Isolamento e purificazione di Drosophila Neuroni periferici da Magnetic Ordinamento Bead

Si utilizzano larve di Drosophila portatrici di un transgene reporter di fusione GFP specifico per i neuroni CD8 per isolare i neuroni DA. Le larve vengono dissezionate rivestendo l'interno della cuticola, esponendo così il sistema nervoso periferico. Le larve invertite sono sottoposte a dissociazione enzimatica, seguita da dissociazione meccanica mediante vortex, azionamento e downing.

Le cellule vengono quindi filtrate per ottenere una sospensione di singole cellule contenente principalmente cellule epiteliali, muscolari e neuroni. Vengono aggiunte alla sospensione cellulare microsfere magnetiche rivestite con anticorpi, che si legano ai neuroni esprimenti la proteina di fusione GFP marcati con CD otto. Infine, i neuroni rivestiti con microsfere magnetiche vengono isolati posizionando la soluzione in un campo magnetico intenso, ottenendo popolazioni di neuroni altamente purificate.

Ciao, sono Dan Cox del Dipartimento di Biologia Molecolare e Microbiologia dell'Istituto Krasno per lo Studio Avanzato presso la George Mason University. Ciao, sono Ish AER del laboratorio del Dott. Dan Cox. Oggi vi mostreremo un procedimento per l'isolamento e la purificazione di neuroni periferici DLO mediante separazione magnetica con microsferette.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare i meccanismi molecolari che regolano la morfogenesi specifica della classe e corretta. Cominciamo dunque. Per iniziare questa procedura, selezionare da 30 a 50 larve di terzo stadio con età abbinata e posizionarle in una provetta microcentrifuga da 1,6 millilitri contenente da 1 a 1,2 millilitri di 1 XPBS.

Chiudere il tubo e vorticare al massimo per tre volte, per un secondo ogni volta. Utilizzando una pipetta flame-lisciata, scartare completamente il soprannatante. Aggiungere un millilitro di PBS e ripetere i passaggi di lavaggio e vorticosità per tre volte, fino a quando il soprannatante appare visibilmente privo di particelle di cibo e detriti.

Ripetere brevemente il lavaggio con un millilitro di etanolo al 70%. Quindi lavare due volte le larve con un millilitro di acqua doppio-distillata. E infine, ripetere nuovamente il lavaggio con un millilitro di R nase away e per tre volte con un millilitro di acqua doppio-distillata per una completa rimozione dell'RNA away. Le larve sono ora pronte per la dissezione.

Posizionare da 10 a 12 larve al centro di una piastra di Petri da 35 millimetri rivestita con serra. Disporle leggermente distanti l'una dall'altra e scartare le larve che non sembrano essere nello stadio di sviluppo appropriato. Successivamente, utilizzare un paio di forbici da dissezione fini per aprire la punta anteriore delle larve usando un parzialmente smussato Dumont.

Numero cinque, pinzetta. Rivoltare le larve all'interno all'esterno. Iniziare inserendo una pinzetta all'interno della cuticola larvale fino all'estremità posteriore.

Stringere le punte della pinzetta per afferrare l'estremità posteriore della cuticola. Premere la cuticola sulla superficie della protezione syl facilita l'operazione. Utilizzando la seconda coppia di pinzette, spingere la cuticola della larva al contrario.

Assicurarsi che le larve siano completamente invertite in modo che tutti i tessuti molli siano esposti alla soluzione per una facile dissociazione. Esercitarsi alcune volte prima di tentare la dissociazione delle cellule. Dopo aver dissezionato da tre a quattro larve, trasferirle immediatamente in PBS fresco e freddo su ghiaccio in una provetta microcentrifuga.

Ripetere fino a quando non sono stati raccolti i 30-40 larve necessari, prima di procedere alla rimozione delle cellule non specifiche. Tenere presente che si prevede una perdita del 10-20% durante la dissezione e l'associazione, ora che tutte le larve sono state dissecate. Rimuovere i tessuti non specifici debolmente aderenti, come i corpi adiposi e le cellule del sistema nervoso centrale.

Sostituendo il PBS del tubo contenente le cuticole larvali capovolte con 700-800 microlitri di PBS fresco e ghiacciato. Infine, eseguire brevi impulsi. Vortexare il tubo microcentrifuga cinque volte per tre secondi per ogni impulso alla velocità massima.

