Name: Assemblea, Tuning e utilizzo di un microscopio Apertureless Near Field Infrared for Imaging Proteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-25T03:33:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Scopri come assemblare e ottimizzare un microscopio a infrarossi near-field per l'imaging di aggregati proteici. Questa tecnica avanzata combina microscopia AFM e laser visibile per studi in biologia molecolare.

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<ol><li>Mueller, K., Yang, X., Paulite, M., Fakhraai, Z., Gunari, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+imaging+of+the+surface+of+self-assembled+polystyrene-b-poly%28methyl+methacrylate%29+diblock+copolymer+films+using+apertureless+near-field+IR+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Chemical imaging of the surface of self-assembled polystyrene-b-poly(methyl methacrylate) diblock copolymer films using apertureless near-field IR microscopy.</a> Langmuir. 24, 6946-6951 (2008).</li>
<li>Lahrech, A., Bachelot, R., Gleyzes, P., Boccara, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared-reflection-mode+near-field+microscopy+using+an+apertureless+probe+with+a+resolution+of+lambda%2F600%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Infrared-reflection-mode near-field microscopy using an apertureless probe with a resolution of lambda/600.</a> Opt. Lett. 21, 1315-1317 (1996).</li>
<li>Taubner, T., Hillenbrand, R., Keilmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+visible+and+mid-infrared+scattering-type+near-field+optical+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Performance of visible and mid-infrared scattering-type near-field optical microscopes.</a> J. Microsc. 210, 311-314 (2003).</li>
<li>Kim, Z. H., Leone, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization-selective+mapping+of+near-field+intensity+and+phase+around+gold+nanoparticles+using+apertureless+near-field+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Polarization-selective mapping of near-field intensity and phase around gold nanoparticles using apertureless near-field microscopy.</a> Optics Express. 16, 1733-1741 (2008).</li>
<li>Bridger, P. M., McGill, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+nanometer-scale+optical+property+discrimination+by+use+of+a+near-field+scanning+apertureless+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Observation of nanometer-scale optical property discrimination by use of a near-field scanning apertureless microscope.</a> Opt. Lett. 24, 1005-1007 (1999).</li>
<li>Stebounova, L., Akhremitchev, B. B., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+the+weak+scattered+signal+in+apertureless+near-field+scanning+infrared+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Enhancement of the weak scattered signal in apertureless near-field scanning infrared microscopy.</a> Rev. Sci. Instrum. 74, 3670-3674 (2003).</li>
<li>Akhremitchev, B. B., Pollack, S., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apertureless+Scanning+Near-Field+Infrared+Microscopy+of+a+Rough+Polymeric+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Apertureless Scanning Near-Field Infrared Microscopy of a Rough Polymeric Surface.</a> Langmuir. 17, 2774-2781 (2001).</li>
<li>Hecht, B., Bielefeldt, H., Inouye, Y., Pohl, D. W., Novotny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facts+and+Artifacts+in+Scanning+Near-Field+Optical+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Facts and Artifacts in Scanning Near-Field Optical Microscopy.</a> J. Appl. Phys. 81, 2492-2498 (1997).</li>
<li>Labardi, M., Patane, S., Allegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artifact-free+near-field+optical+imaging+by+apertureless+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Artifact-free near-field optical imaging by apertureless microscopy.</a> Appl. Phys. Lett. 77, 621-623 (2000).</li>
<li>Palanker, D. V., Simanovskii, D. M., Huie, P., Smith, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+Contrast+Parameters+and+Topographic+Artifacts+in+Near-Field+Infrared+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">On Contrast Parameters and Topographic Artifacts in Near-Field Infrared Microscopy.</a> J. Appl. Phys. 88, 6808-6814 (2000).</li>
<li>Akhremitchev, B. B., Sun, Y., Stebounova, L., Walker, G. C. Monolayer-Sensitive Infrared Imaging of DNA Stripes Using Apertureless Near-Field Microscopy.Langmuir. 18, 5325-5328 (2002).</li>
<li>Brehm, M., Taubner, T., Hillenbrand, R., Keilmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared+Spectroscopic+Mapping+of+Single+Nanoparticles+and+Viruses+at+Nanoscale+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Infrared Spectroscopic Mapping of Single Nanoparticles and Viruses at Nanoscale Resolution.</a> Nano Lett. 7, 1307-1310 (2006).</li>
<li>Dazzi, A., Prazeres, R., Glotin, F., Ortega, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+nano-chemical+mapping+performed+by+an+AFM-based+%28%22AFMIR%22%29+acousto-optic+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Analysis of nano-chemical mapping performed by an AFM-based ("AFMIR") acousto-optic technique.</a> Ultramicroscopy. 107, 1194-1200 (2007).</li>
<li>Yang, D. S., Yip, C. M., Huang, T. H. J., Chakrabartty, A., Fraser, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+the+Amyloid-%CE%B2+Aggregation+Pathway+with+Chemical+Chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Manipulating the Amyloid-β Aggregation Pathway with Chemical Chaperones.</a> J. Biol. Chem. 274, 32970-32974 (1999).</li>
<li>Meadows, P. Y., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+Microscopy+Studies+of+Fibronectin+Adsorption+and+Subsequent+Cellular+Adhesion+to+Substrates+with+Well-Defined+Surface+Chemistries%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Force Microscopy Studies of Fibronectin Adsorption and Subsequent Cellular Adhesion to Substrates with Well-Defined Surface Chemistries.</a> Langmuir. 21, 4096-4107 (2005).</li>
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assemblea, tuning e utilizzo di un microscopio apertureless near field infrared for imaging proteine

