Electrospinning Ponteggi polimeri fibrosi per l'ingegneria tissutale e colture cellulari

Questo video mostra l'elettrofilatura di polimeri, una tecnica diffusa nell'ingegneria tissutale e nella coltura cellulare per creare impalcature fibrose che imitano l'architettura e la scala dimensionale della matrice extracellulare nativa. In questo caso, eseguiamo l'elettrofilatura di un acido ialuronico fotoreattivo, in grado di reticolarsi mediante esposizione alla luce, e illustriamo ulteriori applicazioni di lavorazione, come il fotoimpiego, un processo che genera canali e impalcature con porosità su più scale per aumentare l'infiltrazione cellulare e la distribuzione del tessuto. Inoltre, utilizziamo la formazione di impalcature multicomponente, che consente l'elettrofilatura di due polimeri diversi nella stessa membrana, permettendo di regolare le proprietà meccaniche e la degradazione dell'impalcatura e di modulare la porosità per favorire l'infiltrazione cellulare.

Ciao, sono Jamie Kovi del laboratorio di Jason Burdick del Dipartimento di Bioingegneria dell'Università della Pennsylvania. Ciao, sono Harini Swin, anch'io del Burdick Lab. Oggi vi mostreremo un procedimento per la produzione elettrofilata di impalcature fibrose per l'ingegneria tissutale.

Introdurremo inoltre le ulteriori capacità di lavorazione rappresentate dalla fotolitografia e dalla formazione di impalcature multipolimeriche. Utilizziamo questi procedimenti nel nostro laboratorio per studiare le interazioni e le infiltrazioni delle cellule HMSE in impalcature di acido ialuronico. Impiegamo anche queste tecniche con diversi altri polimeri per studiare tessuti rinforzati da fibre, come il menisco e il miocardio.

Iniziamo. Preparare una soluzione al 0,5% in peso del fotoiniziante I 2 9 5 9 in acqua deionizzata, sciogliendolo a 37 gradi Celsius per diversi giorni.

Si utilizza I cure se è necessario un polimero fotoreattivo per l'elettrofilatura. Per preparare la soluzione per l'elettrofilatura, combinare in acqua deionizzata fino a raggiungere le concentrazioni finali del 2% in peso di acido ialuronico metilato o MEHA, del 3% in peso di poliossido di etilene o PEO e dello 0,05% in peso di soluzione di I 2 9 5 9; vortexare per cinque minuti e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Per sciogliere la soluzione, trasferirla in una siringa e applicare all'estremità un ago ottuso da 18 gauge e lungo sei pollici.

Successivamente, utilizzare una pompa per siringa e impostarla per espellere a una velocità di 1,2 millilitri all'ora. Inserire l'ago del motore della siringa nella pompa per siringa. Collegare il cavo di massa di una fonte di alimentazione ad alta tensione all'apparato di raccolta.

In questa procedura, utilizzeremo un mandrino che ruota a circa 10 metri al secondo. Per raccogliere le fibre allineate, collegare il cavo positivo all'ago, quindi regolare l'ago o il dispositivo di raccolta in modo che vi sia una distanza di 15 centimetri tra i due. Avviare il flusso della pompa per siringa e, quando il liquido sarà visibile sulla punta dell'ago, accendere l'alimentatore e impostare la tensione a 22 chilovolt.

Raccogliere le fibre sullo scaffold fino a raggiungere lo spessore desiderato. Il tempo di raccolta dipende dallo spessore desiderato e dal volume della soluzione per elettrofilatura utilizzato. Per la fotolitografia, utilizziamo membrane elettrofilate ottenute con 16 ore di filatura.

Rimuovere l'impalcatura dall'apparato di raccolta al termine della raccolta e conservarla sotto vuoto durante la notte per rimuovere completamente il solvente. Ritagliare campioni di cinque millimetri per cinque millimetri dalla stuoia di impalcatura con delle forbici. Posizionare ciascuna impalcatura su un vetrino di vetro ricoperto di foglio di alluminio per prepararla alla reticolazione e posizionare direttamente sulla impalcatura la maschera fotolitografica, coprendo con un vetrino di vetro pulito e fissando entrambe le estremità del vetrino con clip da cartelletta.

Utilizzando una camera a azoto, spurgare l'impalcatura per inibire la riduzione del reticolaggio dovuta all'esposizione all'ossigeno. Posizionare l'impalcatura nella camera a azoto sotto una luce di circa 10 milliwatt per centimetro quadrato a 365 nanometri con un adattatore collimatore per cinque minuti. Rimuovere ogni impalcatura e posizionarla in una piastra per colture cellulari a 12 pozzetti.

Aggiungere due millilitri di acqua deionizzata in ciascun pozzetto. Eseguire un'accurata profilatura della piastra per evitare aberrazioni EVA dell'acqua e posizionarla a 37 gradi Celsius per 24 ore. Cambiare l'acqua ogni otto ore utilizzando una pipetta a vuoto per aspirare l'acqua deionizzata dal pozzetto tra un lavaggio e l'altro.

