Estrazione di DNA ad alta peso molecolare genomico da terreni e sedimenti

Una metodologia per isolare ad alto peso molecolare del DNA genomico e di alta qualità da parte della comunità microbica del suolo è descritta.

Ciao, sono San Lee del laboratorio di Stephen Harlem nel Dipartimento di Microbiologia e Immunologia dell'Università della British Columbia. Oggi vi mostriamo una procedura per la genomica ad alto peso molecolare, l'estrazione del DNA dalla foresta al suolo che è applicabile anche a un'ampia varietà di tipi di suolo e sedimenti. Utilizziamo il DNA genomico ad alto peso molecolare per costruire la libreria di contatori forestali delle comunità microbiche del suolo.

Con queste librerie in mano, possiamo studiare la diversità e il potenziale metabolico delle comunità microbiche che si suddividono tra diversi orizzonti del suolo. Quindi iniziamo. Questo protocollo inizia con la lisi cellulare.

Il primo passo consiste nel completare il tampone denaturante aggiungendo betta mer capto etanolo a una concentrazione dello 0,5%Per ottenere i migliori risultati, preparare la soluzione denaturante fresca ogni volta. In alternativa, utilizzare un tampone di meno di una settimana che è stato mantenuto a quattro gradi Celsius. Per il passaggio successivo, avrai bisogno di un esecutore di azoto liquido e di un'autoclave e di un pestello e spatola da mortaio pre-raffreddati.

Mettere un campione di terreno congelato da due grammi nella malta pre-raffreddata. Aggiungere un millilitro di soluzione denaturante. Quindi aggiungere azoto liquido per coprire completamente il terreno.

Utilizzare un pestello pre-raffreddato per macinare il campione fino a quando le particelle di terreno appaiono polverose e omogenee e il campione inizia a sciogliersi. Quindi aggiungere altro azoto liquido e ripetere la fase di macinazione. Questo completa la fase di lisi cellulare utilizzando una spatola pre-raffreddata.

Trasferire il campione macinato in una provetta conica da 50 millilitri. Tenere il campione in ghiaccio per procedere immediatamente alla fase di estrazione del DNA o conservarlo a meno 80 gradi Celsius. Per l'uso in litri, appena prima di iniziare l'estrazione del DNA, completare il tampone di estrazione aggiungendo bromuro di trimetilammonio hexa deco o CTAB e SDS. Primo.

Controllare se il CTAB è cristallizzato e, in tal caso, scioglierlo a 60 gradi Celsius prima di procedere. Quindi aggiungerlo alla soluzione per una concentrazione totale dell'1%Successivamente, aggiungere la soluzione SDS al 20% a una concentrazione finale del 2%La sospensione lattiginosa. Quella forma è normale.

Una volta aggiunta la SDS, mantenere omogeneo il tampone di estrazione completato conservandolo a 60 gradi Celsius dopo 10-15 minuti. Una volta che il tampone di estrazione è ben sciolto e omogeneo, aggiungere nove millilitri di tampone di estrazione al campione di terreno e agitare brevemente a bassa velocità per mescolare. Incubare il campione con il tampone di estrazione in un forno di ibridazione a 65 gradi Celsius per 40 minuti.

Durante l'incubazione, capovolgere delicatamente le provette ogni 10 minuti o ruotare continuamente le provette alla velocità più bassa del rotore. Durante l'incubazione, la soluzione può apparire leggermente viscosa dopo l'incubazione. Il passo successivo consiste nell'utilizzare l'alcol isoamilico cloroformio per purificare il DNA dal materiale organico nella miscela di lisi.

Iniziare centrifugando il campione per 10 minuti a 1800 Gs a circa 10-14 gradi Celsius nella cappa, raccogliere il DNA contenente surnatante facendo scorrere con cautela la punta della pipetta lungo il lato della provetta, evitando lo strato beige sulla parte superiore e lo strato organico sul fondo. Trasferire il surnatante in una provetta pre-raffreddata da 50 millilitri contenente 20 millilitri di alcol ISL cloroformio o successivamente, ripetere il processo di estrazione altre due volte sullo stesso campione. Nel frattempo, tenere l'estratto di DNA e il cloroformio sul ghiaccio nel cappuccio.

Per la seconda estrazione del DNA, tornare alla provetta contenente il pellet di terreno con il tampone di estrazione residuo e aggiungere altri cinque millilitri di tampone di estrazione. Mescolare delicatamente con una punta da un millilitro per mescolare e agitare brevemente per risospendere il pellet come prima. Incubare a 65 gradi Celsius questa volta per 10 minuti.

Quindi centrifugare a 1800 Gs per 10 minuti. A circa 10-14 gradi Celsius nella cappa, trasferire il surnatante nel tubo contenente cloroformio, alcol isoamilico o cloroformio i a a e il surnatante dell'estrazione precedente. Ripetere l'intero processo di estrazione ancora una volta per estrarre quanto più DNA possibile dal campione di terreno.

