Dissezione di 6,5 embrioni di topo dpc

Il mio nome è Kelly Shea e sono la responsabile del laboratorio e anche una tecnica di ricerca nel Laboratorio di Neilsen; è molto difficile perché molte persone non sanno distinguere i diversi strati del tessuto. Quindi, ciò che bisogna fare è essenzialmente rimuovere tutti gli strati del tessuto per esporre l'embrione sottostante, che a questo stadio non è molto vascolizzato. È quindi molto trasparente e difficile da distinguere.

Prendere pinze e forbici piuttosto robuste. Per prima cosa, occorre pizzicare l'animale lungo la linea mediana e procedere effettuando una prima incisione. Da quel punto, è sufficiente tirare la pelle in direzioni opposte, esponendo l'addome dell'animale.

C'è un sottile strato del peritoneo che dovrai sollevare con la pinza, quindi puoi tagliarlo con le forbici e ribaltarlo. Devi tagliare lungo la linea mediana dell'animale e separare i due corni uterini, che sono connessi nel mezzo. Puoi tagliare proprio alla base.

Probabilmente otterrai molta adiposità insieme al campione. Preleva l'intero corno uterino dell'animale e posizionalo direttamente nel PBS.

Quindi questo è all'interno del corno. Questi sono i siti di impianto, 1, 2, 3, 4, 5. Ciò che si deve fare è semplicemente separarli.

È fondamentalmente possibile tagliare tra i siti di impianto proprio qui. Si può semplicemente afferrare l'embrione lateralmente e, in pratica, aprirlo con una leva. A questo punto, si espone il deum, che è un tessuto più spugnoso situato al di sotto.

Quindi l'embrione dovrebbe trovarsi esattamente al centro, proprio qui. Questa è l'apice del denti decidui. È necessario orientarlo con l'apice rivolto verso l'alto.

Quello che andrete a fare è tagliare circa un quinto della lunghezza a partire dall'apice. L'embrione dovrebbe trovarsi esattamente al centro, proprio qui. Quello che faccio io è orientarlo lateralmente, prendere una pinzetta e afferrarlo, tenerlo fermo con l'altra, tagliare la punta e poi separarlo.

Quindi, una volta rimossa la calotta, posizionare l'embrione sul suo bordo. E come si può vedere, si forma un'apertura proprio nel punto in cui si è rimossa la calotta. Basta inserire le pinzette in quella fessura. Sì.

A questo punto, l'embrione è molto allentato all'interno della deum. Una volta aperta la deum, è possibile espellerlo relativamente con facilità, purché si riesca a posizionarsi al di sotto della sua base. È quindi molto piccolo.

Ci sono anche alcuni tessuti ancora attaccati all'embrione. Si ha il cono placentario esterno, che si trova proprio qui all'apice dell'embrione. E inoltre ci sono altri tessuti ancora attaccati.

Quindi prendo semplicemente la pipetta e lo aspirò. A questo punto, è necessario fissare gli embrioni. Ho qui una capsula contenente PFA.

Volevamo analizzare i geni candidati. Fondamentalmente, stiamo utilizzando tecniche di ibridazione in situ su preparati interi di RNA per visualizzare la produzione di acidi nucleici in situ all'interno di un embrione. Siamo particolarmente interessati a questi specifici geni perché codificano marcatori putativi dei precursori delle cellule germinali e si prevede che siano espressi nell'embrione di topo in un particolare momento dello sviluppo, che favorisce la maturazione delle cellule germinali a partire dai precursori putativi fino a diventare cellule germinali effettive.

Uno di questi fattori che ci interessa particolarmente, e il primo fattore su cui abbiamo effettivamente eseguito un'ibridazione in situ su embrioni di 6,5 giorni, è la proteina morfogenetica delle ossa, o BMP4. È un membro della famiglia superiore del TGF-beta ed è molto importante, essendo assolutamente necessaria nella maturazione delle cellule germinali.

È inoltre necessario che le cellule germinali si traslochino attraverso l'embrione e si localizzino nelle vicinanze della linea primitiva dell'embrione. Inoltre, BMP4 svolge un ruolo fondamentale sia nel segnale che nella maturazione che le cellule germinali devono attraversare per localizzarsi nella linea primitiva. Pertanto, per prima cosa, è importante assicurarsi di sapere cosa si sta cercando, conoscere le dimensioni ridotte dell'elemento in esame, la scala con cui si sta lavorando e pianificare con molta attenzione.

La tecnica, in particolare con quale tipo di microscopio stereoscopico si intende lavorare. Una delle difficoltà tecniche consiste nel fatto che questa procedura richiede numerose manipolazioni e movimenti della mano estremamente precisi, per evitare di danneggiare l'embrione. È quindi consigliabile utilizzare un microscopio stereoscopico che offra ampio spazio per la manipolazione, e assicurarsi di avere predisposto tutto l'occorrente per l'esperimento, in modo da ridurre al minimo le manipolazioni necessarie durante la dissezione.

Pertanto, a parte questo, ritengo che sia necessario procedere molto lentamente e staccare con cura i singoli strati del tessuto in modo molto lento, in modo da sapere con cosa si sta lavorando. E assicurarsi di conoscere la posizione dell'embrione.