Una tecnica di visualizzare contemporaneamente Virus specifiche cellule CD8 + T e cellule infettate da virus In situ

Combinando l'ibridazione in situ e la colorazione con tetra in una tecnica nota come ISTH, è possibile determinare il numero relativo e le relazioni spaziali tra le cellule effettrici immunitarie specifiche dell'antigene virale e le cellule e i tessuti infettati viralmente. L'ISTH inizia incorporando tessuto fresco infetto da SIV in agros. Il tessuto viene tagliato in sezioni spesse 200 micron utilizzando un vibrato e colorato per l'antigene virale.

Otto cellule positive CD specifiche utilizzando tetrameri MHC marcati con C. Dopo il congelamento, queste sezioni di colorazione vengono ulteriormente tagliate in sezioni spesse otto micrometri utilizzando un criostato e viene eseguita l'ibridazione in situ per localizzare le cellule infettate viralmente. La microscopia confocale viene utilizzata per visualizzare le sezioni a doppia colorazione e, infine, ricostruire le sezioni spesse originali per rivelare la relazione tra l'effettore immunitario e le cellule bersaglio.

L'utilizzo di questa procedura per esaminare l'infezione precoce da SIV si è dimostrato un buon predittore della gravità della malattia che ne deriva. Ciao, sono Chinen Lee dell'albero di laboratorio di Ashley HA nel Dipartimento di Microbiologia dell'Università del Minnesota. Sono Pam Skinner, assistente professore presso il Dipartimento di Scienze Biomediche Veterinarie dell'Università del Minnesota.

Oggi vi mostreremo una procedura per l'ibridazione interna all'istituto o ISTH in breve. Oltre a utilizzare la colorazione inci teer combinata con l'ibridazione inci come stiamo dimostrando oggi, utilizziamo anche abitualmente la colorazione inci teer combinata con l'immunoistochimica per determinare la posizione, l'abbondanza e il profilo di espressione proteica di otto cellule T CD antigene specifiche in situ u. Ad assisterci oggi con la colorazione in situ con le sezioni spesse saranno i Dr.Heon Kim e Terry Matala e ad assisterci con una preparazione di sezioni sottili e l'ibridazione in situ sarà Quindi iniziamo.

Per iniziare questa procedura, raffreddare il bagno Vibram contenente PBSH sterile a zero a due gradi Celsius. Impostare l'angolo della lama del vibratore su 27 gradi. Quando possibile, mantenere i fazzoletti freschi al fresco sul ghiaccio e iniziare la procedura entro 24 ore dal prelievo dei fazzoletti.

Al fine di ridurre al minimo il raffreddamento della degradazione, il vibram facilita anche il taglio di un tessuto fresco, tagliare via il tessuto connettivo e tagliare il campione con il bisturi in piccoli pezzi e mettere i pezzi in una barchetta di siero di latte e coprire con il 4% di fusione bassa. Gli agros in PBS si sono fusi a circa 40 gradi Celsius. Assicurati che il fazzoletto sia a contatto con il fondo del piatto e spingi i pezzi di tessuto verso il basso se galleggiano, solidificandoli sul ghiaccio per tre o cinque minuti.

Qui viene utilizzato il tessuto della milza, ma anche i linfonodi, la vagina, la cervice, l'utero o altri tessuti freschi possono essere utilizzati con un bisturi. Tagliare gli agros attorno al tessuto e con una pinza trasferire con cura il tessuto incorporato nell'agros al blocco di tessuto. Continuare rivestendo un blocco di tessuto Vibram con colla Loctite.

Non spostare il pezzo di tessuto una volta che è stato posizionato sul blocco di tessuto. Lasciate asciugare per circa 10 minuti con ghiaccio. Quindi, montare il blocco di tessuto nel vibratore e tagliare il tessuto in sezioni spesse 200 micrometri utilizzando una velocità di avanzamento molto lenta e un'ampiezza relativamente elevata.

Utilizzare un pennello per trasferire le sezioni tagliate in una camera tissutale specializzata situata nel pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti preriempita con un millilitro di PBSH refrigerato. Inserire fino a quattro sezioni di tessuto in ciascuna camera tissutale. Etichettare i campioni e fissare il coperchio alla piastra con un elastico per colorare le sezioni di tessuto per le cellule T virali specifiche.

I tetrameri coniugati ZI vengono prima diluiti in tampone bloccante a nwt 0,5 microgrammi per millilitro. La soluzione viene pipettata in una piastra a 24 pozzetti a un millilitro per pozzetto. Il tessuto appena tagliato viene trasferito sulla piastra nelle camere tissutali e viene lasciato oscillare per una notte a quattro gradi Celsius.

