Name: Isolamento e trapianto di cellule staminali emopoietiche (CSE) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 38 s
Description: Impara a purificare e trapiantare cellule staminali emopoietiche a lungo termine in modelli murini. Questa tecnica affina le metodologie per la ricerca sulle terapie con cellule staminali.

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<p class="jove_title"> Totale preparazione del midollo osseo </p><ol><li> Quattro B6 topi sono sacrificati e sezionato per ottenere tibie, femori, dell&#39;anca e della colonna vertebrale. </li><li> Durante la dissezione, le membra e le ossa sono conservate in PBS 2% di FCS inattivato (opzionale 2mM EDA - medio dissezione). </li><li> Le ossa pulite sono schiacciato con mortaio e pestello in media dissezione. Un modo efficace per farlo è quello di schiacciare tibie, femori e fianchi di ogni mouse, quindi 2 spine alla volta. </li><li> La miscela di cellule ottenute da ogni mouse viene tenuto separato e filtrata attraverso un filtro 40μm in un tubo da 50 ml falco. In questo modo, ogni tubo contiene la miscela di cellule ottenute da tutte le ossa delle gambe di un topo, e la metà della miscela ottenuta da 2 spine. In questa fase, il filtro viene utilizzato per separare i residui delle ossa. </li><li> Di solito è consigliabile schiacciare le ossa delle gambe due volte per ottenere bianco (senza midollo osseo) frammenti ossei, ed i frammenti della colonna 2 o 3 volte. </li><li> Riempire i tubi per farli equilibrata, e spin 1200rpm 5 min. </li><li> Aspirare il supernatante e sciogliere il pellet trascinando i tubi sul rack tubo (questo passaggio è importante dopo ogni centrifugazione per ridurre al minimo la formazione di gruppo e la perdita di cellule). Risospendere ogni tubo in 1 ml di PBS 2% FCS (NO EDTA d&#39;ora in poi), se si sta facendo esaurimento lignaggio, o in qualunque altro volume è conveniente per voi. </li></ol><p class="jove_title"> Lineage esaurimento </p><ol><li> Questa procedura consente di eliminare le cellule altamente differenziate e di ottenere una popolazione molto eterogenea di cellule, arricchito di cellule staminali e progenitrici. Se siete ordinamento HSC, questo passaggio di ridurre drasticamente il numero di cellule che devono passare attraverso la separazione delle cellule, riducendo così il tempo di ordinamento e che consente di tipo HSC da un maggior numero di topi, in modo che si può ottenere un maggior numero di HSC in un singolo ordinamento. </li><li> Se avete intenzione di ordinare poi, togliere 50μl di miscela cella (di solito prendere un po &#39;da ogni tubo) per l&#39;ordinamento controlli (senza macchia e SCA1, c-kit, CD48, Flk2 controlli singolo colore). </li><li> Aggiungi 30ml/tube cocktail Lin. Cocktail di lignaggio contiene una varietà di anticorpi, che cambia, purtroppo, un po &#39;da un laboratorio all&#39;altro. Nel laboratorio Scadden, usiamo gli anticorpi contro biotinilated Gr1, Ter119, CD4, CD8, CD3, B220. Loro diluizione finale la colorazione è 1:700. </li><li> Vortex rapidamente per mescolare, e incubare per 15 minuti a 4 ° C. </li><li> Durante l&#39;incubazione, preparare le colonne i magneti e tubi 15ml eluizione sotto le colonne. Degas alcuni PBS utilizzando un filtro steriflip (dovreste vedere bollicine d&#39;aria in movimento verso la superficie della causa di aspirazione a vuoto PBS), ed equilibrare le colonne mediante l&#39;applicazione di 3 ml degasato PBS a ciascuna colonna. </li><li> Il flusso della colonna è di circa 1ml/5min, così ci vogliono circa 15 minuti per avere le colonne pronto all&#39;uso. </li><li> Al termine della incubazione, aggiungere PBS 2% FCS per riempire i tubi e spin down per 5 min a 1200rpm. </li><li> Aspirare il surnatante, allentare il pellet e risospendere in 1 ml / tubo degassificato PBS. </li><li> Se siete ordinamento successivamente, estrarre il midollo osseo totale Lineage ctrl singolo colore colorazione (15 ml, un po &#39;da ogni tubo). </li><li> Aggiungi streptavidina 30ml/tube perline, vortice di mescolare velocemente, e incubare per 15 minuti a 4 ° C. </li><li> Al termine della incubazione, aggiungere 2 ml / tubo di degassificato PBS. Mettere provette di nuovo sotto le colonne, e applicare ogni sospensione a una colonna, filtrando attraverso un filtro 40μm. </li><li> Aggiungere altri 3 ml di PBS degasato a ciascuna provetta per lavarla. Una volta che le colonne sono vuote, si applica di nuovo con lo stesso filtro 40μm. </li><li> L&#39;eluato contiene la miscela di cellule impoverito lignaggio, una popolazione eterogenea arricchito di staminali e cellule progenitrici. Piscina il contenuto dei 4 tubi in 2 tubi. Spin per 5 minuti a 1500rpm. </li><li> Aspirare il surnatante. Il pellet deve essere bianco o prevalentemente bianco. Allentare il pellet e risospendere insieme in 1ml PBS totale del 2% FCS se siete ordinamento più tardi, altrimenti risospendere in qualsiasi volume è conveniente per voi. </li></ol><p class="jove_title"> LKS o lungo termine ordinamento HSC </p><ol><li> Estrarre lignaggio impoverito colorazione ctrl singolo colore (15 ml). Questo vi permetterà di valutare l&#39;efficienza del vostro esaurimento lignaggio. </li><li> La miscela di cellule per ordinare è macchiato nel tubo 15ml. </li></ol><p class="jove_content"> Aggiungi anticorpi: </p><p class="jove_content"><table border="0"><tbody><tr><td> Sca PE-Cy5.5 </td><td> 1: 100 </td><td> 10ml </td></tr><tr><td> Kit APC </td><td> 1:100 </td><td> 10ml </td></tr><tr><td> SA PE-Cy7 </td><td> 1:500 </td><td> 2ml </td></tr></tbody></table></p><p class="jove_content"> Per ordinare HSC lungo termine, anche aggiungere: </p><p class="jove_content"><table border="0"><tbody><tr><td class="jove_content"> CD48 FITC </td><td class="jove_content"> 1:1000 </td><td class="jove_content"> 1 ml </td></tr><tr><td class="jove_content"> Flk2 PE </td><td class="jove_content"> 1:200 </td><td class="jove_content"> 5ml </td></tr&gt; </tbody></table></p><p class="jove_content"> Inoltre, preparare colorazione singolo controlli utilizzando il midollo osseo totale tenuto da parte dopo la dissezione e il totale del midollo osseo colorate lignaggio. Queste colorazioni può essere fatto direttamente in tubi di FACS. </p><p> <em class="jove_content">Assicurarsi di essere al buio!</em> </p><ol><li> Vortex rapidamente per mescolare e incubare a 4 ° C per 20 a 30 minuti, rimescolamento a metà. </li><li> Per lavare via l&#39;eccesso di anticorpi, riempire i tubi con PBS 2% FCS e spin per 5 min a 1500 giri al minuto. </li><li> Rimuovere il surnatante, risospendere tutti i pellet e spostarli in nuovi tubi FACS con tappi filtro. Si potrebbe prendere un po &#39;per le cellule di passare attraverso questi filtri, ed è importante applicare un po&#39; più PBS dopo per lavare il filtro e ridurre al minimo la perdita di cellule. Questo passaggio è necessario per evitare l&#39;intasamento del selezionatore, che è il peggior incubo di ogni utente cell sorter. </li><li> Al momento della consegna il tuo celle per l&#39;impianto di separazione delle cellule, assicuratevi di preparare anche una provetta con PBS 10% HI FCS dove le cellule verranno raccolti. </li><li> Se siete l&#39;ordinamento delle cellule LKS, si ottiene una popolazione eterogenea che contiene a lungo termine e di breve termine ripopolamento progenitori HSC e multipotenti. Una resa media è di 300.000 LKS da 4 topi. </li><li> Se avete usato anche CD48 e Flk2 anticorpi, è possibile separare ciascuna popolazione di HSC lungo termine, HSC a breve termine e MPP. LT-HSC sono la popolazione più rare. Una resa media è di circa 50.000 a 60.000 celle da 4 topi. </li></ol>