Assembly, Tuning and Use of an Apertureless Near Field Infrared Microscope for Protein Imaging

Questo lavoro si propone di istruire il lettore nel montaggio e funzionamento di un vicino infrarosso microscopio a campo per l&#39;imaging oltre il limite di diffrazione. Il apertureless microscopio a campo vicino è una luce scattering-tipo di strumento che fornisce gli spettri infrarossi a circa 20 nm risoluzione. Un elenco completo dei componenti e uno step-by-step del protocollo per l&#39;uso è fornito. Gli errori più comuni in assemblea e messa a punto dello strumento sono discussi. Un insieme rappresentativo di dati che mostra la struttura secondaria di fibrille amiloidi è presentato.

L&#39;assemblaggio di un microscopio a raggi infrarossi per nearfield aggregati proteici di imaging è descritto.

Assemblea, Tuning e utilizzo di un microscopio Apertureless Near Field Infrared for Imaging Proteine

Questo articolo si propone di istruire il lettore sull'assemblaggio e sull'utilizzo di un microscopio a campo vicino a infrarossi per l'imaging oltre il limite di diffrazione. Il...

Il montaggio iniziale dell'apparato ottico viene completato configurando la fibra multimodale a FM e il microscopio ottico. L'allineamento del fascio infrarosso invisibile risulta più semplice allineando prima un laser visibile a elio-neon rosso. La linea continua deve sovrapporsi all'infrarosso, la linea tratteggiata, con l'obiettivo di osservare la luce laser che colpisce l'apice della punta della mensola e il rivelatore a infrarossi.L'allineamento finale del fascio infrarosso viene effettuato regolando la posizione del microscopio ottico e degli specchi per ottenere un segnale F unitario con la forma corretta quando si ottiene il segnale in prossimità desiderato. Vengono contemporaneamente raccolte immagini topografiche in modalità FM e immagini in prossimità utilizzando il software nano scope. Salve, sono il professor Gilbert Walker del Dipartimento di Chimica dell'Università di Toronto.Ciao, sono Melissa Paulite, anch'io del laboratorio di Gilbert Walker. Oggi vi mostreremo la procedura per il montaggio iniziale e l'allineamento della lista di apertura, microscopio a scansione infrarossa in campo vicino. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare gli aggregati proteici.Iniziamo. Prima di descrivere il montaggio e la regolazione del sistema di imaging, diamo innanzitutto uno sguardo d'insieme al sistema completo. Le parti del sistema di imaging che descriveremo in questo video includono il tavolo ottico, la base del microscopio a forza atomica multimodale, o AFM, lo scanner del AFM multimodale, il piano ottico rialzato, gli specchi di guida, il tubo ottico con diaframma e centro.Bloccare il cubo ottico con il riflettore parziale in seleniuro di zinco, il tubo ottico utilizzato per fissare l'assetto sulla piattaforma elevata. L'obiettivo infrarosso, il tubo ottico per la luce retrodiffusa raccolta. Il cubo con uno specchio paraboloide fuori asse, il cubo per tenere la piastra di germanio a 45 gradi.L'oculare del microscopio, il diaframma a pinhole montato sullo stadio XY, il rilevatore infrarosso al tellururo di mercurio e cadmio o MCT. Il preamplificatore del rilevatore infrarosso collegato allo stadio XY per spostare la posizione del fascio, al tavolo elevabile per mettere a fuoco il fascio, allo stadio Z per posizionare il rilevatore infrarosso e allo stadio X per posizionare il rilevatore infrarosso. Per iniziare il montaggio della configurazione ottica, utilizzare specchi di regolazione per posizionare il fascio di elio-neon parallelo al