Name: Metodi per lo studio del mascellare Zebrafish Barbel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-23T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Scopri il protocollo chirurgico per l'amputazione e la rigenerazione del barbiglio mascellare in Danio rerio. Questo metodo permette di analizzare lo sviluppo di cellule sensoriali e i meccanismi rigenerativi in vivo.

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Questi metodi sono stati sviluppati da EEL durante un congedo di ricerca nel laboratorio di JT è stato fornito supporto da parte dell&#39;Università DePaul Research Council e una NIH / NIDCR R01 concedere a JT (DE016678). Noi riconosciamo con gratitudine gli sforzi di Hunter Caroline, la cura degli animali tecnico nella struttura centrale zebrafish CMRC e Paulina Pawluczuk, il nostro assistente di laboratorio di laurea.

Zebrafish allevamento Zebrafish sono alloggiati e allevati secondo i metodi standard 1. Passato il periodo tardo larvale, lo stadio di sviluppo di un pesce zebra può essere misurata dalla sua lunghezza standard (SL), o la distanza retta in millimetri dal punto anteriormost del labbro superiore alla base della pinna caudale (posteriormost piastra hypural) 2. A circa un mese dopo la fecondazione (10-12 mm SL), i barbigli nasali e mascellari appaiono gemme epiteliali come trasparente vicino al box olfattive e sugli angoli posteriori dei mascellari, rispettivamente. Come il pesce zebra matura, il barbi si estendono in strette, baffi appendici simili. Perché il mascellare barbi è più grande (2-3 mm) e più facile da manipolare, il nostro protocollo si applica solo a questa appendice particolare; tecniche simili, tuttavia, potrebbero essere adattati alle più piccole la nasale barbo. Barbel Clipping <ol><li> Anestetizzare zebrafish adulti nella fase desiderato (ad es., 1,5-2,5 cm SL, ~ 3-6 mesi dopo la fecondazione) mediante immersione in 0.015% MS-222 (3-etil amminobenzoato metanosolfonato) tamponata a pH 7,0 in acqua sistema. Osservare i movimenti fino nuotare fermarsi e ventilazione branchie diventa lento e regolare. A seconda della dimensione, l&#39;anestesia completa dura circa 2-5 minuti. </li><li> L&#39;utilizzo di un acquario a rete, il trasferimento di pesce 1-3 alla volta per un pezzo piegato su un tovagliolo di carta umido in una capsula di Petri. Con una spatola smussato, orientare il pesce in modo che siano paralleli tra lato e laterale sinistro alto. Parte piega il tovagliolo di carta bagnato sulla parte caudale del pesce, che copre tutto il corpo fino alla opercolo (opercoli branchiali) per mantenere la pelle e le branchie umide durante la procedura. </li><li> Vista la piastra Petri con lo stereomicroscopio, con basso angolo di luce incidente ad illuminare la regione della testa. Focus sulla base della sinistra barbi mascellare, che sporge da un angolo posteriore ventrale del mascellare (Fig. 1). <img src="/files/ftp_upload/1558/1558fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. </li><li> Afferrare saldamente l&#39;asta del distale leggermente verso il bordo della mascella barbo. Elevare l&#39;albero barbi e inserire le fauci di un punta fine forbici primavera appena prossimale al forcipe. Le forbici possono essere toccati per le pinze per la stabilità. Far scorrere le mascelle delle forbici lungo l&#39;asta del barbi fino a quando la punta di diamante si avvicina al bordo della mascella. Chiudere la forbice per tagliare l&#39;albero barbo. Il barbo amputato, ancora alle prese con pinza, può essere rimosso per la fissazione o ulteriori osservazioni. </li><li> Trasferire immediatamente il pesce a un piccolo serbatoio di acqua pulita del sistema (~ 500 ml) contenente una goccia di blu di metilene per il controllo superficiale infezioni fungine. Lasciare che il pesce di recuperare durante la notte. Il mattino seguente, ritorno il pesce al sistema di allevamento. Barbel rigenerazione è massima dopo 2 settimane. </li></ol> Incorporare agar di Matched Pairs Barbel <ol><li> Raccogliere i pesci con la tecnica appropriata e l&#39;eutanasia fissare in un tubo 50 ml di paraformaldeide al 4%-tampone fosfato (PBS) con agitazione a 4 ° C durante la notte. Il volume del fissativo deve essere almeno dieci volte il volume del tessuto. Dopo la fissazione, lo smaltimento dei rifiuti paraformaldeide in un contenitore approvato e lavare accuratamente il tessuto in