Estrazione di DNA ad alta peso molecolare genomico da terreni e sedimenti

Ciao, sono San Lee del laboratorio di Stephen Harlem del Dipartimento di Microbiologia e Immunologia dell'Università della British Columbia. Oggi vi mostriamo un procedimento per l'estrazione di DNA genomico ad alto peso molecolare da suolo forestale, applicabile anche a una vasta gamma di tipi di suolo e sedimenti. Utilizziamo il DNA genomico ad alto peso molecolare per costruire la libreria metragenomica delle comunità microbiche del suolo.

Con queste librerie a disposizione, possiamo studiare la diversità e il potenziale metabolico delle comunità microbiche suddivise tra diversi orizzonti del suolo. Cominciamo dunque. Questo protocollo inizia con la lisi cellulare.

Il primo passo consiste nel completare il buffer denaturante aggiungendo il beta mercaptoetanolo fino a una concentrazione dello 0,5%. Per ottenere i migliori risultati, preparare la soluzione denaturante fresca ogni volta. In alternativa, utilizzare un buffer di età inferiore a una settimana, conservato a quattro gradi Celsius. Per il passaggio successivo, sarà necessario disporre di azoto liquido, un autoclave e un mortaio, pestello e spatola preraffreddati.

Posizionare un campione di suolo congelato di due grammi nel mortaio preraffreddato. Aggiungere un millilitro della soluzione denaturante. Quindi aggiungere azoto liquido fino a coprire completamente il suolo.

Utilizzare un pestello precedentemente raffreddato per macinare il campione fino a quando le particelle del suolo appaiono polverose e omogenee e il campione inizia a fondersi. Aggiungere quindi ulteriore azoto liquido e ripetere l'operazione di macinazione. Questo completa il passaggio di lisi cellulare utilizzando una spatola precedentemente raffreddata.

Trasferire il campione macinato in un tubo conico da 50 millilitri. Mantenere il campione sul ghiaccio per procedere immediatamente al passaggio di estrazione del DNA oppure conservarlo a meno 80 gradi Celsius. Per l'uso, appena prima di iniziare l'estrazione del DNA, completare il tampone di estrazione aggiungendo bromuro di esadeciltrimetilammonio o CTAB e SDS.

Verificare se il CTAB è cristallizzato e, in caso affermativo, scioglierlo a 60 gradi Celsius prima di procedere. Quindi aggiungerlo alla soluzione per una concentrazione finale dell'1%. Successivamente, aggiungere la soluzione di SDS al 20% per ottenere una concentrazione finale del 2%. La sospensione lattiginosa che si forma è normale.

Dopo aver aggiunto il SDS, mantenere l'omogeneità del tampone di estrazione conservandolo a 60 gradi Celsius per 10-15 minuti. Una volta che il tampone di estrazione è completamente disciolto e omogeneo, aggiungere nove millilitri di tampone di estrazione al campione di suolo e vortexare brevemente a bassa velocità per mescolare. Incubare il campione con il tampone di estrazione in un fornetto di ibridazione a 65 gradi Celsius per 40 minuti.

Durante l'incubazione, capovolgere delicatamente i tubi ogni 10 minuti oppure ruotarli continuamente alla velocità più bassa del rotore. Durante l'incubazione, la soluzione potrebbe apparire leggermente viscosa al termine dell'incubazione. Il passaggio successivo consiste nell'utilizzare cloroformio-isoamilo alcol per purificare il DNA dai materiali organici presenti nella miscela di lisi.

Iniziare centrifugando il campione per 10 minuti a 1800 G a circa 10-14 gradi Celsius in cappa, raccogliere il soprannatante contenente il DNA facendo scivolare attentamente la punta della pipetta lungo il lato del tubo, evitando lo strato beige in superficie e lo strato organico in fondo. Trasferire il soprannatante in un tubo da 50 millilitri preraffreddato contenente 20 millilitri di alcol ISL cloroformio o i a a; successivamente, ripetere il processo di estrazione altre due volte sullo stesso campione. Nel frattempo, mantenere l'estratto di DNA e il cloroformio i a a sul ghiaccio in cappa.

Per la seconda estrazione del DNA, tornare al tubo contenente il pellet di suolo con il tampone di estrazione residuo e aggiungere altri cinque millilitri di tampone di estrazione. Mescolare delicatamente con una punta da un millilitro e vortexare brevemente per risospendere il pellet come in precedenza. Questa volta, incubare a 65 gradi Celsius per 10 minuti.

Quindi centrifugare a 1800 G per 10 minuti. A circa 10-14 gradi Celsius in cappa, trasferire il soprannatante nel tubo contenente cloroformio, alcol isoamilo o cloroformio i a a e il soprannatante dell'estrazione precedente. Ripetere l'intero processo di estrazione un'altra volta per estrarre la maggior quantità possibile di DNA dal campione di suolo.

