Name: Microiniezione intranucleari di DNA in dissociato neuroni dei mammiferi adulti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-10T17:10:00.000+00:00
Duration: 13 min 39 s
Description: Impara la microiniezione intranucleare di cDNA in neuroni dissociati di mammiferi adulti per studiare la funzione proteica. Questa tecnica consente elevati livelli di espressione eterologa in cellule post-mitotiche.

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Il nostro laboratorio di ricerca è sostenuta dal programma di ricerca intramurale del NIH, National Institute on abuso di alcool e l&#39;alcolismo.

<html> I. Preparazione per l&#39;iniezione Questa sezione descrive le fasi di preparazione che devono essere prese prima di iniettarlo cDNA nel nucleo dei neuroni. La procedura di isolamento per i neuroni è oltre la portata di questo articolo, ma è importante avere i neuroni dissociate in singole cellule e ben aderente alla superficie inferiore di 35 millimetri dishes cellule cultura (vedi discussione per consigli utili per raggiungere questo obiettivo). Anche se una serie di neuroni diversi potrebbero essere utilizzati, gangli periferici come i gangli cervicale superiore (SCG) o gangli delle radici dorsali sono da preferire per la dissezione perché sono comodamente accessibili e produrre un gran numero di neuroni. Ulteriori vantaggi di usare i neuroni SCG è che sono una popolazione relativamente omogenea di cellule e ben caratterizzati 1,2,3,4. A. Preparazione del plasmide cDNA per l&#39;iniezione <ol><li> Per prevenire la contaminazione o rottura del DNA, i guanti dovrebbero essere indossati durante la preparazione. </li><li> DNA che codifica per la proteina di interesse è subcloned in un vettore adatto espressione mammiferi, come il PCI (Promega, Madison, WI), ai sensi del regolamento del altamente e costitutivamente attiva da citomegalovirus (CMV) promotore. Se la proteina non è etichettato, un reporter plasmide, EGFP codifica per esempio (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), è co-iniettata per confermare l&#39;iniezione di successo e di espressione. Il DNA è isolato con una alta colonna di separazione di qualità (ad esempio QIAfilter Midi-preparazione kit, Qiagen, Chatsworth, CA) e ulteriormente purificato con una unità di centrifuga filtro con un filtro di PVDF (0,1 micron, Millipore, Bedford, MA) per rimuovere le particelle in preparazione plasmide, che può ostruire pipette iniezione durante il processo di iniezione. I plasmidi sono conservati a -20 ° C ad una concentrazione di circa 1 mg / mL in un buffer adeguato stoccaggio del DNA (es. tampone TE: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0). </li><li> Immediatamente prima di microiniezione, cDNA plasmidico sono diluiti e mescolati alla concentrazione finale desiderata in TE buffer o H 2 O. Tipicamente, 5-10 ng / ml di gene reporter è sufficiente per etichettare le cellule iniettate, e la concentrazione totale di cDNA da iniettare non deve superare i 200 ng / mL dato che il DNA è viscoso ad alte concentrazioni e può ostruire pipette iniezione. Una piccola quantità di cDNA per l&#39;iniezione (microlitri 5-10) si prepara mescolando gocce di soluzione sulla superficie pulita di un piccolo pezzo di Parafilm (lato sotto lo strato di carta). Mescolare le gocce di soluzione insieme da pipeting su e giù più volte con un pipetor ed evitare l&#39;introduzione di bolle d&#39;aria durante la miscelazione. </li><li> Utilizzando una punta pipetta microloader (Eppendorf, Brinkmann Instruments, Westbury, NY), trasferire la soluzione cDNA ad un tubo di ematocrito appositamente preparato (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Vedere la sezione materiali per le istruzioni sulla preparazione dei tubi di ematocrito (tabella materiali). Posizionare il tubo contenente la soluzione ematocrito cDNA iniezione in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Centrifugare la provetta per 15-30 