tavolo ottico.Successivamente, senza divisore del fascio nel cubo e con il tubo ottico allungato all'altra estremità del cubo, indirizzare il fascio di elio-neon attraverso le iridi fissate alle estremità dei tubi. Ora rimuovere lo scanner e fissare il tubo ottico allungato al posto dell'obiettivo a infrarossi. Inserire il riflettore parziale in seleniuro di zinco per indirizzare il fascio verso il campione.Deve essere montato in modo che il fascio di elio-neon colpisca la superficie anteriore del riflettore nel centro geometrico del cubo ottico. Ruotando il riflettore parziale, indirizzare il fascio attraverso l'uscita chiusa. Poiché il supporto del riflettore parziale non lo mantiene esattamente perpendicolare, utilizziamo due viti di regolazione installate in sede per consentire il movimento verticale del fascio.Successivamente, utilizzare anelli di gomma ad O per montare lo specchio Paraloid stringendo le viti. Gli anelli ad O si comprimono, consentendo la regolazione dello specchio. Utilizzare specchi aggiuntivi per indirizzare il fascio di elio-neon in direzione opposta, regolandolo in modo che passi attraverso le iris precedentemente utilizzate.Questo fascio verrà utilizzato per regolare lo specchio paraboloide. Lo specchio paraboloide posizionato nel cubo ottico riflette la luce verso il rivelatore, che sarà posizionato dopo il foro stenopeico. Le viti di regolazione permettono di indirizzare il fascio attraverso il foro stenopeico collocato all'uscita del cubo.Dopo aver regolato il fascio attraverso il foro stenopeico, posizionare il rivelatore MCT vicino al foro stenopeico. Regolare la posizione del rivelatore a infrarossi in modo che il fascio di elio-neon colpisca l'elemento sensibile del rivelatore. Spostare il rivelatore verso il basso di circa due millimetri.Ora inserire il supporto con la finestra in germanio nel cubo ottico situato prima del diaframma. La finestra in germanio con rivestimento riflettente serve da filtro per l'infrarosso e permette osservazioni visive della mensola e del campione. Successivamente, fissare l'oculare.Ruotare l'angolo del cubo permette di orientare l'oculare nella direzione desiderata mediante la rotazione del supporto della finestra di germanio. Indirizzare il fascio di elio-neon attraverso il centro dell'oculare. Collegare l'obiettivo a infrarossi e uno scanner FM e fissare il blocco del fascio.Posizionare un campione sullo scanner e indirizzare il fascio di elio-neon attraverso il tubo ottico in ingresso. Assicurarsi che il fascio sia abbastanza ampio da fuoriuscire lateralmente rispetto al campione. Fermare il fascio regolando il filetto dell'oculare.Ottenere un'immagine nitida del fascio focalizzato sul campione. Successivamente, montare una testa FM e posizionare la sonda sul campione. Focalizzare il fascio di elio-neon sull'estremit&agrave; della mensola di imaging.Se si procede in questo modo, il fascio viene spostato dal centro del tubo ottico di ingresso. Ripetere i passaggi di taratura finché il fascio non è centrato. Per iniziare gli aggiustamenti finali dello specchio parabolico, sostituire il foro di uscita con un diaframma iris nella posizione focale dello specchio paraboloide e rimuovere la finestra in germanio e il rivelatore a infrarossi.Ricordarsi di segnare la posizione del rilevatore a infrarossi. Aggiungere una lente aggiuntiva dopo l'iride, approssimativamente alla distanza focale della lente. Il cantilever attivato dovrebbe ora essere visibile attraverso la lente.Regolare la posizione dello specchio paraboloide in modo da centrarlo rispetto all'estremità della