Mantenere un pozzetto vuoto tra le camere tissutali contenenti campioni diversi per evitare la contaminazione incrociata delle soluzioni nelle fasi successive. In questa fase si possono aggiungere anticorpi diretti contro proteine extracellulari o di superficie cellulare. Per il lavaggio, preparare una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti contenente PBSH refrigerato dopo l'incubazione primaria.

Lavato due volte trasferendo le camere tissutali su una piastra preriempita per 20 minuti ogni volta, assicurarsi di drenare la maggior parte del liquido dalle camere tissutali prima del trasferimento. Inoltre, non gocciolare il contenuto di un campione in un altro quando si spostano le camere tissutali e monitorare le sezioni nelle camere tissutali per assicurarsi che non si attacchino ai lati. Fissare le sezioni con paraldeide fresca al 4% in PBS per due ore a temperatura ambiente dopo il fissaggio.

Lavato due volte con PBSH freddo per cinque minuti ogni volta per amplificare il segnale dai tetrameri. Incubare le sezioni con anticorpi anti-fitzy di coniglio in un rapporto da uno a 10.000 in tampone bloccante per uno o tre giorni. In questa fase, si possono aggiungere anticorpi contro gli epitopi intracellulari.

Assicurarsi di permealizzare le cellule e bloccare i siti aspecifici prima dell'aggiunta dell'anticorpo. Il recupero dell'antigene può essere necessario anche dopo la seconda lunga incubazione destinata ad amplificare il segnale. Lavare le sezioni in PBSH tre volte per almeno 20 minuti e fino a diverse ore ogni volta.

Eseguire un'incubazione finale con anticorpi marcati in fluorescenza appropriati. Ad esempio, si può usare capra anti coniglio SI tre per legare gli anticorpi anti-fitzy del coniglio per rendere le cellule della colorazione del tetramero fluorescenti rosse. Se gli anticorpi di topo sono stati utilizzati per contrastare le proteine di interesse, come il CD otto, per visualizzare le cellule T killer, si può usare la capra anti-US Alexa 488 per legarsi agli anticorpi di topo e far sì che le cellule di colorazione degli anticorpi emettano fluorescenza, le diluizioni verdi di ciascun anticorpo devono essere determinate empiricamente.

Incubare da uno a tre giorni, mantenere le sezioni protette dalla luce avvolgendo le piastre e la carta stagnola durante questa incubazione e successivamente, quando la luce disseta la flora. Infine, fissare nuovamente le sezioni per fissare i tetrameri e gli anticorpi in posizione. Lavare e montare su un vetrino da microscopio con gelatina glicerica contenente quattro milligrammi per millilitro di gallato con profilo N per la conservazione a meno 20 gradi Celsius fino alla preparazione di sezioni sottili per l'ibridazione in situ.

Le sezioni di colorazione del tetramero in situ possono ora essere analizzate con un microscopio confocale al fine di determinare la localizzazione, l'abbondanza e il pattern di espressione proteica del CD antigene-specifico: otto cellule T positive nell'immagine mostrata, sezioni di tessuto della milza da un recesso infetto da SIV, il meac è stato colorato con tetrameri gag per marcare il CD specifico per SIV, otto cellule T positive, anticorpi CD 20 e CD tre anticorpi. Poiché i contatori, la colorazione con anticorpi andrà persa nel passaggio successivo. È importante analizzare i tetrameri in situ prima di procedere.

Iniziare la procedura di sezionamento sottile riscaldando le sezioni spesse 200 micron a 70 gradi Celsius per cinque minuti su un blocco termico per staccare le sezioni spesse dal vetrino. Una volta staccate le sezioni, incorporarle nell'OCT su ghiaccio secco riempiendo prima il fondo dello stampo di plastica con OCT. Quindi posizionare il fazzoletto sopra l'OCT e coprirlo con OCT.

Utilizzare un criostato per tagliare sezioni spesse otto micron dalle sezioni incorporate nell'OCT e far aderire le sezioni di otto micron ai vetrini silosizzati. I vetrini possono quindi essere conservati a meno 80 gradi Celsius in una scatola sigillata per la successiva ibridazione in situ. L'ibridazione standard in situ viene utilizzata per rilevare le cellule infettate viralmente tramite sonde costali specifiche per virus marcate S 35.

La procedura include anche il rivestimento di sezioni con emulsione di binari nucleari e slitte di montaggio. In un mezzo di filtrazione compatibile con la fluorescenza, le immagini confocali vengono acquisite utilizzando un microscopio confocale BioRad MRC 1000, dotato di un dispositivo di riflessione blu con tubo epi. La colorazione in situ del tetra viene visualizzata utilizzando l'EPI one 605 per il fluorocromo tetra rosso e l'EPI 2 522 DF 32 per il fluorocromo otto CD verde per l'ibridazione in situ.

