Name: Luso di SC1 (Pluripotin) a supporto Mesc auto-rinnovamento in assenza di LIF (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-18T17:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Scopri come mantenere l'auto-rinnovamento delle cellule staminali embrionali murine con la piccola molecola SC1 in assenza di LIF. Questo metodo offre un'alternativa economica per la coltura di cellule ES.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Sheng Ding di The Scripps Research Institute e il dott Hongkui Deng dell&#39;Università di Pechino per la loro assistenza e direzione.

1. Preparazione delle piastre alimentatore MEF <ol><li> Un giorno prima che le cellule ES coltura, scongelare un flaconcino del combustibile irraggiato E14.5 CF-1 alimentatore cellule MEF (vedi la nostra procedura su come scongelare le cellule ES). </li><li> Piastra le cellule MEF alimentatore ad una densità di 10.000 cellule / pozzetto in un piatto ben 12. Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C e 5% di CO 2. MEF cellula media: DMEM supplementato con 10% ES-PBS 1X 1X glutammina e aminoacidi non essenziali. </li></ol> 2. Manutenzione di auto-rinnovamento delle cellule ES mouse <ol><li> Staccare le cellule ES con tripsina. Seed le cellule ad una densità di 50.000 cellule / pozzetto sui piatti MEF precedentemente preparato alimentatore in terreni di coltura (MEM Knockout integrata con il 15% KSR, 4 mM L-glutammina, 0,1 mM di aminoacidi non essenziali e 1X BME) integrata con SC1 alla concentrazione desiderata (abbiamo usato 100 nm, 300 nm e 1 micron). Abbiamo anche aggiunto un controllo positivo che è stato integrato con 1000 μ / ml di LIF. Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Coltura le cellule a 37 ° C e 5% di CO 2 per 3-4 giorni in ogni passaggio. Aggiornare i media ogni 48 ore. </li><li> Cellule passaggio 1:10-1:15 con tripsina per mantenere una densità simile a quella della densità di semina iniziale. Dopo 5 passaggi, le cellule possono essere esaminati per l&#39;espressione di marcatori tipici pluripotenza utilizzando immunocitochimica. </li></ol> 3. Esame immunocitochimica di marcatori pluripotenza <ol><li> Lavare le cellule delicatamente per tre volte con PBS. </li><li> Fissare le cellule con 500 ml di fissativo per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule delicatamente per tre volte con PBS. </li><li> Blocca legame non specifico con 500 microlitri di buffer bloccando per un&#39;ora a temperatura ambiente. </li><li> Incubare le cellule con 250 microlitri di anticorpo specifico primario (abbiamo usato Nanog, Sox2, SSEA1, e Oct4 alle diluizioni seguente: 1:500, 1:2000, 1:500 e 1:500) </li><li> Lavare le cellule delicatamente per tre volte con PBS. </li><li> Incubare le cellule con 250 microlitri di anticorpo secondario per due ore a temperatura ambiente, mantenendo al riparo dalla luce (abbiamo usato asino anti-topo coniugati con Alexa Fluor ® 555 a 1:2000 e asino anti-coniglio coniugato con Alexa Fluor ® 488 a 1 : 2000). </li><li> Lavare le cellule delicatamente per tre volte con PBS. </li><li> Aggiungi DAPI (concentrazione finale 1 mg / ml) per l&#39;ultimo lavaggio e incubare 5 minuti per visualizzare nuclei. </li><li> Analizzare le cellule al microscopio a fluorescenza. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: 1. Morfologia risultati: Topo cellule staminali (ESC R1) sono stati coltivati ​​su cellule alimentatore MEF in presenza di uno o LIF SC1 per sostenere auto-rinnovamento in uno stato indifferenziato. Dopo il secondo passaggio, la differenziazione potrebbe essere osservato nelle cellule senza LIF o SC1 (controllo negativo) e dopo 5 passaggi essenzialmente non indifferenziato colonie sono state osservate. LIF (controllo positivo) colonie trattate è rimasto in uno stato indifferenziato tutto il 5 passaggi cellula. Cellule trattate con SC1 a concentrazioni di 300 Nm o 100 nM anche rimasto indifferenziato dopo 5 passaggi, tuttavia, le cellule trattate con 1 mM SC1 morte cellulare sperimentato dopo il passaggio quarto. (Fig. 2 della nota app) La tabella 1 riassume le osservazioni morfologiche. 2. Espressione di marcatori pluripotenza Le cellule staminali del mouse effettuato per 5 passaggi sono stati fissati ed esaminate mediante immunocitochimica per SSEA1, Oct4, Sox2 e Nanog. Espressione marcatore era simile alle cellule mantenute in LIF. (Fig. 3 e 4 della nota applicazione) <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2a.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: confronto Morfologia di cellule mantenute in LIF o SC1. Nessuna differenza è stata osservata nella morfologia. <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2c.jpg" alt="Figura 2 e 3" /> Figura 2 e Figura 3: Nanog, SSEA1, Sox2 e Oct4 colorazione delle cellule ES mantenuto con SC1 o LIF (fig. 4 della nota app). Cellule mantenute in SC1 spettacolo simile espressione pluripotenza marcatore per le cellule mantenute in LIF. Tabella 1 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td> Controllo Negativo </td><td> LIF controllo positivo </td><td> SC1 1um </td><td> SC1 300 nm </td><td> SC1 100 nM </td></tr><tr><td> 1 Passage </td><td> Normale morfologia delle cellule ES </td><td> Normale morfologia delle cellule ES </td><td> Normale morfologia delle cellule ES </td><td> Normale morfologia delle cellule ES </td><td> Normale morfologia delle cellule ES </td></tr><tr><td> Passaggio 2 </td><td> Alcuni morfologia differenziata </td><td> E normaleS morfologia delle cellule </td><td> Normale morfologia delle cellule ES </td><td> Normale morfologia delle cellule ES </td><td> Normale morfologia delle cellule ES </td></tr><tr><td> Passaggio 3 </td><td> Maggior parte delle cellule differenziate </td><td> Normale morfologia delle cellule ES </td><td> Normale morfologia delle cellule ES </td><td> Normale morfologia delle cellule ES </td><td> Normale morfologia delle cellule ES </td></tr><tr><td> Passaggio 4 </td><td> Nessun ESC colonie </td><td> Normale morfologia delle cellule ES </td><td> La morte cellulare osservata </td><td> Normale morfologia delle cellule ES </td><td> Normale morfologia delle cellule ES </td></tr><tr><td> Passaggio 5 </td><td> differenziato </td><td> Normale morfologia delle cellule ES </td><td> La morte cellulare osservata </td><td> Normale morfologia delle cellule ES </td><td> Normale morfologia delle cellule ES </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li>
<li>Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453, 519-523 (2008).</li>
<li>Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+embryonic+stem+cells+by+a+small+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acat.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule.</a> Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).</li>
</ol>