punta attraverso l'iride chiusa. Notare che quando il fascio di elio-neon è correttamente focalizzato sulla punta, si osserva un bagliore brillante tra la punta e la sua riflessione sulla superficie del campione. Riattaccare la finestra di germanio e regolarla per consentire un'osservazione visiva agevole della leva flessibile.Sostituire l'iride con il foro stenopeico. Ricordare che il foro stenopeico utilizzato per la rilevazione nell'infrarosso deve essere spostato rispetto al centro a causa dello spostamento del fascio infrarosso provocato dalla finestra in germanio. Posizionare il rivelatore a infrarossi nella posizione precedentemente segnata e indirizzare il fascio infrarosso in modo che viaggi insieme al fascio visibile utilizzato per la taratura.Ora siamo pronti per esaminare la procedura di regolazione di routine. L'allineamento risulta più semplice utilizzando il fascio visibile di elio-neon rispetto al fascio infrarosso invisibile. Il percorso del fascio di elio-neon e quello del fascio infrarosso si congiungono al livello dello specchio orientabile.Se questo specchio è inclinato verso il basso, l'elio-neon può passare. Se lo specchio è in posizione, l'infrarosso va nel campo vicino. Configurazione per l'allineamento di uno dei fasci.Utilizzare due specchi che non sono in comune con l'altro percorso. Se si osserva il fascio nel braccio dell'omodina, si dovrebbe vedere un profilo del fascio simile a una corona. Il modulatore acustooptico è ora attivato con retroazione di forza per un allineamento preciso mediante lo stadio in campo vicino.Spostare l'obiettivo del microscopio riflettente in modo da focalizzare la luce sulla punta, dove viene dispersa. Inserire la finestra di germanio nel cubo ottico. Dopo lo specchio paraloid, il fascio viene focalizzato su questo punto da uno specchio paraloid.Spostare la piastra indietro o in avanti fino a quando non si riesce a vedere un'immagine nitida della punta e del suo riflesso sulla superficie del campione utilizzando la finestra in germanio. Ora guardare attraverso il telescopio, dove è possibile vedere la mensola e la punta senza il fascio di elio-neon. Si riesce ancora a vedere una luce rossa, ma si tratta di luce interna proveniente dal controllo della distanza in microscopia a forza atomica.Spostare la piastra a destra, a sinistra e in alto e in basso finché non si ottiene un bagliore rosso brillante sulla punta. Per sovrapporre il campo omodino alla luce diffusa, aprire prima il braccio omodino. Quindi guardare attraverso l'oculare.Verranno visualizzati tre o più punti in linea con intensità decrescente. Spostare lo specchio nel braccio dell'omodino in modo che il secondo punto si sovrapponga all'immagine della punta in cui la punta e la sua riflessione si uniscono. Per posizionare il rivelatore, rimuovere lo specchio aggiuntivo.Il fascio di elio-neon ora si dirigerà verso il rilevatore situato dietro il tubo. È possibile osservare almeno due macchie di forma circolare. La seconda macchia a partire da destra dovrebbe passare attraverso il foro nella lamina di protezione termica davanti al rilevatore e colpire l'elemento sensibile.Il punto con l'intensità più elevata dovrebbe essere visibile sul foro dopo aver completato la regolazione di routine. Esaminiamo l'allineamento del fascio infrarosso. Per allineare il fascio infrarosso, utilizzare una linea laser a monossido di carbonio con un'intensità di almeno 100 milliwatt.Questo renderà l'allineamento più semplice. Per iniziare, riempire il rivelatore con azoto liquido. Ruotare lo specchio montato su un supporto cinetico