isolamento e trapianto di cellule staminali emopoietiche (cse)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolamento e trapianto di cellule staminali emopoietiche (CSE)

<p>Sono Christina Ceso. Sono un'aspirante ricercatrice nel laboratorio di David Den e lavoro sulle cellule staminali ematopoietiche. Oggi procederemo all'isolamento delle cellule staminali ematopoietiche a recupero a lungo termine e le trapianteremo in un topo.</p><p>Iniziamo spruzzando i topi con alcol in modo che, prima di tutto, la zona sia sterilizzata e inoltre il pelo non interferisca con la dissezione. Utilizziamo PBS con siero al 2% per la dissezione. Taglio la pelle della schiena e la tiro verso l'esterno per esporre il tessuto.</p><p>Per isolare la tibia, tengo la tibia con una pinzetta. Taglio il tendine in corrispondenza del ginocchio e taglio i muscoli al di sotto del ginocchio; successivamente recido attraverso il ginocchio in modo che la tibia non sia più collegata al resto dell'arto, quindi tiro per isolarla. Dopodiché tengo la tibia a testa in giù e, con le forbici, separo il piede dalla tibia per ottenere il femore.</p><p>Taglio i muscoli intorno al femore e poi lussato il femore dall'anca. Per isolare l'anca, taglio i muscoli intorno all'osso dell'anca dal lato della coda del topo e quindi stacco l'anca dal corpo. Per isolare la colonna vertebrale, taglio attraverso la coda il più vicin</p>