Gli autori di questo articolo sono impiegati da Stemgent che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

Il SC1 piccola molecola può essere utilizzata per mantenere auto-rinnovamento con uno stato indifferenziato delle cellule ES mouse. Prima di utilizzare su una linea cellulare non testato, comunque, dovrebbe essere titolato per determinare la concentrazione ottimale. Per esempio, abbiamo testato tre concentrazioni sulla cellula del mouse ES linea ESC R1. 100 nM e 300 nM concentrazioni sono stati in grado di sostenere le cellule staminali embrionali del mouse, invece, una concentrazione 1 mM era tossico. SC1 può essere utilizzato anche sotto alimentatore senza condizioni.

<table><tbody><tr><td>SC1</td><td>Stemgent</td><td>04-0011</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-SSEA-1</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>21702</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-Nanog</td><td>Abcam</td><td>ab21603</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-Sox2</td><td>Chemicon International</td><td>Ab5603</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-Oct4</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-5279</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;uso di sc1 (pluripotin) a supporto mesc auto-rinnovamento in assenza di lif

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Topo staminali embrionali (ES), le cellule sono coltivate in modo convenzionale con fattore inibente la leucemia (LIF) per mantenere l&#39;auto-rinnovamento.<sup&gt; 1</sup&gt; Comunque, LIF è costoso e l&#39;attivazione del pathway LIF/JAK/STAT3 non è assolutamente necessaria per mantenere l&#39;auto-rinnovamento dello Stato.<sup&gt; 2</sup&gt; Il SC1 piccola molecola potrebbe essere un&#39;alternativa economica a LIF. SC1 funzioni attraverso la doppia inibizione di Ras-GAP e ERK1.<sup&gt; 3</supIllustrazione&gt; del suo meccanismo d&#39;azione lo rende uno strumento utile per studiare il meccanismo molecolare fondamentale di auto-rinnovamento. Qui mostriamo la procedura per la coltura delle cellule di topo ES in presenza di SC1 e dimostrare che sono in grado di mantenere auto-rinnovamento, in assenza di LIF. Cellule in coltura con SC1 mostrato morfologia simile rispetto alle cellule mantenute con LIF. Entrambi i quali dimostrano tipica morfologia ES del mouse dopo cinque passaggi. Tipica espressione di marcatori di pluripotenza (Oct4, Sox2, Nanog, e SSEA1) è stata osservata dopo cinque passaggi in presenza di SC1. Inoltre, SC1 non ha causato tossicità manifesta in cellule staminali embrionali del mouse.