Quindi eliminare il soprannatante e sostituirlo con circa 700-800 microlitri di PBS fresco ghiacciato. Ripetere questo passaggio tre volte e infine risospendere le cuticole larvali in 400 microlitri di PBS fresco ghiacciato.

PBS freddo prima di procedere alla dissociazione delle cellule per isolare i neuroni larvali di tipo dendritic arborization (da). Utilizzare una combinazione di dissociazione enzimatica e meccanica. Fare attenzione a una dissociazione eccessiva, che potrebbe causare la perdita del marcatore della superficie cellulare, portando a una scarsa resa cellulare e a una bassa vitalità cellulare.

Avviare la dissociazione aggiungendo 1,5 microlitri di una x liasi zima tre a 28. Una volta unità per fiala alle cuticole larvali sospese in 400 microlitri di PBS. Vortexare la soluzione da due a tre volte per un secondo ciascuna alla massima velocità per rimuovere le cellule debolmente aderenti dalle cuticole e portarle in soluzione.

Quindi incubare la soluzione a temperatura ambiente per cinque minuti. Poiché il tempo di incubazione influisce notevolmente sull'efficienza finale del sorting cellulare, non superare i 15 minuti al termine dell'impulso di incubazione.

Vortexare il tubo da 20 a 30 volte a velocità massima per due secondi per ogni impulso. Questo dovrebbe rilasciare il muscolo e altri tessuti non specifici in soluzione. Ispezionare periodicamente il campione al microscopio stereoscopico con fluorescenza per determinare se i neuroni periferici sono ancora attaccati alla cuticola.

Ispezionare un piccolo campione della soluzione osservando direttamente il tubo microcentrifuga sotto un microscopio stereo con fluorescenza per determinare il grado di dissociazione. Continuare a farlo ad ogni passaggio della dissociazione, interrompendo il vortex prima che i neuroni periferici appaiano dissociarsi dalla cuticola e passare in soluzione. Lavare brevemente le cuticole larvali con due o tre aggiunte di un millilitro ciascuna di PBS fresco e ghiacciato.

E infine, risospendere in 500 microlitri di PBS fresco e freddo di ghiaccio contenente 1% di BSA per proseguire con la dissociazione meccanica delle cellule. Utilizzare un omogenizzatore per tessuti da due millilitri con pestello a grande gioco e soluzione di 1% di BSA in PBS. Dopo un breve risciacquo, scartare la soluzione di BSA.

Questo impedirà alle cuticole larvali di aderire alle superfici di vetro. Successivamente, preraffreddare il macinatore e il pestello per tessuti ponendoli sul ghiaccio per alcuni minuti, al fine di prevenire danni cellulari o la lisi. Quindi utilizzare una pipetta con estremità arrotondata a fiamma per trasferire le cuticole nel macinatore per tessuti.

Ora omogeneizzare il tessuto con movimenti lenti e costanti, evitando la formazione di schiuma, per circa 20-30 movimenti. Assicurarsi di omogeneizzare lentamente e in modo costante. In caso contrario, le cellule potrebbero lacerarsi.

Per valutare i livelli di dissociazione cellulare, pulire la parete del maceratore per tessuti con un fazzoletto Kim pulito e ispezionare al microscopio stereoscopico a fluorescenza. I neuroni dovrebbero essersi staccati dalla cuticola e possono essere visibili nella soluzione. Un buon indicatore della dissociazione cellulare è l'assenza di neuroni sulla cuticola della larva.

Tuttavia, se si osservano ancora neuroni attaccati alla cuticola o si osservano cellule completamente dissociate, proseguire ulteriormente la dissociazione fino a quando le cellule non raggiungono una sospensione monocellulare. Continuare la dissociazione meccanica utilizzando una pipetta con punta flame-polished. Ridurre il diametro della punta a circa il 50% del diametro standard ed eseguire cinque passaggi di pipettaggio della soluzione, seguiti da dieci passaggi con una pipetta flame-polished.

Ridurre a circa il 25% del diametro standard della punta. Si noti che una manipolazione troppo energica può danneggiare le cellule. Monitorare le cellule tra un passaggio e l'altro e regolare la procedura di conseguenza.