minuti a 10 000 g in una microcentrifuga dotato di un rotore ad angolo fisso o oscillante (Eppendorf), a temperatura ambiente (20-24 ° C) per particelle di sedimento nella soluzione cDNA che possono bloccare le microiniezione pipetta. La soluzione iniettabile cDNA possono essere conservati a temperatura ambiente durante la sessione di iniezione. </li></ol> B. Realizzazione di pipette di iniezione <ol><li> Pipette monouso microiniezione di vetro sono disponibili in commercio (ad esempio Femtotips, Eppendorf), che sono convenienti ma costoso ($ 10 per ogni pipetta microiniezione). Pipette di iniezione può essere prodotto in laboratorio utilizzando un programmabile P-97 estrattore Flaming pipetta Brown (Instrument Company Sutter, Novato, CA) e filamented, a pareti sottili tubi di vetro borosilicato capillare (Strumenti di precisione mondiale, Sarasota, FL). Questa opzione è più conveniente e consente il controllo di forma e dimensione microiniezione pipetta. </li><li> A due stadi programma viene utilizzato per tirare strette puntali microiniezione. Dal momento che l&#39;apertura di pipette microiniezione è troppo stretto per esaminare al microscopio ottico, la qualità di pipette di iniezione devono essere valutate direttamente iniettando poche cellule prima che le impostazioni del programma sono finalizzati. Di seguito sono approssimativi impostazioni per le impostazioni di calore, tirare, velocità e tempo: (pull 1) 600, 115, 15, 250; (pull 2) 640, 130, 65, 200. Queste impostazioni variano a diversi lotti di vetro e dalla condizione del filamento di riscaldamento l&#39;estrattore, e deve essere adattata alle necessità. Per maggiori dettagli vedi 5. </li><li> Tirare diversi (2-5) pipette di iniezione per ogni piatto di neuroni da iniettare, in caso di danni o problemi durante la sessione di iniezione. Pipette iniezione di conservare in un recipiente coperto, per evitare che la polvere di entrare la punta della pipetta microiniezione. </li></ol> II. Microiniezione intranucleari tenda &quot;&gt; In questa sezione i dettagli del processo di iniezione del DNA nel nucleo dei neuroni. microiniezione Un set-up base comprende una rovesciata microscopio a contrasto di fase (ad esempio Nikon Diaphot TMD, Nikon, Melville, NY) per visualizzare il processo, micromanipolatore (ad esempio Eppendorf 5171) per controllare il movimento della pipetta di iniezione e una pressione di iniezione (ad esempio Eppendorf FemtoJet Express) per espellere la soluzione di cDNA dalla pipetta. Collegamento della pressione iniettore al micromanipolatore consente la sincronizzazione di questi ultimi due processi durante le iniezioni. Other facoltativo, ma altamente raccomandato, componenti includono un sistema di monitoraggio video montato (CCD, Cohu Inc., San Diego, CA; bianco e nero, monitor video, Sony Corporation, Tokyo, Giappone). Questo sistema non è un requisito assoluto per preparazioni iniettabili; tuttavia, il monitor in bianco e nero offre un elevato contrasto per una migliore visualizzazione del nucleo cellulare e offre una visualizzazione più confortevole durante le sessioni di iniezione lungo. Inoltre, un computer portatile con software per gestire un portatile controller può essere utilizzato per semi- automatizzare il processo di iniezione (vedi la discussione per i dettagli). Il momento ideale per iniettare neuroni SCG è di 3-6 ore dopo la dissociazione. A questo punto, le cellule sono sferiche, strettamente collegato al fondo del piatto, e il nucleo è chiaramente visibile, sotto un microscopio a contrasto di fase, come una centrale rotondo organello con una membrana scura, contenente un singolo o più nucleoli (Figura 1A). <ol><li> Posizionare un piatto di neuroni dissociato al centro del palco microscopio. Regolare la messa a fuoco e ottimizzare l&#39;ottica a contrasto di fase del microscopio così i nuclei dei neuroni sono chiaramente visibili. </li><li> Pipettare 2 ml di soluzione preparata