Congelamento e scongelamento cellule staminali embrionali umane

Ciao, sono Leah Kent di STEM Gen. Oggi vi mostreremo come scongelare e congelare cellule staminali embrionali umane. Cominciamo.

Per scongelare le cellule staminali embrionali umane, un'ampolla criogenica viene prelevata dall'azoto liquido e scongelata rapidamente. In un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius, la sospensione cellulare viene trasferita dall'ampolla criogenica in un tubo conico, diluita con mezzo di coltura per cellule staminali embrionali umane e centrifugata. Per formare un piccolo pellet cellulare, il soprannatante viene quindi rimosso e il pellet cellulare viene risospeso con mezzo di coltura fresco per cellule staminali embrionali umane nel tubo, prima di essere seminato in un pozzetto di una piastra per colture cellulari a sei pozzetti, precedentemente rivestita con uno strato di cellule nutritizie di metionina irradiate.

Un giorno prima della scongelazione delle cellule staminali umane, piastrare uno strato di cellule di supporto costituito da fibroblasti embrionali di topo irradiati, o mes, in coltura meth. Aggiungere il mezzo in una pozzetta di una piastra da coltura tissutale a sei pozzette rivestita con gelatina. Incubare la piastra tutta la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Per garantire un'efficace e corretta scongelazione, assicurarsi di avere tutti gli strumenti e i reagenti necessari pronti. Prima di rimuovere l'ESL umano dall'azoto liquido, utilizzare pinze metalliche per prelevare una provetta criogenica contenente ESL umano dal serbatoio di stoccaggio in azoto liquido.

Rotolare la provetta tra le mani guantate per tre-cinque secondi. Per rimuovere la brina, registrare le informazioni sull'etichetta della provetta utilizzando pinze metalliche. Immergere la provetta in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.

Agitare delicatamente il flacone e osservare spesso ma rapidamente l'avanzamento del scongelamento tenendo il flacone alla luce. Per vedere la dimensione del cristallo di ghiaccio. Non immergere il tappo del flacone nel bagnomaria poiché ciò potrebbe contaminare le cellule.

Quando rimane solo un piccolo cristallo di ghiaccio, immergere il flaconcino in etanolo per sterilizzarlo all'interno di una cappa biologica sterile e trasferire il contenuto del flaconcino criogenico direttamente nella parte inferiore di un tubo conico da 15 millilitri. Aggiungere lentamente quattro millilitri di coltura cellulare di cellule staminali umane. Mezzo nel tubo.

Agitare delicatamente il tubo per mescolare continuamente le cellule mentre si aggiunge il nuovo mezzo al tubo. Centrifugare le cellule E es umane per cinque minuti a 200 G mentre le cellule si trovano nella centrifuga. Recuperare la piastra di alimentazione con metionina precedentemente preparata dall'incubatrice a 37 gradi Celsius ed etichettarla con le informazioni appropriate per le cellule ESL umane, come linea cellulare, numero di passaggio e data di scongelamento.

Aspirare il mezzo di coltura dei MEF e aggiungere un millilitro di PBS nel pozzetto. Riportare il pellet di cellule staminali embrionali umane nell'armadio di sicurezza biologica e aspirare con attenzione il soprannatante. Fare attenzione a non aspirare il pellet cellulare, ma rimuovere la maggior quantità possibile di soprannatante, poiché questa soluzione contiene DMSO dal mezzo di congelamento.Resus.

Sospendere delicatamente il pellet aggiungendo 2,5 millilitri di mezzo di coltura umano ESL. Utilizzando una pipetta di vetro da cinque millilitri ed eseguendo da tre a quattro aspirazioni, rimuovere il PBS dal letto di MEF. Aggiungere lentamente e completamente tutti i 2,5 millilitri della sospensione di cellule staminali umane alla pozzetta preparata della piastra a sei pozzette.

Posizionare la piastra nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e farla scivolare con attenzione avanti e indietro, e da un lato all'altro, per distribuire uniformemente le cellule in tutta la pozzetta. In questo modo si evita di concentrare le colonie al centro. Non agitare la piastra in senso circolare.

Lasciare attaccare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica durante la notte, nel giorno successivo al disgelo. Rimuovere il mezzo con le eventuali cellule in sospensione e aggiungere 2,5 millilitri di fresco mezzo di coltura per cellule staminali umane nel pozzetto.

Incubare le piastre a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica durante la notte e continuare la coltura fino a quando le colonie sono pronte per essere passate. Il protocollo di congelamento delle cellule staminali embrionali umane inizia con colonie di cellule staminali embrionali umane di dimensioni medie e sane, coltivate in una piastra a sei pozzetti. Dopo aver incubato la coltura con l'enzima collagenasi quattro, le colonie vengono raschiate con una pipetta di vetro da cinque millilitri, raccolte in un tubo conico e centrifugate per formare un pellet cellulare lento.

Dopo aver aspirato il soprannatante, il pellet cellulare viene risospeso, prima con mezzo di coltura per cellule staminali embrionali umane e poi diluito con due volumi di mezzo crioprotettivo. Le cellule vengono distribuite uniformemente in aliquote da un millilitro e congelate in provette criogeniche.

Mentre le cellule sono nella centrifuga, etichettare le provette criogeniche all'interno della cappa a sicurezza biologica con il numero di passaggio della linea cellulare e la data di congelamento. La densità tipica per il congelamento delle cellule staminali embrionali umane è rappresentata da una pozzetta di cellule provenienti da una piastra a sei pozzette per ogni provetta criogenica. Dopo che le cellule staminali embrionali umane sono state centrifugate, riportare il tubo nella cappa a sicurezza biologica.

Aspirare il soprannatante dal tubo. Avere cura di non disturbare il pellet cellulare, che è generalmente poco compatto. Sospendere il pellet cellulare con la quantità appropriata di mezzo di coltura umano ESL.

Mediare 0,5 millilitri di coltura di ESL umano. Mediare per provetta criogenica. Essere estremamente delicati durante la pipettatura, poiché le cellule staminali embrionali umane si riprendono meglio quando congelate in frammenti di colonia relativamente grandi; aggiungere lentamente, agitando delicatamente il tubo, la quantità appropriata di mezzo di congelamento per cellule staminali embrionali umane 2x alle cellule.

Dopo aver aggiunto il mezzo di congelamento, mescolare la soluzione in modo estremamente delicato, una o due volte velocemente, quindi aggiungere delicatamente un millilitro di sospensione cellulare in ogni provetta criogenica. Trasferire le provette in un contenitore di congelamento con isopropanolo e posizionarle in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per tutta la notte. Le cellule si congeleranno a un grado Celsius al minuto nel contenitore di congelamento con isopropanolo al giorno successivo.

Trasferire rapidamente le provette congelate in un serbatoio di azoto liquido utilizzando pinze metalliche. Il primo giorno dopo il passaggio, le cellule staminali umane possono presentare piccole colonie trasparenti che risultano difficili da osservare al microscopio. Poiché appena passate, le cellule staminali embrionali umane tendono a proliferare piuttosto lentamente.

Potrebbero richiedere alcuni giorni in coltura per apparire come colonie stabilite. Abbiamo appena mostrato come scongelare e congelare colture di cellule staminali embrionali umane. Ecco fatto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.