Terminare filtrando la soluzione attraverso un filtro cellulare da 30 micrometri e raccogliere il filtrato cellulare in una provetta microcentrifuga da 1,6 millilitri. La soluzione risultante dovrebbe consistere in una sospensione di cellule singole ed è ora pronta per la separazione cellulare magnetica. Perline magnetiche rivestite con un anticorpo anti CD otto.

Sono stati preparati come descritto nel protocollo scritto allegato e i neuroni DA esprimono una proteina fusione CD8-GFP riconosciuta dall'anticorpo. Avviare il sorting cellulare aggiungendo 15 microlitri di microsferette magnetiche ricoperte di anticorpo a 500 microlitri di sospensione cellulare. Incubare le cellule con le microsferette magnetiche ricoperte di anticorpo da 30 a 60 minuti sul ghiaccio, mescolando occasionalmente a mano; un'incubazione a temperatura più elevata o per un tempo più lungo potrebbe causare un legame aspecifico dell'anticorpo.

Successivamente, posizionare il microtubo in un campo magnetico intenso per due minuti. Tutte le cellule positivamente selezionate insieme alle perle non legate aderiranno al lato del tubo; aspirare lentamente il soprannatante senza disturbare il pellet cellulare e lavare le cellule da tre a quattro volte in PBS fresco e freddo di ghiaccio. Questo passaggio rimuove tutte le cellule rimanenti non specifiche.

Infine, risospendere le cellule in 30 microlitri di PBS fresco e ghiacciato per stimare la purezza e il rendimento cellulare. Pipettare cinque microlitri della sospensione cellulare sulla superficie lucida di un emocitometro e contare tutte le cellule fluorescenti visibili al microscopio stereoscopico a fluorescenza. Verificare anche la quantità di cellule non fluorescenti e la presenza di eventuali impurità.

Tipicamente, il campione sarà fortemente arricchito in cellule fluorescenti. Infine, utilizzare il kit di isolamento dell'RNA pico pure per isolare l'RNA dalle cellule legate alle perle. Aggiungere il buffer di estrazione alle cellule ordinate, ma rimuovere le perle utilizzando un magnete prima del passaggio di purificazione su colonna; utilizzare un microlitro dell'RNA estratto per valutare la qualità totale dell'RNA su un Agilent Bioanalyzer 2100.

L'RNA purificato dai neuroni DA isolati è di eccellente qualità, come indicato dalla presenza di netti picchi di RNA ribosomiale 5,8 s e 28 s quando analizzato su un Agilent 2100 Bioanalyzer. A partire da larve di 30 a 43 ore, siamo stati in grado di isolare in media da 300 a 500 neuroni DA di classe quattro utilizzando il driver PPK-Gal4 e da 1500 a 2000 neuroni DA appartenenti alle classi 1, 2, 3 e 4. Utilizzando un driver Gal4 specifico per neuroni PANDA, la PCR quantitativa in tempo reale con L11 e FCH, marcatori specifici per neuroni, ha rivelato un significativo arricchimento in termini di fold, indicando un elevato grado di specificità nell'arricchimento dei neuroni DA ottenuto con il protocollo da noi dimostrato, rispetto al flusso passante. Infine, l'RNA isolato sia dai neuroni PANDA che dai neuroni DA di classe quattro è stato utilizzato per eseguire un profilo di espressione trascrizionale su microarray oligonucleotidici Agilent per l'intero genoma di Drosophila melanogaster, identificando numerosi fattori coinvolti nella morfogenesi dei neuroni DA.

Abbiamo mostrato come isolare e purificare i neuroni periferici di drosophila mediante separazione con microsfere magnetiche a partire dalla terza fase larvale dello sviluppo larvale. Durante questa procedura, è fondamentale bilanciare i passaggi di dissociazione enzimatica e meccanica. Un'eccessiva dissociazione enzimatica può portare alla degradazione dei marcatori della superficie cellulare CD8, causando un'inefficiente o fallita separazione cellulare.

È inoltre fondamentale mantenere condizioni prive di RNA durante tutta la procedura, al fine di preservare l'integrità dell'RNA purificato dai neuroni isolati. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.