cDNA in una pipetta microiniezione con una punta di pipetta microloader. Evitare di elaborare una soluzione vicino al fondo della provetta ematocrito dal momento che questo può suscitare le particelle che si stabilì durante la centrifugazione. Il filamento in pipette microiniezione dovrebbero aiutare nel disegno soluzione per la punta, ma se persistono piccole bolle d&#39;aria, picchietti leggermente la parte del vetro per rimuoverli. </li><li> Inserire la pipetta microiniezione nel supporto capillare della pressione degli iniettori e quindi fissare il supporto al micromanipolatore. Il titolare è fissato ad un angolo di 45 °. </li><li> Abbassare la pipetta microiniezione nel piatto. Come la pipetta entra nel terreno di coltura, si forma un menisco che influisce sulla rifrazione della luce e riduce la qualità dell&#39;immagine dei neuroni. Per alleviare questo problema, la torretta anello di fase può essere leggermente spostata fino a quando i nuclei dei neuroni sono ancora chiaramente visibili. </li><li> Alcuni sistemi di pressione di iniezione hanno una funzione &quot;pulito&quot; che si applica la massima pressione d&#39;aria dalla punta microiniezione pipetta per una breve durata. Utilizzare questa funzione per cancellare la pipetta di detriti prima dell&#39;inizio e durante le iniezioni, se la punta sembra intasato. Se il liquido disperso non è visibile sullo schermo durante l&#39;utilizzo di questa funzione, sostituire con una pipetta nuova iniezione. </li><li> Centro la pipetta microiniezione nel monitor di visualizzazione e allineare la punta accanto a un neurone e nello stesso piano focale come il nucleolo. Impostare questa posizione più bassa l&#39;asse z limite al micromanipolatore. Questa posizione è la profondità della pipetta microiniezione avanzeranno al durante le iniezioni. Ora la posizione della punta di circa 30 micron di sopra di questo punto quindi la pipetta microiniezione cancella la parte superiore dei neuroni. </li><li> La modalità di &quot;iniettare&quot; di un micromanipolatore 5171 Eppendorf può essere definito con le seguenti impostazioni per eseguire iniezioni intranucleari. Il iniettare funzione è attiva, mentre la funzione di impalare è lasciato. Un percorso di iniezione diagonale (lungo la X e Z-asse) produce la minor quantità di danno cellulare, e quindi la modalità assiale deve essere utilizzato per preparazioni iniettabili. Una velocità d&#39;iniezione di 300 micron / s è sufficiente, e sincronizzare l&#39;accumulo di pressione quando la pipetta microiniezione raggiunge la serie z limite. </li><li> La pressione iniettore controlla la quantità di soluzione cDNA iniettato nel nucleo. Nella modalità &quot;automatico&quot; di iniezione, la consegna del DNA è a tempo controllato e avviato dal micromanipolatore collegati. La pressione di iniezione (Pi) dovrebbe essere impostata tra 100-200 ettopascal (hPa, 1 hPa ~ 0,015 psi); pressioni d&#39;iniezione superiori non migliorano i tassi di successo o la qualità delle iniezioni e può indicare altri problemi con le dimensioni punta microiniezione pipetta o la purezza del DNA . Una durata di iniezione (ti) di 0,3 s ed una pressione di compensazione (Pc) di 30 hPa, che fornisce una pressione costante positiva a evitare l&#39;entrata di occlusione particelle dal mezzo di coltura in la punta della pipetta, dovrebbe essere usato. </li><li> Posizionare il neurone per essere iniettato sotto la punta della pipetta microiniezione utilizzando il microscopio assi xy controllo stadio. Allineare la punta della pipetta sopra il centro del nucleo, concentrandosi avanti e indietro tra tlui punta e nucleoli. </li><li> Iniettare il nucleo premendo il pulsante di iniettare (in micromanipolatore). Per la fase di iniezione, il movimento della pipetta microiniezione e il rilascio della soluzione di cDNA sono controllati dal micromanipolatore. E &#39;difficile confermare il successo iniezioni intranucleari ad occhio, ma