diversi cambiamenti di PBS. </li><li> Preparare in un bicchiere da 250 mL pallone da 150 mL di agarosio al 2% (T m ~ 37 ° C) in acqua distillata. Calore con un forno a microonde o sulla piastra riscaldante, agitare periodicamente fino a completo scioglimento. Equilibrare la soluzione fuso in A ° C 50-60 bagnomaria. </li><li> Assemblare un impianto standard di elettroforesi su gel mettendo un piccolo stampo gel guarnizione (10 x 10 cm; ~ 100 volumi gel mL) saldamente contro i lati della camera di buffer. Aggiungere 2-4 piccoli pettini a denti campione (4 x 1,5 mm). </li><li> Su una superficie piana, versare l&#39;agarosio fuso nello stampo per coprire solo la base del pettine, formando pozzi molto superficiale. Subito messo l&#39;agarosio rimasto indietro nel bagno d&#39;acqua calda, che sarà utilizzato in seguito per integrare il tessuto (Piazza di 9-12). Metti una lunga pipetta Pasteur di vetro nel pallone per mantenere la pipetta alla stessa temperatura del agarosio. </li><li> Lasciare indurire il gel per 20-30 minuti. Rimuovere i favi, quindi rimuovere lo stampo gel contenente il gel indurito dalla camera buffer. Saldamente nastro i lati aperti dello stampo gel con del nastro di laboratorio in modo che il gel non scivolare fuori. Questo nastro dovrebbe estendersi diversi millimetri sopra la superficie del agarosio in modo che ulteriori agarosio può essere aggiunto in seguito (Step 13). </li><li> Posizionare lo stampo gel sul palco di uno stereomicroscopio. Ingrandire un pozzo vuoto e portare i bordi a fuoco. </li><li> Sulla superficie adiacente al pozzo agarosio, pipetta una goccia d&#39;acqua o tampone contenente i campioni fissati barbi (ad esempio, rigenerarsi e di controllo). USIng piegato perni insetti, trascinare i campioni umidi nel pozzo e spingerli verso il basso. Orientare il barbi alberi paralleli l&#39;uno all&#39;altro e allineati contro opposto lungo i bordi del pozzo. Tensione superficiale contribuirà a tenere il tessuto in posizione. </li><li> Quando si è pronti ad inserire, utilizzare una punta sottile pipetta o l&#39;angolo di un laboratorio di tessuti per rimuovere il liquido in eccesso dal pozzo. Lavorare velocemente per non lasciare che il tessuto asciugare. </li><li> Utilizzando la pipetta Pasteur in vetro riscaldato, delicatamente fresco pipetta agarosio fuso dentro e intorno i campioni per sigillare il tessuto barbi in posizione. Non riempire troppo. Prima l&#39;agarosio si indurisce, fare aggiustamenti dell&#39;ultimo minuto con i perni di insetti. </li><li> Inserire una etichetta numerata campione di carta accanto al pozzo e fissarlo con una piccola goccia di agarosio. </li><li> Ripetere i passaggi da 6 a 10 per ciascun pozzetto di campioni. </li><li> Se lo si desidera per la calibrazione di immagini, inserire un pezzo di carta con una scala micrometrica stampata (ad esempio, <a href="http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/">http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/</a> ) nel fondo di un pozzo vuoto. Appiattire la carta sul fondo del pozzo e coprire con caldo agarosio. </li><li> Dopo che tutti i campioni sono incorporati, la superficie del gel sarà irregolare, con gocce indurite di agarosio. Posizionare il gel su una superficie piana e delicatamente versare ulteriori agarosio fuso fino a quando la superficie superiore è uniforme. Utilizzare la più piccola quantità di agarosio necessaria per ottenere una superficie liscia, troppo agarosio oscurerà a luce trasmessa fotografia. Permettere che questo strato superiore ad indurirsi. </li><li> Il gel può essere fotografato sul palco di uno stereomicroscopio per registrare morfologia lordi per ogni coppia barbo. Calibrazione immagine è ottenuta fotografando la scala micrometrica incorporato. </li><li> Il gel intero possono essere conservati avvolti in tovaglioli di carta bagnata e sigillato in un sacchetto di plastica a 4 ° per diverse settimane. </li><li> Per ulteriori analisi, blocchi di agar contenente coppia di barbigli può essere tagliato fuori dal gel con una lama di bisturi o un rasoio e trattati per istologia paraffina o criosezionamento con metodi standard di 3,4. In alternativa, barbi individuo può essere sezionato dalla agarosio con aghi sottili, lavate in acqua, e trattati per altre applicazioni a valle (ad esempio, con tutto il montaggio immunoistochimica e microscopia confocale). </li></ol>