Preparare una soluzione al 5% in peso di PEO in etanolo al 90% su un agitatore magnetico riscaldante. Mescolare a 700 giri al minuto a 50 gradi Celsius per almeno due ore prima della procedura. Dopo l'agitazione, aggiungere DPI per ottenere una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro.

Trasferire la soluzione di PEO e DPI in una siringa da tre millilitri e avvolgerla con carta d'alluminio per proteggerla dalla luce. Successivamente, preparare la soluzione per l'elettrofilatura descritta nella seconda sezione e aggiungere metossi etile biocarbonile mole rod domine B per una concentrazione finale di 25 micromolari, trasferendola con una micropipetta in una siringa da tre millilitri. Avvolgere quindi con carta d'alluminio per proteggerla dalla luce.

Utilizzare con attenzione del nastro adesivo trasparente per fissare i bordi di coprioggetti in vetro metilato di 22 millimetri per 22 millimetri sulla superficie del mandrino, in modo che i coprioggetti si adattino alla circonferenza del mandrino. Utilizzando un pezzo di tubo di silicone lungo cinque millimetri, collegare un'estremità a una delle siringhe con attacchi a bloccaggio rapido. Collegare l'altra estremità a un ago, inserire la siringa nella pompa per siringhe e far passare l'ago attraverso il foro nel ventilatore.

I fannelli traslano la lunghezza del mandrino e vengono utilizzati per garantire una distribuzione uniforme di entrambi i polimeri nello scaffold risultante. Assicurarsi che le punte degli aghi siano centrati sul mandrino per la siringa contenente MEHA. Posizionare la punta dell'ago a 15 centimetri dal mandrino e impostare il fannello a una distanza di sei centimetri dalla punta dell'ago.

Programmare la pompa per siringa per erogare 1,2 millilitri all'ora e impostare la fonte di alimentazione a 22 kilovolt. Configurare la siringa con PEO esattamente nello stesso modo, ma posizionare la punta dell'ago a 10 centimetri dal mandrino e impostare la fonte di alimentazione a 15 kilovolt. Successivamente, spegnere le luci e accendere il mandrino e le pompe per siringa.

Rimuovere la pellicola di alluminio dalle siringhe quando il liquido è visibile sulle punte di entrambi gli aghi. Accendere contemporaneamente le alimentazioni e collegare i ventilatori quando la raccolta è completa. Spegnere con cura le alimentazioni e il mandrino e scollegare i ventilatori.

Rimuovere le lamelle e il nastro utilizzando una lametta. Le fibre possono essere visualizzate al microscopio a fluorescenza dotato di filtri per rumine e dpi. Posizionare ogni lamella con il polimero elettrospinto attaccato in un pozzetto singolo di una piastra a sei pozzetti.

Piastra a pozzetti Incubare gli scaffold in due millilitri di PBS durante la notte per garantire la completa rimozione del solvente e delle impurità. Dopo 24 ore, utilizzare il vuoto per aspirare il PBS dalla piastra a pozzetti e posizionare gli scaffold sotto una lampada UV germicida in una cappa a flusso laminare per 30 minuti. Per la sterilizzazione, eseguire la coltura cellulare standard e preparare una sospensione cellulare concentrata alla densità cellulare desiderata.

Ad esempio, utilizzare 100 millilitri di sospensione cellulare per un'immersione di 22 per 22 millimetri. Collocare nell'incubatrice per un'ora. Aggiungere la quantità appropriata di mezzo di coltura cellulare a ciascuno.

Rimettere gli scaffold nell'incubatore. Colorare le cellule utilizzando un kit commerciale per la vitalità cellulare disponibile in commercio di Invitrogen, per visualizzare le cellule e le fibre mediante microscopio fluorescente dotato di filtri per trissy e fitzy, come previsto. Gli scaffold raccolti su una piastra piana collegata a terra producono fibre distribuite in modo casuale, mentre gli scaffold raccolti su un mandrino rotante presentano una diversa disposizione delle fibre.

Produce fibre allineate quando osservate mediante microscopia elettronica a scansione durante la foto-polimerizzazione del scaffold; posizioniamo una maschera fotolitografica tra lo scaffold e la sorgente luminosa dopo l'immersione dello scaffold in acqua deionizzata contenente ha non reattivo. Le aree protette dalla luce e il PEO vengono rimossi e osserviamo la formazione di macropori, evidente mediante l'uso di un colorante fluorescente. La contemporanea elettrofilatura dei getti di MEHA e PEO porta alla formazione di uno scaffold composito contenente popolazioni distinte di fibre costituite dai singoli polimeri.

I MCH sembrano interagire positivamente con le fibre. Non solo rimangono vitali, come evidenziato dalla colorazione verde, ma sembrano anche orientarsi in modo da allinearsi lungo le fibre rosse. Vi abbiamo appena mostrato come produrre mediante elettrofilatura impalcature fibrose per l'ingegneria tissutale.

Abbiamo inoltre introdotto ulteriori capacità, come la fotolitografia e l'elettrofilatura multi-polimerica. Durante questa procedura, è importante ricordare di ottimizzare i parametri di elettrofilatura di ciascun polimero per formare fibre uniformi prima di tentare ulteriori esperimenti. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.