l&#39;iniezione della soluzione di viscosità relativamente bassa cDNA (rispetto per l&#39;ambiente viscoso nucleare), appare spesso come una piuma bianca in contrasto di fase ottica e può essere utilizzato come indicatore di iniezione nel nucleo. A volte la pipetta microiniezione non penetra la membrana nucleare e trilli semplicemente il nucleo. Un tentativo seconda iniezione nella stessa posizione può portare ad una iniezione di successo del DNA nel nucleo. Rigonfiamento della cellula è di solito indicativa di involontaria iniezione citoplasmatica. Inoltre, significativo rigonfiamento nucleare non è ben tollerato dai neuroni e di solito porta alla morte cellulare subito dopo, così, la pressione di iniezione e la durata non deve superare i valori suggeriti. </li><li> Continua iniettando neuroni, riposizionando la fase microscopio per allineare il neurone successivo sotto la pipetta microiniezione. Sistematicamente navigare attraverso il piatto di iniettare circa 50-100 nuclei prima di tornare il piatto dei neuroni per l&#39;incubatore per l&#39;incubazione durante la notte. Neuroni con successo iniettato può essere identificato il giorno successivo dalla espressione del gene reporter. </li></ol> III. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/1614/1614fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: ganglio cervicale superiore (SCG) neuroni. Contrasto di fase della SCG neuroni 3 ore successive alla dissociazione (A). In questa fase, il nucleo è chiaramente visibile che favorisce l&#39;allineamento della punta della pipetta microiniezione. Il nucleo appare al centro di neuroni con un singolo (a sinistra) o multipla (a destra) nucleoli scuro. SCG neuroni 16 ore dopo l&#39;iniezione di EGFP cDNA nel nucleo (B). Sinistra, SCG neuroni visto sotto a contrasto di fase illuminazione. A destra, immagine epifluorescente dei neuroni stessi che mostra l&#39;iniezione di successo e conseguente espressione di EGFP in un neurone. Barra di scala bianca è di 20 micron. <img src="/files/ftp_upload/1614/1614figure2tmb.jpg" alt="Figura 2" border="0" /> Figura 2: Whole-cell registrazioni delle correnti attraverso heterologously-espresso proteine ​​G accoppiate interiormente rettificazione K + (GIRK) canali da SCG neuroni. GIRK correnti (I GIRK) sono stati evocati da una rampa di tensione di 200 ms da -140 a +40 mV da un potenziale di detenzione di -60 mV (inserto di A) dopo l&#39;attivazione del endogena α 2-adrenergici di noradrenalina (NE, 10 mM) . Tracce sovrapposte sono registrazioni dal neurone stesso e indicare prima (nero) e dopo l&#39;applicazione di uno solo NE (blu) o NE più 10 mM Ba 2 + (rosso). Le linee tratteggiate indicano il livello zero di corrente. Per la registrazione io GIRK, la soluzione esterna contenuta (in mm) 130 NaCl, 5.4 KCl, 10 HEPES, 10 CaCl 2, 0,8 MgCl 2, 15 di glucosio, 15 saccarosio, e 0,0003 TTX, portato a pH 7.4 con NaOH. La soluzione di registrazione interna contenuta (in mm) 135 KCl, 11 EGTA, 1 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 4 MgATP, e 0,3 Na 2 GTP, portato a pH 7.2 con KOH. La mancanza di corrente suscitato dalla rampa di tensione in presenza di NE in uninjected neuroni SCG (A) dimostra che i neuroni SCG non esprimono canali GIRK endogena. Iniezione di successo di plasmide codifica cDNA un funzionale GIRK canale 11 dà luogo a grandi correnti durante la rampa di tensione quando esposto a NE (B, a sinistra). Le correnti hanno le caratteristiche tipiche delle correnti attraverso i canali GIRK: l&#39;attivazione di una proteina G agonista del recettore accoppiato (NE), la rettificazione verso l&#39;interno, e il blocco delle correnti dai bloccante putativo canale GIRK, Ba 2 + (B, traccia a destra rosso). Cerchi aperti e pieni rappresentano io GIRK presso l&#39;azienda e la corrente di picco, rispettivamente. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1614/1614figure2.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 2.