<ol><li>Westerfield, M. Chapter 1 General Methods for Zebrafish Care. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Howe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+length%3A+Not+quite+so+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Fisheries+Research+%28Amsterdam%29%22%5BJournal%5D)">Standard length: Not quite so standard.</a> Fisheries Research (Amsterdam). 56, 1-7 (2002).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+Embedding+Tissue+Samples+for+Sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Paraffin Embedding Tissue Samples for Sectioning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 6, (2008).</li>
<li>Westerfield, M. Ch 8.3 Agar Embedding for Cryostat Sectioning of Embryos or Larvae. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Hansen, A., Reutter, K., Zeiske, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+bud+development+in+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Taste bud development in the zebrafish, Danio rerio.</a> Dev Dyn. 223, 483-496 (2002).</li>
</ol>

Il pesce zebra mascellare barbi è un sistema di tessuto sottoutilizzate per lo studio della crescita, la manutenzione e la rigenerazione di diversi tipi di cellule in zebrafish. Anche se l&#39;appendice barbi non ha l&#39;analogo umano, i tipi di cellule in esso contenute sono altamente conservati, rendendo possibile lo studio della pelle, ghiandole, melanociti, vasi circolatori e nervi in ​​una struttura otticamente chiara e anatomicamente semplice forma cilindrica. Simile al ben studiato pinna caudale, il tessuto barbi possono essere indotte a rigenerare da amputazione. Utilizzando il bordo della mascella come un punto di riferimento anatomico, il piano di amputazione può essere collocato con precisione, agevolare la misurazione dei barbi ricrescita. Per un operatore esperto, ogni intervento chirurgico richiede solo pochi secondi. Il recupero è rapido, e finora abbiamo rilevato alcun effetto a breve oa lungo termine sul comportamento dei pesci. Zebrafish con una nuotata mascellare barbi, mangiano e si riproducono nel modo più efficace non chirurgica controlli, e hanno la sopravvivenza paragonabile al momento della raccolta dei tessuti, fino a 6 mesi dopo l&#39;intervento chirurgico. L&#39;impatto fisiologico di questo intervento chirurgico previsto per essere minimo, perché 1) le papille gustative extraorali trasportati sulla barbi si trovano anche in molte altre parti del dell&#39;epitelio pesci, tra cui le labbra, le guance e la testa 5, e 2) papille gustative di differenziazione appaiono il barbo rigenerante entro 72 ore (LeClair et al., dati non pubblicati). Questo rende il mascellare barbi un sistema mini-invasivo per studiare la guarigione delle ferite, rivascolarizzazione, e reinnervazione nel contesto di un vertebrato adulto. Dopo l&#39;induzione chirurgica della rigenerazione, barbi possono essere raccolti ad intervalli per la misurazione morfometrica e / o l&#39;analisi microscopica dei tessuti fissi. Per comodità, il mascellare barbi è circa la lunghezza (2-3 mm) e diametro (100-200 mm) di un embrione di pesce zebra, facilitando l&#39;applicazione di molti protocolli standard, tra cui l&#39;istologia paraffina, criosezionamento, con tutto il montaggio immunoistochimica, ed in situ ibridazione. Prese insieme, queste caratteristiche rendono il mascellare barbi altamente fattibile modello in vivo per studiare la riparazione dei tessuti e la rigenerazione.