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Un metodo per analizzare la distribuzione di progenitori midollari ematopoietiche citometria di flusso e per isolare in modo efficiente altamente purificate cellule staminali ematopoietiche (CSE) è descritto. La procedura di isolamento è essenzialmente basata su un arricchimento magnetico di c-kit + e le cellule di separazione delle cellule per purificare CSE per studi cellulari e molecolari.

L&#39;analisi fenotipica e l&#39;isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

L'obiettivo del presente protocollo è quello di isolare il primate non umano CD34+ cellule dal midollo osseo innescato, gene-modificare queste cellule con vettori lentivirali e preparare un prodotto per infusione nell'ospite autologo. La lunghezza di protocollo totale è di circa 48 ore.

Preparazione e modificazione genetica di staminali ematopoietiche Nonhuman Primate e cellule progenitrici

Qui, presentiamo un protocollo per formare con precisione l'endotelio emogenico dalle cellule staminali pluripotenti umane in una condizione senza alimentatore e xeno. Questo metodo avrà ampie applicazioni nella modellazione della malattia e nello screening per i composti terapeutici.

Differenziazione dell'endotelio endogenico dalle cellule staminali pluripotenti umane in una condizione definita senza alimentatore e Xeno

Questo protocollo dimostra l'induzione di un programma emogenico nei fibroblasti dermici umani mediante l'espressione forzata dei fattori di trascrizione GATA2, GFI1B e FOS per generare cellule staminali e progenitrici ematopoietiche.

Riprogrammazione emogenica dei fibroblasti umani mediante l'espressione forzata dei fattori di trascrizione

Questo protocollo consente il mantenimento in vitro di cellule staminali ematopoietiche umane quiescenti imitando il microambiente del midollo osseo utilizzando abbondanti acidi grassi, colesterolo, concentrazioni più basse di citochine e ipossia.

Un metodo di coltura per mantenere le cellule staminali ematopoietiche umane quiescenti

Il presente protocollo descrive una procedura di coltura ottimizzata di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) per l'attecchimento robusto di cellule geneticamente modificate in vivo.

CRISPR/Cas9 Gene Editing di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche per applicazioni di terapia genica

Presentiamo un protocollo passo-passo per l'isolamento di cellule staminali ematopoietiche a lungo termine (LT-HSCs) e HSCs a breve termine (ST-HSCs) utilizzando il sistema reporter Hoxb5.

Metodo di isolamento per cellule staminali ematopoietiche a lungo e breve termine

Presentato qui è un protocollo per avviare, mantenere e analizzare colture di cellule staminali ematopoietiche di topo utilizzando l'espansione ex vivo a base di alcol polivinilico, nonché metodi per manipolarle geneticamente mediante trasduzione lentivirale ed elettroporazione.

<em>Ex Vivo</em> Espansione e manipolazione genetica di cellule staminali ematopoietiche di topo in colture a base di alcol polivinilico

Qui, abbiamo stabilito osteo-organoidi in vivo innescati da scaffold di gelatina caricati con proteina morfogenetica ossea 2 per raccogliere cellule staminali/progenitrici ematopoietiche terapeutiche per la ricostruzione di un sistema ematopoietico e immunitario danneggiato. Nel complesso, questo approccio può fornire una promettente fonte cellulare per le terapie cellulari.

Approccio osteo-organoide in vivo per la raccolta di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche terapeutiche

Qui presentiamo protocolli che consentono l'isolamento di cellule stromali da osso murino, midollo osseo, timo e tessuto timico umano compatibile con la multiomica a singola cellula.

Isolamento delle cellule stromali da organi ematopoietici

Le iniezioni intrafemorali consentono l'attecchimento di un piccolo numero di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC), posizionando le cellule direttamente nella cavità del midollo osseo. Qui descriviamo un protocollo sperimentale di iniezione intrafemorale di HSPC umane in topi immunodeficienti.

Iniezione intrafemorale di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche umane in topi immunocompromessi 

Impara a purificare e trapiantare cellule staminali emopoietiche a lungo termine in modelli murini. Questa tecnica affina le metodologie per la ricerca sulle terapie con cellule staminali.

Isolamento e trapianto di cellule staminali emopoietiche (CSE)

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