Sistema automatico per le misure di fluorescenza singola molecola di superficie, immobilizzato Biomolecole

Per studiare la dinamica di singole molecole per un periodo di tempo prolungato, è necessario innanzitutto localizzare le molecole nello spazio. Questo risultato viene ottenuto immobilizzandole sulla superficie di una cella microfluidica. La procedura inizia con il montaggio della cella, che contiene quattro camere in cui verranno fissate le biomolecole.

Le camere sono collegate all'esterno attraverso capillari di ingresso e di uscita. La cella è realizzata unendo un disco di PDMS strutturato a un coprioggetto in quarzo. La cella assemblata viene quindi montata sul microscopio a fluorescenza e tubi flessibili vengono collegati ai capillari per consentire un facile scambio di soluzioni attraverso le camere, al fine di attivare la superficie per l'immobilizzazione delle molecole nel primo flusso, mediante una soluzione di BSA biotinilata attraverso uno dei canali.

La BSA si lega alla camera. Successivamente, far passare una soluzione di streptavidina, che a sua volta si lega alla biotina. Infine, far passare l'oligonucleotide biotinilato, che si lega alla streptavidina, ancorando così la molecola di interesse alla superficie del coprioggetto in quarzo.

Un buffer di imaging progettato per massimizzare la stabilità e l'intensità della durata dei fluorofori viene fatto fluire nella camera a un tasso costante per tutto il periodo di acquisizione. L'allestimento automatizzato analizza diverse sezioni della superficie alla ricerca di molecole dotate sia di fluorofori donatori che accettori, quindi le sposta una alla volta nel volume di rilevamento, ottenendo per ciascuna una traccia temporale dell'intensità di fluorescenza fino a quando entrambi i fluorofori subiscono fotodegradazione. Ciao, sono Nicholas Dfi del laboratorio del Professor Miller del dipartimento di ingegneria biomedica della Boston University.

Oggi vi mostreremo un procedimento per ottenere tracce di fluorescenza a singola molecola da acidi nucleici immobilizzati, utilizzando un apparato a scansione confocale. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare la dinamica degli acidi nucleici e le interazioni tra acidi nucleici ed enzimi. Cominciamo dunque.

Il Microfluid Excel viene realizzato unendo un disco in poli dimetil silossano (PDMS) spesso due millimetri, con un'incisione, a un'ampolla di quarzo appena pulita. Per creare il disco in PDMS inciso, mescolare 10 parti di base di elastomero siliconico con una parte di agente indurente, amalgamare bene e disaerare per un'ora in vuoto. Dopo che la base di elastomero è stata disaerata, versarla delicatamente nello stampo per la cella microfluidica.

Lasciare indurire la miscela di elastomero su una piastra riscaldante a 70 gradi Celsius per due ore. Una volta indurita, staccare con cura il disco di PDMS dallo stampo utilizzando una lametta. Il disco di PDMS contiene quattro camere rettangolari da 30 microlitri.

Fondere il lato piatto del disco in PDMS, ovvero il lato privo dei canali, su un vetrino da un pollice mediante ossidazione al plasma di entrambe le superfici per 30 secondi. Il vetrino presenta da otto a due fori di due millimetri alle estremità dei canali, precedentemente forati. Successivamente, un tubo capillare flessibile in silice fusa lungo due pollici viene inserito attraverso ciascun foro del vetrino.

Per fare ciò, inserire prima un ago e poi inserire il tubo capillare fino a quando non raggiunge il canale. Sigillare i fori della finestra di vetro utilizzando un composto di silicone per stampi a rapida polimerizzazione, come Quick Cast. Risciacquare i canali con etanolo e acqua dopo aver attivato al plasma la cella e una rondella circolare di quarzo da un pollice appena pulita con piranha per 30 secondi.

Fondere il vetrino sul lato della cella contenente i canali. Le camere sono ora sigillate. Lasciare la cella assemblata a polimerizzare durante la notte a temperatura ambiente.