SC1 funzioni attraverso la doppia inibizione di Ras-GAP e ERK1. Abbiamo testato la funzione di SC1 nel sostenere ES cellule del mouse di auto-rinnovamento, in assenza di LIF e ha dimostrato che SC1 è in grado di mantenere auto-rinnovamento delle colture di cellule ES topo.

L&#39;uso di SC1 (Pluripotin) a supporto Mesc auto-rinnovamento in assenza di LIF

Le cellule staminali embrionali (ES) di topo vengono convenzionalmente coltivate con il fattore inibitore della leucemia (LIF) per mantenerne l'autorinnovamento.1 Tuttavia, il LIF è costoso e...

Ciao, sono Sarah NAU del laboratorio STEM Gen di Boston. Oggi vi mostreremo un procedimento per mantenere l'auto-rinnovamento delle cellule staminali embrionali di topo in presenza della molecola di piccole dimensioni C1 mO (C one mouse). Normalmente, le cellule staminali embrionali vengono coltivate in presenza del fattore inibitorio della leucemia per mantenere l'auto-rinnovamento.Tuttavia, L è costoso. Quindi qui forniremo un'alternativa economica, la molecola di piccole dimensioni SC one. Nell'ultima parte del video, vi mostreremo un confronto dell'espressione dei marcatori di pluripotenza tra cellule coltivate in L e quelle coltivate in SC one.Iniziamo. Un giorno prima della coltura delle cellule staminali embrionali, scongela una provetta di cellule feeder irradiate. Pianifica le cellule feeder a una densità di 10.000 cellule per pozzetto.In una piastra a 12 pozzetti, incubare le cellule tutta la notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, piastrare le cellule ES sullo strato di cellule MEF, seminando le cellule a una densità di 50.000 cellule per pozzetto sulle piastre con feeder preparate, in mezzo di crescita integrato con SC1 alla concentrazione desiderata; abbiamo utilizzato 100 nanomolari, 300 nanomolari e 1 micromolare.Come controllo, aggiungiamo un pozzetto a cui è stato aggiunto LIF a una concentrazione di 1000 microgrammi per millilitro. Incubare ora le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Il giorno successivo, rinnovare il mezzo per la coltura continua. Rinnovare il mezzo ogni 48 ore, passando le cellule con un rapporto di uno a 10 ogni tre o quattro giorni, per mantenere una densità simile a quella iniziale di semina. Dopo cinque passaggi, è ora possibile verificare l'espressione dei marcatori tipici della pluripotenza mediante immunocitochimica, iniziando così l'immunocitochimica delle cellule staminali.Iniziare lavando delicatamente le cellule tre volte con PBS. Fissare le cellule con 500 microlitri di paraformaldeide al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver lavato le cellule in PBS altre tre volte, bloccare il legame non specifico con 500 microlitri di buffer bloccante per un'ora a temperatura ambiente.Successivamente, aggiungere 250 microlitri dell'anticorpo primario alle cellule e lasciare incubare a quattro gradi Celsius durante la notte. In questo esperimento, si incuba con gli anticorpi nano SOX due, SSEA uno e OCT quattro. Dopo un ulteriore ciclo di lavaggi, incubare le cellule con 250 microlitri dell'anticorpo secondario coniugato con un colorante fluorescente per due ore a temperatura ambiente, proteggendo dal contatto con la luce; lavare infine le cellule aggiungendo DAPI a una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro nell'ultimo lavaggio.Quindi incubare le cellule per cinque minuti per colorare i nuclei. Infine, analizzare le cellule al microscopio a fluorescenza. Qui sono mostrate immagini in campo chiaro di cellule staminali embrionali di topo coltivate su cellule sentinella in presenza di LIF o SC uno per mantenere l'auto-rinnovamento in uno stato indifferenziato.Qui vengono mostrate cellule staminali embrionali di topo, mantenute per cinque passaggi. Le cellule sono state fissate ed esaminate mediante immunoistochimica per SSEA-1, OCT-4, Nanog e SOX-2. L'espressione dei marcatori per le cellule mantenute in C1 era simile a quella delle cellule mantenute in LIF.Abbiamo appena mostrato come utilizzare la molecola di piccole dimensioni SC one per mantenere l'auto-rinnovamento nelle cellule staminali embrionali di topo. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che SC one deve essere titolato per determinare la concentrazione ottimale prima di essere utilizzato su una linea cellulare non testata. Questo è tutto.Grazie per averci seguito e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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