Microscopio Attrezzature Un microscopio stereo con dissezione trasmessa e incidente in fibra ottica di illuminazione è necessaria per clipping barbi e l&#39;incorporamento di agar. Barbel Clipping <ul><li> Pesce sistema idrico </li><li> 2 zebrafish incrocio serbatoi </li><li> MS-222 (3-etil amminobenzoato metanosolfonato; chimica Sigma # E10521-10G) </li><li> sterili da 120 mm piastra Petri </li><li> tovaglioli di carta bagnati </li><li> spatola metallica smussata </li><li> Dumont # 55 Bio Inox Pinza (Strumenti Scienza Belle # 11255-20) </li><li> Mini-Vännäs molla forbici (Strumenti Scienza Belle # 15000-00) </li><li> blu di metilene agente antimicotico (Dott. Foster &amp; Smith # CD-905781) </li><li> piccolo acquario a rete </li></ul> Raccolta dei tessuti e l&#39;incorporamento di agar <ul><li> Paraformaldeide 4% in 1x PBS (PF-PBS), fino aliquotati in 50 mL conica e congelati a -20 ° C usare </li><li> 1x PBS (pH 7,27-6) </li><li> 250 ml di vetro fiasco </li><li> Agarosio al 2% in acqua distillata </li><li> standard di piccole gel elettroforesi su rig (dimensioni del gel = ~ 10 cm quadrati) </li><li> piccolo campione pettine a denti elettroforesi (pettine formato 4 x 1,5 mm) </li><li> acqua bagno caldo (50-60 ° C) </li><li> laboratorio nastro </li><li> nero smaltato perni insetti, dimensioni 000 (Strumenti di scienze Belle # 26000-25) </li><li> 1-2 titolari pin (strumenti Scienza Belle # 26016-12) </li><li> Da 9 pollici in vetro pipetta Pasteur </li><li> pipetta a bulbo o della pompa </li><li> laboratorio di tessuti </li><li> etichette di carta di piccole </li><li> (Opzionale) scala di calibrazione stampato </li><li> tovaglioli di carta bagnati </li><li> zip di chiusura sacchetto di plastica </li><li> bisturi / lama di rasoio (per tagliare blocchi di agar) </li></ul>

metodi per lo studio del mascellare zebrafish barbel

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbi sono annessi cutanei sensoriali si trovano in pesci, rettili e anfibi. Il pesce zebra, Danio rerio, sviluppa due paia di barbigli: un paio nasale corta e un paio più mascellare. Barbel tessuto contiene cellule di origine ectodermica, e l&#39;origine mesodermica cresta neurale, incluse le cellule della pelle, ghiandole, papille gustative, melanociti, vasi circolatori e nervi sensoriali. Diversamente dalla maggior parte dei tessuti adulti, il mascellare barbi è otticamente chiaro, che ci permette di visualizzare lo sviluppo e la manutenzione di questi tipi di tessuto per tutto il ciclo di vita. Questo video mostra lo sviluppo iniziale del mascellare barbi (inizio circa un mese dopo la fecondazione) e dimostra un protocollo chirurgico per indurre la rigenerazione in appendice adulti (&gt; 3 mesi dopo la fecondazione). In breve, il barbo mascellare sinistro di un pesce anestetizzato è elevata con una pinza sterile, appena distalmente al bordo caudale della mascella. Un bene, forbici sterili primavera è posizionato contro la pinza per tagliare l&#39;albero barbi a questo livello, che istituisce un punto di riferimento anatomico per il piano di amputazione. Crescita rigenerativa può essere misurata rispetto a questo piano, e rispetto al controlaterale barbo. Tessuto Barbel rigenera rapidamente, raggiungendo la ricrescita massimo entro 2 settimane dalla lesione. Tecniche di analisi del rigenerato barbi includono la dissezione e l&#39;incorporamento di coppie di barbigli (rigenerare e controllo) nei pozzetti di un gel elettroforesi standard di DNA. I campioni sono opportunamente integrati fotografato allo stereomicroscopio per la morfologia e la morfometria lordo, e può essere conservato per settimane prima di applicazioni a valle come istologia paraffina, criosezionamento, e / o immunoistochimica montare tutto. Questi metodi stabilire il barbi mascellare come un romanzo nel sistema del tessuto in vivo per lo studio della capacità rigenerativa di più tipi di cellule nel contesto genetico di zebrafish.