Dopo aver completato un totale di tre estrazioni sul campione di terreno, agitare molto delicatamente la provetta contenente il surnatante e il cloroformio raccolti su una piastra rotante a 1,25 RRP m per 10 minuti Dopo questa fase di miscelazione, centrifugare la provetta a 1800 Gs per 20 minuti a circa 10-14 gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, trasferire con cura la fase acquosa in una nuova provetta da ultra centrifuga, lasciando da uno a due millilitri di SNAT per evitare di disturbare l'interfaccia tra la fase acquosa e quella organica. Ora per precipitare il DNA aggiungere 0,6 millilitri di alcol isopropilico.

Per ogni millilitro di surnatante raccolto, capovolgere delicatamente i tubi alcune volte per mescolare. A questo punto, potresti essere in grado di vedere il DNA precipitare in lunghi fili. Quindi incubare il DNA con l'isopropanolo per 30 minuti a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, è il momento di pellettare il DNA mediante centrifugazione, segnare un angolo della provetta mentre lo si inserisce nella centrifuga in modo da sapere dove aspettarsi il pellet di DNA Girare a 16.000 GS per 20 minuti a 20-25 gradi Celsius dopo la centrifugazione, rimuovere l'alcol isopropilico mediante decantazione e/o aspirazione sotto vuoto. Fare attenzione a non perdere il pellet di DNA, che varia in dimensioni da appena visibile a nove millimetri di larghezza, a seconda dell'efficienza di estrazione e della biomassa nei campioni di terreno, asciugare il pellet di DNA a temperatura ambiente per cinque-20 minuti. Fare attenzione a non asciugare eccessivamente quando il pellet è asciutto.

Risospendere il DNA in 200-400 microlitri di te. Mescolate picchiettando delicatamente. Trasferire la soluzione di DNA in una provetta da 1,5 millilitri.

Mantieni il DNA a quattro gradi Celsius durante la notte. Al fine di dissolvere completamente il DNA una volta che il DNA è stato estratto dal campione di terreno, i passaggi rimanenti per il controllo della concentrazione e dell'integrità del DNA del campione sono procedure standard, descritte in dettaglio in un altro protocollo JoVE del laboratorio Hallam. Determina la concentrazione di DNA utilizzando il metodo che preferisci.

Verificate anche l'integrità del DNA ad alto peso molecolare prelevando da 10 a 20 microlitri del vostro campione di DNA utilizzando l'elettroforesi su gel a campo pulsato o PFGE. La dimensione media del DNA dovrebbe essere di 36 kilobasi o superiore, a seconda dell'applicazione a valle. Procedere alla successiva fase di centrifugazione a gradiente di cloruro di cesio in alternativa, il DNA può essere conservato a meno 20 gradi Celsius o meno 80 gradi Celsius prima dell'ultracentrifugazione.

Il passo successivo consiste nell'utilizzare la centrifugazione in gradiente di cloruro di cesio per purificare ulteriormente il DNA rimuovendo le impurità, seguendo il concentrato di centrifugazione in gradiente di cloruro di cesio e purificare ulteriormente il DNA utilizzando i dispositivi di filtraggio centrifugo AmCon e MicroCon. La centrifugazione in gradiente di cloruro di cesio è la chiave per ottenere un DNA di alta qualità ed è descritta in dettaglio in un altro protocollo JoVE del laboratorio Hallam. Dopo aver eseguito le fasi di centrifugazione e concentrazione in gradiente di cloruro di cesio, controllare la concentrazione di DNA utilizzando il metodo di tua scelta.

Successivamente, controlla ancora una volta l'integrità del DNA ad alto peso molecolare prelevando un piccolo campione di DNA utilizzando PFGE. La quantità totale di DNA genomico isolato da due grammi di terreno forzato varia da 10 a 180 microgrammi, come mostrato nell'esecuzione del gel prima e dopo l'ultracentrifugazione con cloruro di cesio. L'intervallo di dimensioni del DNA isolato di solito varia tra 40 e 60 kilobasi, mostrato qui è un cromatogramma di campioni di DNA genomico prima e dopo l'ultracentrifugazione con cloruro di cesio.

Questo passaggio migliora la purezza del DNA aumentando il rapporto due 60 su due 80 da 1,3 a 1,6 prima a 1,8 a 1,9 dopo. Inoltre, l'assorbanza di picco a 230 nanometri, il che implica che la contaminazione da acido umico è stata ridotta con successo dopo la centrifugazione. Ti abbiamo appena mostrato come isolare il DNA genomico ad alto peso molecolare dalle comunità microbiche del suolo.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordarsi di preparare il tampone di estrazione e denaturazione seguendo esattamente le istruzioni. E fai attenzione a non raggiungere il tuo palato del DNA dopo la precipitazione dell'alcol isopropilico. Quando si recupera la banda di DNA dopo la centrificazione del gradiente di cloruro.

Non dimenticare di sciacquare la siringa con il TE per massimizzare il recupero del DNA. E infine, per controllare la quantità e la qualità del DNA isolato in tutti i passaggi suggeriti. Quindi questo è tutto.

Grazie per l'attenzione e buona fortuna con il tuo esperimento.