Utilizzare l'EPI two blue reflection per i grani d'argento risultanti dal segnale di ibridazione in situ negli autografi radio sviluppati. Per iniziare l'acquisizione delle immagini, acquisire le immagini da ciascuna sezione da sinistra a destra e dall'alto verso il basso e assicurarsi di acquisire ogni immagine con una sovrapposizione di circa il 20% con le immagini vicine. Per evitare spazi vuoti nell'immagine del montaggio ricostruita, assegnare un nome a ciascuna immagine in base al fratello e alla colonna in un file Excel.

Al termine della raccolta dei dati dalle diapositive, utilizzare il software di assistenza confocale per proiettare le immagini seriali Z per ciascun canale in un'unica immagine utilizzando una procedura di sette azioni di Photoshop disponibile presso gli autori, unire automaticamente l'immagine proiettata dai tre canali in un'unica immagine RGB. Quindi unisci le immagini unite in livelli per generare un'immagine di montaggio dell'intera sezione. Associa i singoli grani d'argento e la colorazione del tetramero alle cellule del montaggio utilizzando metamorph o Photoshop.

Assegnare le coordinate XY dei centri o OID delle cellule virali RNA positive e tetrameri positive. Esporta i dati OID in file Excel come numeri numerici per ogni cellula e utilizza i dati raccolti nei file Excel per determinare i rapporti tra le cellule effettrici immunitarie o le cellule e e i bersagli virali o le cellule T dal numero totale di cellule tetrameri positive e RNA positive virali nella sezione per catturare le relazioni spaziali tra cellule tetrameri positive e RNA positive. Copia e incolla i rispettivi grafici dai file Excel in un documento Photoshop in Photoshop.

Ridurre l'opacità di un livello per allineare e ridimensionare le griglie in modo che coincidano con il colore, selezionare, quindi copiare e incollare in un nuovo livello. Le posizioni delle cellule blu RNA positive scartano lo strato utilizzato per allineare le griglie e le posizioni delle cellule tetramero positivo e delle cellule RNA virali positive saranno rivelate nell'immagine appiattita. Utilizzando il metodo ISTH mostrato qui, siamo in grado di seguire la risposta immunitaria all'infezione da SIV dopo l'inoculazione intravaginale in questo portale di ingresso e nei tessuti linfatici a cui si diffonde l'infezione.

C'è un gran numero di cellule infette in questi siti tissutali a 10 giorni dopo l'infezione, ma fino a tre giorni dopo, ci sono cellule CD A positive alla colorazione verde, ma non ancora. Cellule tetra positive specifiche SIV colorate in rosso. La risposta immunitaria è quindi troppo tardiva per eliminare l'infezione.

Tuttavia, a tre settimane dall'infezione, è chiaramente visibile una diminuzione delle cellule infette, soprattutto alla porta d'ingresso. Abbiamo usato l'ISTH per dimostrare che l'entità della riduzione era correlata alla vicinanza spaziale e al numero relativo di cellule effettrici immunitarie positive al tetramero. Cellule bersaglio positive N-S-I-V-R-N-A, lo chiamiamo rapporto E/T in vivo.

Le relazioni spaziali sono facilmente visualizzabili utilizzando questo metodo con le cellule effettrici in rosso e i bersagli virali in blu in questo linfonodo infetto. Molte cellule effettrici e bersaglio sono nelle immediate vicinanze e ci sono aree in cui molte cellule effettrici circondano una singola cellula positiva S-I-V-R-N-A, mentre in altre aree una cellula positiva S-I-V-R-N-A è isolata. Il rapporto di ETT viene semplicemente calcolato poiché le posizioni delle celle vengono determinate e registrate dai numeri di ciascuna nel file Excel.

Il miglior controllo dell'infezione virale è correlato con un grande eccesso di effettori rossi rispetto ai bersagli verdi di 43 a uno. In questo caso, nella cervice e nella vagina dove è iniziata l'infezione, i rapporti ETT erano più bassi nei linfonodi. La correlazione positiva tra alti rapporti ETT e riduzione della carica virale dal picco indica che una risposta immunitaria più robusta al portale di ingresso si traduce in un migliore controllo dell'infezione.

Vi abbiamo appena mostrato come rilevare simultaneamente le cellule CDAT molto specifiche e la cellula di infezione virale in situ. Questa tecnica ci consente di visualizzare simultaneamente le cellule T antigene specifiche e le cellule infettate da virus nei tessuti. Questa tecnica può essere applicata per valutare il vaccino a base di cellule T positive CD otto e l'altro agente patogeno non di valore e l'interazione tra l'ospite durante l'esecuzione di questa procedura.

È importante mantenere liberi tutti gli RNA dei reagenti prima dell'ibridazione delle intuizioni. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.