Il pesce zebra mascellare barbi è un organo di senso tegumentario contenente ectodermica, mesodermica e derivati ​​della cresta neurale. È importante sottolineare che il barbo adulti in grado di rigenerare dopo l&#39;amputazione prossimale. Questo video presenta mascellare sviluppo barbi e dimostra un protocollo chirurgico per indurre la rigenerazione, seguita dalla raccolta di immagini, l&#39;incorporamento ea valle dei campioni barbo.

Metodi per lo studio del mascellare Zebrafish Barbel

I barbigli sono appendici sensoriali cutanee presenti in pesci, rettili e anfibi. Il pesce zebra, Danio rerio, sviluppa due paia di barbigli: un paio nasale corto...

Le marbles sono una collezione eterogenea di strutture sensoriali presenti negli anfibi, nei rettili e nei pesci. Il pesce zebra sviluppa due paia di marbles, un paio nasale più piccolo e un paio mascellare più grande. Questi ap-pendici trasparenti possono essere utilizzati per studiare lo sviluppo, il mantenimento e la rigenerazione di diversi tipi cellulari del pesce zebra.Questo video introduce lo sviluppo del marmo mascellare e dimostra un protocollo chirurgico per indurre la rigenerazione. Le barbe vengono raccolte alcuni giorni o settimane dopo, seguite da dissezione e inclusione dei rigenerati e dei controlli. Ciao, sono Elizabeth LeClair del LeClair Lab della DePaul University e sono Ya Chesky della Northwestern University Fried of Medicine e del Children's Memorial Research Center.Oggi vi mostreremo alcuni procedimenti per lo studio del marmo mascellare del pesce zebra. Utilizziamo questi procedimenti per studiare la crescita e lo sviluppo del marmo del pesce zebra. Cominciamo dunque.Circa da 30 a 40 giorni dopo la fecondazione, il barbiglio mascellare appare come un'espansione epiteliale trasparente situata nell'angolo ventrale posteriore della mascella. Con la maturazione del pesce zebra, il barbiglio si allunga formando un ap pendice sottile simile a un baffo, lungo diversi millimetri. Il barbiglio maturo contiene diversi tipi cellulari importanti, tra cui cellule pigmentate, cellule ghiandolari, calici gustativi, vasi circolatori e nervi mielinizzati.Il vantaggio principale è che il barbiglio mascellare è trasparente in tutte le fasi del suo sviluppo. Come altri organi del pesce zebra, il barbiglio mascellare può rigenerarsi dopo un'amputazione prossimale. In questa sezione, illustriamo una procedura per recidere il barbiglio alla base della mascella. Questo potrebbe anche essere chiamato un'ectomia unilaterale. Nel giorno dell'intervento, preparare due piccoli contenitori di acqua per pesci, uno per l'anestesia e uno per il recupero. Il contenitore per l'anestesia contiene trica allo 0,015% tamponata a pH 7,0.Nell'acqua per pesci, il contenitore di recupero contiene pesci, acqua e una goccia di blu di metilene per controllare le infezioni fungine. Anestetizzare da uno a tre pesci zebra adulti per immersione nel contenitore con trica, osservando fino a quando i movimenti nuotati cessano e la ventilazione branchiale diventa lenta e regolare. A seconda delle dimensioni del pesce, l'anestesia completa può richiedere da due a cinque minuti.Utilizzare una rete da pesce per trasferire i pesci su un pezzo di carta assorbente bagnata all'interno di una piastra di Petri. Con una spatola smussata, disporre i pesci in modo che siano paralleli tra loro. Con il lato laterale sinistro rivolto verso l'alto, piegare una parte della carta assorbente sopra i pesci per mantenerli umidi.Successivamente, osservare la piastra di Petri al microscopio stereoscopico utilizzando una luce incidente a basso angolo per illuminare la testa. Mettere a fuoco la base del marmo mascellare sinistro utilizzando pinzette fini. Afferrare saldamente l'asta del marmo appena al di là del margine della mascella.Sollevare il frammento di tessuto e inserire un paio di forbici a punta fine appena prossimalmente alla pinza per garantire stabilità. Le forbici possono toccare la pinza oppure, in alternativa, il fondo della piastra di Petri. Far scorrere le lame delle forbici lungo l'asse del frammento fino a quando il bordo tagliente si avvicina al margine della mascella.Tagliare attraverso l'asse del marmo e rimuovere il marmo amputato. Questo tessuto può essere