Una volta completate un totale di tre estrazioni sul campione di suolo, agitare molto delicatamente il tubo contenente il sopranatante raccolto e il cloroformo su una piastra rotante a 1,25 giri al minuto per 10 minuti. Dopo questa fase di mescolamento, centrifugare il tubo a 1800 ×g per 20 minuti a una temperatura compresa tra 10 e 14 gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, trasferire con attenzione la fase acquosa in un nuovo tubo per ultracentrifuga, lasciando uno o due millilitri di sopranatante al fine di evitare di disturbare l'interfaccia tra la fase acquosa e quella organica. A questo punto, per precipitare il DNA, aggiungere 0,6 millilitri di alcol isopropilico.

Per ogni millilitro di soprannatante raccolto, capovolgere delicatamente i tubi alcune volte per mescolare. A questo punto, si potrebbe osservare il precipitato di DNA che si forma in lunghi filamenti. Incubare quindi il DNA con l'isopropanolo per 30 minuti a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, è il momento di formare il pellet del DNA mediante centrifugazione: contrassegnare un angolo del tubo mentre lo si inserisce nella centrifuga, in modo da sapere dove aspettarsi il pellet di DNA. Centrifugare a 16.000 ×g per 20 minuti a una temperatura compresa tra 20 e 25 gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, rimuovere l'alcol isopropilico per decantazione o mediante aspirazione sotto vuoto. Fare attenzione a non perdere il pellet di DNA, il cui diametro può variare da appena visibile fino a nove millimetri, a seconda dell'efficienza dell'estrazione e della quantità di biomassa presente nei campioni di suolo. Lasciare essiccare il pellet di DNA a temperatura ambiente per cinque-venti minuti, avendo cura di non farlo seccare eccessivamente. Quando il pellet è secco,

Risospendere il DNA in 200-400 microlitri di te. Mescolare con lievi colpetti. Trasferire la soluzione di DNA in una provetta da 1,5 millilitro.

Mantenere il DNA a quattro gradi Celsius durante la notte. Per sciogliere completamente il DNA una volta estratto dal campione di suolo, i passaggi rimanenti per verificare la concentrazione e l'integrità del DNA sono procedure standard, descritte in dettaglio in un altro protocollo JoVE del laboratorio Hallam. Determinare la concentrazione del DNA utilizzando il metodo a scelta.

Verificare inoltre l'integrità del DNA ad alto peso molecolare eseguendo l'elettroforesi in campo pulsato o PFGE su 10-20 microlitri del campione di DNA. La dimensione mediana del DNA dovrebbe essere di 36 chilobasi o superiore, a seconda dell'applicazione successiva. Procedere quindi al successivo passaggio di centrifugazione in gradiente di cloruro di cesio; in alternativa, il DNA può essere conservato a meno 20 gradi Celsius o a meno 80 gradi Celsius prima dell'ultracentrifugazione.

Il passo successivo consiste nell'utilizzare la centrifugazione su gradiente al cloruro di cesio per purificare ulteriormente il DNA rimuovendo le impurità, seguita dalla concentrazione mediante centrifugazione su gradiente al cloruro di cesio e da un'ulteriore purificazione del DNA utilizzando dispositivi filtranti centrifughi AmCon e MicroCon. La centrifugazione su gradiente al cloruro di cesio è fondamentale per ottenere un DNA di alta qualità ed è descritta in dettaglio in un altro protocollo JoVE del laboratorio Hallam. Dopo aver eseguito i passaggi di centrifugazione su gradiente al cloruro di cesio e di concentrazione, verificare la concentrazione del DNA utilizzando il metodo a scelta.

Successivamente, verificare nuovamente l'integrità del DNA ad alto peso molecolare analizzando un piccolo campione di DNA mediante elettroforesi in campo pulsato (PFGE). La quantità totale di DNA genomico isolato da due grammi di suolo forzato varia da 10 a 180 microgrammi, come mostrato nel gel analizzato prima e dopo l'ultracentrifugazione in cloruro di cesio. L'intervallo di dimensioni del DNA isolato è solitamente compreso tra 40 e 60 chilobasi; qui è riportato un cromatogramma di campioni di DNA genomico prima e dopo l'ultracentrifugazione in cloruro di cesio.

Questo passaggio migliora la purezza del DNA, aumentando il rapporto 260 su 280 da 1,3 a 1,6 prima a 1,8-1,9 dopo. Inoltre, il picco di assorbanza a 230 nanometri, indicativo di una contaminazione da acido umico, è stato efficacemente ridotto dopo la centrifugazione. Vi abbiamo appena mostrato come isolare DNA genomico ad alto peso molecolare dalle comunità microbiche del suolo.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di preparare con precisione il buffer di estrazione e di denaturazione seguendo attentamente le istruzioni. E fare attenzione a non perdere il pellet di DNA dopo la precipitazione con alcol isopropilico. Quando si recupera la banda di DNA dopo la centrifugazione su gradiente di cloruro.

Non dimenticare di risciacquare la siringa con il TE per massimizzare il recupero del DNA. E infine, verifica la quantità e la qualità del DNA isolato in tutti i passaggi suggeriti. Ecco fatto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con il vostro esperimento.