione per sm-FRET misurazioni. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig3.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 3. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig4tmb.jpg" alt="Figura 4" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig5tmb.jpg" alt="Figura 5" border="0" /> Figure 4 e 5: il canale Rosso e verde di una scansione della superficie di immobilizzata FRET molecole eccitati con il laser verde. Clicca per vedere una versione più grande di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig4.jpg">figura 4</a> , o <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig5.jpg">figura 5</a> . <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig6tmb.jpg" alt="Figura 6" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig7tmb.jpg" alt="Figura 7" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig8tmb.jpg" alt="Figura 8" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig9tmb.jpg" alt="Figura 9" border="0" /> Figure 6, 7, 8 e 9: traiettorie Intensità del donatore (verde) e accettore (rosso) fluorofori etichettati per una molecola di DNA 8, 10, 16 e 18 paia di basi a parte. Clicca per vedere una versione più grande di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig6.jpg">figura 6</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig7.jpg">figura 7</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig8.jpg">figura 8</a> , o <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig9.jpg">figura 9</a> .

<ol><li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Techniques%2C+a+Laboratory+Manual%5BTitle%5D)+AND+%22CSHL+Press%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual.</a> CSHL Press. , (2008).</li>
<li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+scanning+confocal+microscope+for+single+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Pys.+Letters%22%5BJournal%5D)">High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis.</a> Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).</li>
<li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Fluorescence+resonance+energy+transfer+to+measure+distances+along+individual+DNA+molecules%3A+Corrections+due+to+nonideal+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer.</a> J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).</li>
<li>Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).</li>
<li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonblinking+and+long-lasting+single+molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li>
<li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).</li>
<li>Di Fiori, N., Meller, A. Article in preparation. , Forthcoming.</li>
</ol>

Anche se il protocollo di cui sopra è stato ottimizzato per il nostro particolare sistema e per una precisa scelta di coloranti (TMR e ATTO647N), esso non è affatto l&#39;unico metodo provato. Recentemente, un sistema alternativo di ossigeno scavenging composto da acido protocatechuic (PCA) / ​​protocatechuate-3 ,4-diossigenasi (PCD) ha mostrato di aumentare la fotostabilità di alcuni coloranti 4. Allo stesso modo, altri tripletta stato quenchers come il β-mercaptoetanolo (BME) può essere usato al posto di Trolox, anche se queste non possono sopprimere lunga durata lampeggiante di alcuni coloranti, in particolare Cy5 5. Anche se immobilizzazione tramite biotina-streptavidina-biotinilato albumina di siero bovino (BSA) è la scelta preferita per gli studi di acidi nucleici, un polietilene glicole (PEG)-superficie rivestita è più adatto per gli studi di proteine ​​in quanto impedisce ai non-specifica adesione 1. Inoltre, sub-diffrazione limitata vescicole formato può essere utilizzato per incapsulare le biomolecole di interesse nei casi in cui può essere influenzata dalle interazioni superficie 6. In questo articolo abbiamo utilizzato una configurazione confocale dotato di silicone fotodiodi a valanga per acquisire le tracce intensità di fluorescenza. Questo protocollo funziona altrettanto bene con microscopi a fluorescenza di riflessione interna totale (TIRF) dotate di telecamere CCD. Indipendentemente dal microscopio usato, sm-FRET può informare sulle risoluzioni spaziali avvicinando al angstrom quando il donatore e il segnale accettore sono adeguatamente corretti 7.