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</ol>

Problemi comuni riscontrati e suggerimenti: Come accennato in precedenza, le iniezioni di successo nucleare dipendono dall&#39;avere cellule aderenti alle piastre di coltura dei tessuti. Posticipando l&#39;inizio di iniezioni poche ore dopo la procedura cellula dissociazione permette ai neuroni di aderire al fondo dei piatti. In aggiunta, piatti rivestimento con 0,1 mg / ml di alto peso molecolare poli-L-lisina (Sigma, St. Louis, MO) adesione aiuti di neuroni alla superficie inferiore dei piatti. Blocco di pipette microiniezione, soprattutto quando si cerca di iniettare una elevata concentrazione di DNA, può essere un problema frequente. Utilizzando alta qualità colonne di separazione per isolare e purificare DNA plasmidico, e di eseguire la procedura di purificazione addizionale citato (filtri spin, spinning in tubi di ematocrito) può contribuire a rimuovere le particelle prima di iniettarlo. Durante le iniezioni, la funzione &quot;pulita&quot; della pressione iniettore può essere utilizzato (per 0,2 s è sufficiente), ma se questo non risolve il problema, una pipetta nuova iniezione dovrebbe essere usato. Se la maggioranza di pipette microiniezione occludersi durante una sessione di iniezione, in considerazione modificando le impostazioni del estrattore pipetta di vetro per la produzione di puntali microiniezione con una maggiore apertura. Un altro problema che si pone nel corso di iniezioni nucleare è l&#39;irregolarità della superficie inferiore di piatti di coltura di tessuti. Questa variabilità influenza direttamente la precisione di mira puntali di iniezione al nucleo in quanto la profondità del attraversa pipetta durante le iniezioni è fisso. Pertanto, questo asse z limite deve essere regolato durante il ciclo di iniezioni all&#39;interno della stesso piatto. Sarà evidente quando un adeguamento è necessario: non ci sarà alcuna indicazione di iniezione nucleare (nessun pennacchio bianco o nel nucleo della cellula è mancato del tutto), o la punta della pipetta di iniezione si avvicina al fondo del piatto (comprimendo la cellula o anche schiantarsi la punta della pipetta sul fondo del piatto). Vetro-clonazione cilindri (. OD 10 mm, Cat. No. 2090-01010, Bellco Vetro, Vineland, NJ) possono essere utilizzati durante la placcatura dei neuroni di limitare in un più piccolo, un&#39;area più limitata, quindi riducendo al minimo la distanza necessaria per muoversi la pipetta di iniezione tra le iniezioni. Questi cilindri clonazione sono stati rimossi prima di eseguire microiniezioni. Svantaggi della tecnica: Microiniezioni intranucleari sono tecnicamente impegnativi, che richiedono pazienza e un alto grado di destrezza manuale da parte dell&#39;operatore. Competenza con questa tecnica, come ogni altra abilità, viene con la pratica. Quindi, si consiglia di praticare iniezioni nucleare del gene reporter solo prima di tentare esperimenti reali. Per aiutare ulteriormente il processo di iniezione, può essere possibile consolidare i passi del micromanipolatore e la pressione di iniezione in un programma per computer. Programmi come Igor Pro (WaveMetrics, Lake Oswego, OR) possono essere utilizzati per memorizzare le impostazioni microiniezione e programmare i controllori multifunzione (ShuttlePRO, Contour Design, Windham, NH) per semi-automatizzare il processo di iniezione (vedere 6,7,8 per i dettagli). Un altro svantaggio della tecnica microiniezione intranucleari è la bassa percentuale di successo. Circa il 10-20% dei tentativi iniezioni nucleare portare ad espressione della proteina. Anche se questa efficienza può essere sufficiente per le applicazioni che non richiedono un gran numero di cellule che esprimono, elettrofisiologia ad esempio, per vari saggi biochimici questo potrebbe non essere sufficiente. Le applicazioni della tecnica: Nonostante i suoi svantaggi, microiniezione intranucleari del DNA è una tecnica estremamente utile per heterologously che esprimono proteine ​​nei neuroni. Alti livelli di espressione della proteina si ottengono con microiniezioni nucleare a causa del gran numero di plasmidi rilasciato nel nucleo durante le iniezioni, un promotore molto attivo CMV, che regolano la trascrizione genica, e la stabilità a lungo di plasmidi nel nucleo. Proteine ​​sovra-espressione è particolarmente utile nelle dominante negativo esperimenti in cui sono richiesti alti livelli di proteine ​​eterologhe per sopraffare la proteina endogena. Un altro vantaggio di intranucleari iniezioni è la capacità di fornire una percentuale consistente di costrutti cDNA al nucleo quando costruisce più vengono iniettati. Con i metodi di transfezione altra parte, è difficile introdurre riproducibile la stessa proporzione di DNA ogni costrutto in cellule diverse all&#39;interno dello stesso piatto e tra trasfezioni. Iniezione diretta di soluzione cDNA nel nucleo elimina questa fonte di variabilità e permette il rapporto tra proteine ​​espresse da essere titolati in modo efficace. Metodi di trasfezione tradizionali hanno efficacia limitata nel post-mitotico delle cellule a causa della scarsa incorporazione di DNA nel nucleo 9 e tossicità chimica associata a REAG trasfezionegenitori 10. Microiniezioni nucleare superare questi problemi attraverso l&#39;introduzione di materiale genetico nel nucleo meccanicamente. Sebbene questa tecnica è più coinvolto, la possibilità di studiare l&#39;effetto di una proteina in un sistema biologico funzionale, completo di endogeno vie di segnalazione, più che compensa la natura laboriosa di questa tecnica. Tutte le procedure sperimentali su animali sono stati eseguiti in conformità con il National Institutes of Health Linee guida per la cura degli animali e Usa.