Dopo che il microfluido assemblato in Excel è stato polimerizzato durante la notte, viene inserito in un supporto su misura e montato sul palchetto del microscopio confocale per iniziare l'attivazione della superficie della cellula. Per l'immobilizzazione della molecola, collegare dei tubi flessibili alle capillari della cellula per facilitare l'iniezione del tampone mediante siringa e ago. Iniettare ora una soluzione di 0,1 milligrammi per millilitro di BSA biotinilata nel tampone A all'interno del canale e incubare per almeno 30 minuti.

Dopo l'incubazione di 30 minuti, far scorrere da 300 a 500 microlitri di tampone A per rimuovere qualsiasi BSA biotinilata non assorbita dal canale, avendo cura di non intrappolare bolle d'aria nella camera. Successivamente, iniettare una soluzione di 0,1 milligrammi per millilitro di STR din nel tampone A e incubare per 15 minuti.

Dopo il flusso di incubazione di 15 minuti, aggiungere da 300 a 500 microlitri di tampone A per rimuovere qualsiasi streptavidina non assorbita dal canale. Come in precedenza, evitare di intrappolare bolle d'aria nella camera. Infine, far passare una soluzione di tre-cinque picomolari del campione biotinilato.

Per verificare la copertura delle molecole fluorescenti, si esegue una scansione della superficie. Incubare il campione biotinilato per 10 minuti e ripetere il flusso del tampone. Come mostrato in precedenza, il tampone per imaging o IB è costituito da un sistema enzimatico di eliminazione dell'ossigeno e da un quencher del tripletto, come i trol, per rendere l'IB prima di tutto da sciogliere.

Cinque milligrammi di trol si legano a 10 millilitri di tampone glucosio mediante vortex per alcuni minuti e agitazione per almeno 10 minuti. Filtrare la soluzione e lasciarla sotto vuoto per 10 minuti. Mescolare delicatamente la soluzione TRO lock con la soluzione enzimatica Glocky evitando la formazione di bolle d'aria.

Riempire il serbatoio con la soluzione IB. Quindi, utilizzando una pompa per siringa meccanica, regolare la velocità di flusso facendo passare l'IB attraverso il canale a una velocità costante di cinque microlitri al minuto; far gorgogliare gas argon nel serbatoio dell'IB per impedire che l'ossigeno atmosferico si disciolga nel tampone. La scansione della superficie, la localizzazione delle molecole e l'acquisizione dei tracciati di intensità a livello di singola molecola sono controllate dal programma LabVIEW, che esegue la scansione di aree di 20 per 20 micrometri quadrati con una risoluzione di 0,2 micrometri e una velocità di 0,1 micrometri al millisecondo.

I dati provenienti dalla scansione superficiale vengono immediatamente elaborati per ottenere le posizioni ponderate per intensità di tutti i pixel al di sopra del livello di conteggio di fondo. Una volta individuate le molecole immobilizzate, queste vengono spostate una alla volta all'interno del volume confocale e le intensità del fluorocromo donatore e di quello accettore vengono registrate in funzione del tempo fino a quando entrambi i fluorocromi subiscono il fotoblecamento. Successivamente, la fase viene programmata per spostarsi verso una nuova origine, distante 100 millimetri, e il processo di scansione viene ripetuto.

Il MICROFLUID Excel assemblato è mostrato qui. Si tratta di scansioni superficiali che mostrano singole molecole nei canali del donatore verde e dell'accettore rosso. Sono riportati alcuni tracciati tipici di singole molecole con l'intensità dell'accettore in rosso e quella del donatore in verde.

Abbiamo appena mostrato come ottenere tracce di singole molecole da biomolecole immobilizzate utilizzando un apparato confocale. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di eseguire ogni passaggio con attenzione e prendersi il tempo necessario, poiché si tratta di un esperimento complesso. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.