<table><tbody><tr><td>Tubing in silice fusa</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP150375</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino in silice fusa</td><td>Esco Products</td><td>R425000</td><td></td></tr><tr><td>Tubing</td><td>Diba Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA biotinilata</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9085</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>0021122</td><td></td></tr><tr><td>Kit elastomerico Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>3097366-1004</td><td>Kit elastomerico al silicone</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Aldrich</td><td>238813</td><td></td></tr><tr><td>Catalasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3155</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio ossidasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Sigillante Kwik-Cast</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Kwik-Cast</td><td>Composto per stampi in silicone</td></tr></tbody></table>

sistema automatico per le misure di fluorescenza singola molecola di superficie, immobilizzato biomolecole

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopia è stata ampiamente utilizzata per studiare la struttura e la dinamica delle molecole di interesse biologico, come gli acidi nucleici e proteine. Singola molecola FRET (sm-FRET) misurazioni su molecole immobilizzate permettono lunghe osservazioni del sistema in modo efficace fino a quando entrambi i coloranti photobleach-con conseguente time-tracce che relazione sulla dinamica biomolecolare con una vasta gamma di tempi da millisecondi a minuti. Per facilitare l&#39;acquisizione di un gran numero di tracce per analisi statistiche, il processo deve essere automatizzato e l&#39;ambiente campione dovrebbe essere strettamente controllato nel tempo di misura intera (~ 12 ore). Questa operazione viene eseguita utilizzando un microscopio confocale a scansione automatica che permette l&#39;interrogatorio di migliaia di singole molecole durante la notte, e una cella microfluidica che permette lo scambio controllato di buffer, con contenuto di ossigeno limitato e mantiene una temperatura costante durante tutto il periodo di misura. Qui si mostrano come assemblare il dispositivo a microfluidi e come attivare la sua superficie per l&#39;immobilizzazione del DNA. Poi ci spiegano come preparare un buffer di massimizzare la fotostabilità e la durata della fluorofori. Infine, mostriamo i passi necessari per preparare il setup per l&#39;acquisizione automatica del tempo risolto singola molecola FRET tracce di molecole di DNA.

In questo articolo viene descritto come si ottiene FRET tracce di molecole di DNA individuale immobilizzato su una superficie utilizzando un microscopio a scansione automatica confocale.

Sistema automatico per le misure di fluorescenza singola molecola di superficie, immobilizzato Biomolecole

La microscopia a trasferimento di energia risonante di fluorescenza (FRET) è stata ampiamente utilizzata per studiare la struttura e la dinamica di molecole di interesse biologico, ...