<table><tbody><tr><td>Unità filtrante Ultrafree-MC</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC30VV00</td><td>Filtro Durapore PVDF; dimensione dei pori 0,1 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>Tampone TE</td><td>Quality Biological, Inc.</td><td>351-010-131</td><td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0</td></tr><tr><td>Capillari per microematocrito</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362-574</td><td>Preparazione non eparinizzata:&lt;br/&gt;Immergere in etanolo al 100% per tutta la notte. Lavare accuratamente tre volte con acqua deionizzata ed essiccare in forno (95&amp;#x00B0;C). Tagliare i capillari puliti in pezzi lunghi 3-4 cm utilizzando un punteruolo a punta di diamante, sigillare un'estremità con una fiamma e pinzette per tenere fermo il vetro. Conservare in un becher di vetro pulito e coprire per evitare l'accumulo di polvere.</td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5417 R</td><td>Con rotore ad angolo fisso o a cestello oscillante</td></tr><tr><td>Punte per pipetta Microloader da 20 &amp;mu;l</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>Vetro capillare per microiniezione</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW120F-4</td><td>A pareti sottili con filamento, diametro esterno 1,2 mm, diametro interno 0,9 mm, lunghezza 100 mm</td></tr><tr><td>Tiratore di micropipette Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>Con filamento a scatola in platino-iridio (codice pezzo # FB330B)</td></tr><tr><td>Microscopio invertito Nikon Diaphot TMD</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Ottiche obiettive a contrasto di fase 20x e 40x, montate su un tavolo isolato dalle vibrazioni</td></tr><tr><td>Telecamera a dispositivo a accoppiamento di carica (CCD)</td><td>Cohu Inc.</td><td>6410</td><td></td></tr><tr><td>Monitor video</td><td>Sony Corporation</td><td>PVM-122</td><td>Bianco e nero, schermo da 9&amp;#8221;</td></tr><tr><td>Sistema di micromanipolazione</td><td>Eppendorf</td><td>5171</td><td></td></tr><tr><td>Unità di microiniezione</td><td>Eppendorf</td><td>FemtoJet Express</td><td></td></tr><tr><td>Controllore di microiniezione</td><td>Contour Design</td><td>S-PROV2</td><td>Controllore multimediale programmabile</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics</td><td>Versione 4.05A</td><td>Programma comandi per controllare il controllore di microiniezione scritto da S. Ikeda</td></tr></tbody></table>

microiniezione intranucleari di dna in dissociato neuroni dei mammiferi adulti

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Colture primarie di cellule neuronali sono strumenti preziosi per lo studio della funzione delle proteine ​​in quanto rappresentano un sistema più biologicamente rilevanti rispetto alle linee cellulari immortalizzate. Tuttavia, il post-mitotico natura di neuroni primari impedisce un&#39;efficace espressione eterologa proteine ​​mediante procedure comuni come l&#39;elettroporazione o chimicamente mediata trasfezione. Così, altre tecniche devono essere impiegati per esprimere efficacemente le proteine ​​in queste cellule non si dividono. In questo articolo, si descrivono i passaggi necessari per eseguire iniezioni intranucleari di costrutti di cDNA dissociato in neuroni adulti simpatico. Questa tecnica, che è stata applicata a diversi tipi di neuroni, possono con successo indurre l&#39;espressione di proteine ​​eterologhe. L&#39;attrezzatura indispensabile per la procedura di microiniezione comprende un microscopio invertito per visualizzare le cellule, una pipetta di iniezione di vetro riempita con una soluzione di cDNA che è collegato ad un 2 N (g), sistema di pressione di consegna, e di un micromanipolatore. Il micromanipolatore coordina il movimento iniezione di pipetta microiniezione con un breve impulso di pressione N 2 per espellere soluzione cDNA dalla punta pipetta. Questa tecnica non ha la tossicità associata a molti metodi di trasfezione altri costrutti del DNA e permette più di essere espresso con un rapporto costante. Il basso numero di cellule iniettate rende la procedura di microiniezione adatto per gli studi di singola cellula, come le registrazioni elettrofisiologiche e di imaging ottico, ma potrebbe non essere l&#39;ideale per le analisi biochimiche che richiedono un numero maggiore di cellule e l&#39;efficienza di trasfezione superiore. Anche se microiniezioni intranucleari richiedono un investimento di attrezzature e di tempo, la capacità di raggiungere alti livelli di espressione della proteina eterologa in un ambiente fisiologicamente rilevanti rende questa tecnica uno strumento molto utile per studiare la funzione delle proteine.