ribaltabile in modo che il fascio infrarosso sia diretto verso il microscopio.Posizionare un misuratore di potenza dietro la prima iride e regolare lo specchio situato prima dello specchio montato su un supporto girevole cinematico. Per ottenere la potenza massima, tenere il misuratore di potenza dietro l'iride più vicina alla fase del campo vicino e muovere lo specchio inclinabile finché non si raggiunge la potenza massima. Durante il processo di allineamento, ripetere questi passaggi più volte osservando il segnale F1.Per verificare il segnale di una F, impostare il riferimento del blocco nell'amplificatore su una f pari alla frequenza di oscillazione FM ed eseguire una scansione Zs di tre metri in modalità mappa di forza. Se l'allineamento è scadente, si osserverà un picco largo su scala di tre metri. Per correggerlo, sarà necessario ripetere continuamente i passaggi precedenti finché l'allineamento non migliora.Se l'allineamento è medio, la curvatura della prima gobba apparirà leggermente concava, anche se la seconda gobba sarà più grande della prima. In questo caso, è possibile correggere l'allineamento regolando uno o entrambi gli specchi di allineamento. Se l'allineamento è corretto, si vedranno soltanto due gobbe e la prima sarà più alta della seconda.La curvatura sul lato destro del primo picco sarà negativa. Una volta ottenuto un buon allineamento, è possibile regolare gli specchi per aumentare il massimo del primo picco. Il segnale F deve trovarsi tra cinque e dodici volt, anche se la forma del primo picco è più critica.Infine, passare a due F e provare a migliorare ulteriormente il segnale. Ruotando leggermente gli specchi e modificando così la fase, il segnale di due F dovrebbe trovarsi compreso tra 0,6 e due volt. Topografia sperimentale e campo vicino.Vengono mostrate immagini di 21-31 fibrilli peptidici. La scala superiore indica l'altezza in nanometri e la scala inferiore indica il contrasto in campo vicino in tensione di blocco; l'immagine di topografia mostrata qui è stata raccolta contemporaneamente all'immagine di campo vicino ottenuta utilizzando 1.631 centimetri inversi di radiazione. Un'immagine di topografia raccolta contemporaneamente all'immagine di campo vicino ottenuta utilizzando 1.691 centimetri inversi.Viene mostrata la radiazione. Le etichette rappresentano specifici FIs e vengono utilizzate per evidenziare il tipo di conferma secondaria posseduta da ciascun FI. Vi abbiamo appena mostrato come assemblare una linea e utilizzare un elenco di aperture in un microscopio a scansione nel vicino infrarosso.Ricordare i passaggi eseguiti durante l'allineamento in modo da poterli ripercorrere qualora l'allineamento fosse errato, e soprattutto essere pazienti. È tutto. Grazie per aver guardato.In bocca al lupo per i tuoi esperimenti.

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Topologia di adesione cellulare su un substrato viene misurata con precisione nanometrica variabile-angolo microscopia a fluorescenza di riflessione interna totale (VA-TIRFM).

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I passaggi chiave della funzione delle proteine, in particolare i cambiamenti conformazionali della spina dorsale e le reazioni di trasferimento protonico, spesso avvengono su una scala temporale da microsecondi a millisecondi. Questi processi dinamici possono essere studiati mediante spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier a scansione a gradini risolta nel tempo, in particolare per le proteine la cui funzione è attivata dalla luce.

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