Per studiare la dinamica di singole molecole per un periodo di tempo prolungato, è necessario innanzitutto localizzare le molecole nello spazio. Questo risultato viene ottenuto immobilizzandole sulla superficie di una cella microfluidica. La procedura inizia con il montaggio della cella, che contiene quattro camere in cui verranno fissate le biomolecole.Le camere sono collegate all'esterno attraverso capillari di ingresso e di uscita. La cella è realizzata unendo un disco di PDMS strutturato a un coprioggetto in quarzo. La cella assemblata viene quindi montata sul microscopio a fluorescenza e tubi flessibili vengono collegati ai capillari per consentire un facile scambio di soluzioni attraverso le camere, al fine di attivare la superficie per l'immobilizzazione delle molecole nel primo flusso, mediante una soluzione di BSA biotinilata attraverso uno dei canali.La BSA si lega alla camera. Successivamente, far passare una soluzione di streptavidina, che a sua volta si lega alla biotina. Infine, far passare l'oligonucleotide biotinilato, che si lega alla streptavidina, ancorando così la molecola di interesse alla superficie del coprioggetto in quarzo.Un buffer di imaging progettato per massimizzare la stabilità e l'intensità della durata dei fluorofori viene fatto fluire nella camera a un tasso costante per tutto il periodo di acquisizione. L'allestimento automatizzato analizza diverse sezioni della superficie alla ricerca di molecole dotate sia di fluorofori donatori che accettori, quindi le sposta una alla volta nel volume di rilevamento, ottenendo per ciascuna una traccia temporale dell'intensità di fluorescenza fino a quando entrambi i fluorofori subiscono fotodegradazione. Ciao, sono Nicholas Dfi del laboratorio del Professor Miller del dipartimento di ingegneria biomedica della Boston University.Oggi vi mostreremo un procedimento per ottenere tracce di fluorescenza a singola molecola da acidi nucleici immobilizzati, utilizzando un apparato a scansione confocale. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare la dinamica degli acidi nucleici e le interazioni tra acidi nucleici ed enzimi. Cominciamo dunque.Il Microfluid Excel viene realizzato unendo un disco in poli dimetil silossano (PDMS) spesso due millimetri, con un'incisione, a un'ampolla di quarzo appena pulita. Per creare il disco in PDMS inciso, mescolare 10 parti di base di elastomero siliconico con una parte di agente indurente, amalgamare bene e disaerare per un'ora in vuoto. Dopo che la base di elastomero &egrave; stata disaerata, versarla delicatamente nello stampo per la cella microfluidica.Lasciare indurire la miscela di elastomero su una piastra riscaldante a 70 gradi Celsius per due ore. Una volta indurita, staccare con cura il disco di PDMS dallo stampo utilizzando una lametta. Il disco di PDMS contiene quattro camere rettangolari da 30 microlitri.Fondere il lato piatto del disco in PDMS, ovvero il lato privo dei canali, su un vetrino da un pollice mediante ossidazione al plasma di entrambe le superfici per 30 secondi. Il vetrino presenta da otto a due fori di due millimetri alle estremità dei canali, precedentemente forati. Successivamente, un tubo capillare flessibile in silice fusa lungo due pollici viene inserito attraverso ciascun foro del vetrino.Per fare ciò, inserire prima un ago e poi inserire il tubo capillare fino a quando non raggiunge il canale. Sigillare i fori della finestra di vetro utilizzando un composto di silicone per stampi a rapida polimerizzazione, come Quick Cast. Risciacquare i canali con etanolo e acqua dopo aver attivato al plasma la cella e una rondella circolare di quarzo da un pollice appena pulita con piranha per 30 secondi.Fondere il vetrino sul lato della cella contenente i canali. Le camere sono ora sigillate. Lasciare la cella assemblata a polimerizzare durante la notte a temperatura ambiente.Dopo che il microfluido assemblato in Excel è stato polimerizzato durante la notte, viene inserito in un supporto su misura e montato sul palchetto del microscopio confocale per iniziare l'attivazione della superficie della cellula. Per l'immobilizzazione della molecola, collegare dei tubi flessibili alle capillari della cellula per facilitare l'iniezione del tampone mediante siringa e ago. Iniettare ora una soluzione di 0,1 milligrammi per millilitro di BSA biotinilata nel tampone A all'interno del canale e incubare per almeno 30 minuti.Dopo l'incubazione di 30 minuti, far scorrere da 300 a 500 microlitri di tampone A per rimuovere qualsiasi BSA biotinilata non assorbita dal canale, avendo cura di non intrappolare bolle d'aria nella camera. Successivamente, iniettare una soluzione di 0,1 milligrammi per millilitro di STR din nel tampone A e incubare per 15 minuti.Dopo il flusso di incubazione di 15 minuti, aggiungere da 300 a 500 microlitri di tampone A per rimuovere qualsiasi streptavidina non assorbita dal canale. Come in precedenza, evitare di intrappolare bolle d'aria nella camera. Infine, far passare una soluzione di tre-cinque picomolari del campione biotinilato.Per verificare la copertura delle molecole fluorescenti, si esegue una scansione della superficie. Incubare il campione biotinilato per 10 minuti e ripetere il flusso del tampone. Come mostrato in precedenza, il tampone per imaging o IB è costituito da un sistema enzimatico di eliminazione dell'ossigeno e da un quencher del tripletto, come i trol, per rendere l'IB prima di tutto da sciogliere.Cinque milligrammi di trol si legano a 10 millilitri di tampone glucosio mediante vortex per alcuni minuti e agitazione per almeno 10 minuti. Filtrare la soluzione e lasciarla sotto vuoto per 10 minuti. Mescolare delicatamente la soluzione TRO lock con la soluzione enzimatica Glocky evitando la formazione di bolle d'aria.Riempire il serbatoio con la soluzione IB. Quindi, utilizzando una pompa per siringa meccanica, regolare la velocità di flusso facendo passare l'IB attraverso il canale a una velocità costante di cinque microlitri al minuto; far gorgogliare gas argon nel serbatoio dell'IB per impedire che l'ossigeno atmosferico si disciolga nel tampone. La scansione della superficie, la localizzazione delle molecole e l'acquisizione dei tracciati di intensità a livello di singola molecola sono controllate dal programma LabVIEW, che esegue la scansione di aree di 20 per 20 micrometri quadrati con una risoluzione di 0,2 micrometri e una velocità di 0,1 micrometri al millisecondo.I dati provenienti dalla scansione superficiale vengono immediatamente elaborati per ottenere le posizioni ponderate per intensità di tutti i pixel al di sopra del livello di conteggio di fondo. Una volta individuate le molecole immobilizzate, queste vengono spostate una alla volta all'interno del volume confocale e le intensità del fluorocromo donatore e di quello accettore vengono registrate in funzione del tempo fino a quando entrambi i fluorocromi subiscono il fotoblecamento. Successivamente, la fase viene programmata per spostarsi verso una nuova origine, distante 100 millimetri, e il processo di scansione viene ripetuto.Il MICROFLUID Excel assemblato è mostrato qui. Si tratta di scansioni superficiali che mostrano singole molecole nei canali del donatore verde e dell'accettore rosso. Sono riportati alcuni tracciati tipici di singole molecole con l'intensità dell'accettore in rosso e quella del donatore in verde.Abbiamo appena mostrato come ottenere tracce di singole molecole da biomolecole immobilizzate utilizzando un apparato confocale. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di eseguire ogni passaggio con attenzione e prendersi il tempo necessario, poiché si tratta di un esperimento complesso. Questo è tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Questo articolo fornisce istruzioni dettagliate per effettuare misurazioni FRET accurate e completamente corrette su singole biomolecole a diffusione libera utilizzando l'smfBox open source ed economico, dall'accensione, attraverso l'allineamento e la messa a fuoco, alla raccolta e all'analisi dei dati.