fissato e analizzato separatamente. Dopo l'intervento chirurgico, trasferire il pesce nel serbatoio di recupero.Lasciare che il pesce si riprenda per diverse ore fino alla notte successiva, quindi restituire il pesce al sistema di allevamento. Attendere da una a due settimane affinché avvenga la rigenerazione dei barbi. Nella prossima sezione mostreremo come preparare il tessuto fisso di marmo per l'analisi.Questa procedura inizia con le biglie che sono state raccolte e fissate giorni, settimane o mesi dopo l'intervento chirurgico. Sciacquare il tessuto fissato in una soluzione salina tamponata e dissezionare la biglia rigenerata dal lato sinistro della testa. Non dimenticare la barba destra, che funge da controllo per la conservazione temporanea.Trasferire con pipetta ogni coppia corrispondente di biglie in una goccia di soluzione salina su una piastra di Petri. Coprire con il coperchio e lasciare in banco mentre si procede. Preparare il gel riscaldando 150 millilitri di agarosio al 2% fino a completa dissoluzione.Equilibrare la soluzione in un bagno d'acqua a 50-60 gradi Celsius. Successivamente, assemblare un apparato standard per elettroforesi su gel e aggiungere da uno a quattro dentini piccoli al campione. Versare l'agarosio fuso nel modello del gel su una superficie livellata, aggiungendone appena sufficiente per formare dei pozzetti molto poco profondi.Riportare immediatamente gli aghi rimanenti nel bagnomaria caldo. Inserire una lunga pipetta di vetro Pastor in modo che la pipetta raggiunga la stessa temperatura degli aghi. Dopo che il gel si è raffreddato, rimuovere i pettini e successivamente lo stampo del gel.Per fissare saldamente il gel, applicare del nastro adesivo da laboratorio del colore preferito su entrambi i lati. Il nastro deve estendersi di alcuni millimetri al di sopra della superficie dell'agarosio in modo che successivamente sia possibile aggiungere altro agarosio. Posizionare lo stampo del gel sul piano di un microscopio stereoscopico. Ingrandire una pozzetta vuota e metterne a fuoco i bordi.Con una pipetta, trasferire le biglie dalla piastra di Petri sulla superficie del gel adiacente al pozzetto utilizzando manici dotati di spilli da insetto piegati. Trascinare le biglie all'interno del pozzetto e spingerle sul fondo. Allineare le manubri in posizione parallela tra loro e lungo i bordi longitudinali del pozzetto. Prima dell'inclusione, utilizzare una pipetta fine o un fazzoletto da laboratorio per rimuovere il liquido in eccesso.Utilizzando la pipetta di vetro riscaldata, aggiungere delicatamente dell'agarosio fuso fresco intorno al tessuto. Effettuare gli ultimi aggiustamenti prima che l'agarosio si solidifichi e non riempire eccessivamente la pozzetta. Registrare il numero del campione aggiungendo una piccola striscia di carta numerata nelle vicinanze.Dopo aver incorporato tutti i campioni, livellare la superficie superiore del gel versando uno strato sottile di aros sulla parte superiore. Utilizzarne il meno possibile in modo che il gel rimanga trasparente per la fotografia. Una volta che il gel si è indurito, può essere fotografato al microscopio stereoscopico per registrare le dimensioni e la forma di ciascuna coppia di sfere e raccogliere misurazioni morfometriche per ulteriori analisi.Si possono ritagliare blocchi di agar contenenti coppie corrispondenti di palline di vetro dal gel utilizzando un bisturi o una lametta. Questi possono quindi essere processati per istologia in paraffina o per criosezionamento mediante metodi standard. In alternativa, singole palline di vetro possono essere dissezionate dall'agar con aghi fini risciacquati in acqua e successivamente processate per altre applicazioni a valle, come immunohistochimica in toto o microscopia confocale.Infine, l'intero gel può essere sigillato in un sacchetto e conservato in frigorifero. I campioni si conservano per diverse settimane. Vi abbiamo appena mostrato come osservare e analizzare il barbiglio mascellare in via di sviluppo e in rigenerazione.Si tratta di un sistema nuovo nel pesce zebra, quindi c'è molto da scoprire. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Metodi per lo studio del mascellare Zebrafish Barbel

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