Effettuare misurazioni FRET a singola molecola precise e accurate utilizzando l'smfBox open source

Questo articolo presenta un metodo per l'analisi spaziotemporale di sonde mobili a singola molecola basate sul trasferimento di energia di risonanza di Förster (smFRET) utilizzando la microscopia a fluorescenza a campo largo. Il toolkit software di nuova concezione consente la determinazione delle tracce temporali smFRET delle sonde in movimento, compresa la corretta efficienza FRET e le posizioni molecolari, come funzioni del tempo.

Analisi spaziotemporale bidimensionale automatizzata di sonde FRET mobili a singola molecola

Qui viene presentato un protocollo per eseguire e analizzare il legame, la mobilità e l'assemblaggio di singole molecole su membrane lipidiche affollate artificiali utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale a singola molecola (smTIRF).

Diffusione e assemblaggio di singole molecole su membrane lipidiche affollate di polimeri

Questo protocollo descrive la marcatura a singolo anticorpo (SAL) per risolvere l'organizzazione spaziale su scala nanometrica delle proteine della membrana plasmatica. Sfruttando le interazioni cumulative anticorpo-epitopo a livello di singola molecola, il SAL di membrana (mSAL) mappa le distribuzioni locali degli epitopi catturando contemporaneamente il comportamento di legame degli anticorpi nell'ambiente cellulare nativo.

Microscopia di localizzazione a singola molecola delle proteine di membrana utilizzando la marcatura a singolo anticorpo

Scopri il metodo FRET a singola molecola per studiare la dinamica degli acidi nucleici immobilizzati su superficie. Questa tecnica automatizzata con microscopio confocale consente l'analisi in tempo reale delle interazioni molecolari.

Sistema automatico per le misure di fluorescenza singola molecola di superficie, immobilizzato Biomolecole

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