Iniezione diretta intranucleari di cDNA è una tecnica di transfezione efficace per la post-mitotico delle cellule. Questo metodo fornisce un alto livello di espressione della proteina eterologa dai costrutti di cDNA singole o multiple e consente la funzione delle proteine ​​da studiare in un ambiente fisiologicamente rilevanti con una serie di saggi di singola cellula.

Microiniezione intranucleari di DNA in dissociato neuroni dei mammiferi adulti

Le colture primarie di cellule neuronali sono strumenti preziosi per studiare la funzione proteica, poiché rappresentano un sistema biologicamente più pertinente rispetto a...

Nel primo passaggio di questa procedura di iniezione, una concentrazione lavorativa di soluzione di DNA viene centrifugata per formare un precipitato. Successivamente, le pipette per iniezione di materiale particolato, realizzate in capillari di vetro borosilicato, vengono riempite con la soluzione di DNA. Le cellule vengono posizionate sul palchetto del microscopio e la visualizzazione del nucleo cellulare viene ottimizzata.La pipetta viene allineata con il nucleo e la cellula viene iniettata. Il giorno seguente vengono iniettate più cellule in ogni piastra. Le cellule iniettate con successo vengono identificate mediante l'espressione di un gene reporter.Ciao, sono Van Mu del laboratorio del Dottor Stephen Akeda presso l'Istituto Nazionale sull'Abuso di Alcol e l'Alcolismo dei National Institutes of Health. Sono Damien Williams, anch'io del Laboratorio Akeda. E sono Eugene Run del Laboratorio AKEDA.Oggi vi mostreremo la procedura per la microiniezione INTERCLEAR di costrutti CDNA in neuroni dissociati. Questo è un metodo efficace per esprimere in modo eterologo proteine di interesse in cellule post-mitotiche, che tradizionalmente sono difficili da trasfettare. Utilizziamo questa tecnica nel nostro laboratorio per studiare i meccanismi alla base della modulazione delle proteine G sui canali N.Quindi iniziamo con denti scuri. Piastrare innanzitutto neuroni mammiferi adulti dissociati su piatti per coltura cellulare rivestiti con poli-L-lisina ad alto peso molecolare a 0,1 milligrammi per millilitro. Questo favorisce l'adesione dei neuroni alla superficie inferiore dei piatti.Si possono utilizzare cilindri di vetro per clonazione per concentrare i neuroni piastrati in un'area più piccola e ristretta. Per ridurre al minimo la distanza tra i neuroni da iniettare, posizionare le piastre in un incubatore a 37 gradi Celsius per tre-sei ore prima di eseguire microiniezioni intranucleari, in modo da consentire un tempo sufficiente affinché le cellule aderiscano al fondo delle piastre.Mentre i neuroni sono in incubazione, le pipette per microiniezione vengono preparate utilizzando un estrattore Sutter P 97 e capillari di vetro borosilicato con pareti sottili. Utilizziamo un programma di estrazione in due fasi con le seguenti impostazioni per la prima estrazione e per la seconda. Poiché le impostazioni richieste variano a seconda dei diversi lotti di vetro e dello stato del filamento riscaldante nell'estrattore, queste devono essere regolate secondo necessità.Devono essere preparate almeno cinque pipette per iniezione per ogni piastra di neuroni, nel caso in cui le pipette si danneggino o si verifichino problemi durante la sessione di iniezione. Le pipette per iniezione preparate devono essere conservate in un contenitore coperto per evitare che la polvere entri nella punta della pipetta per microiniezione immediatamente prima dell'iniezione. I plasmidi cDNA vengono diluiti alla concentrazione di lavoro. Posizionare un piccolo pezzo di paraformaldeide sulla superficie di lavoro e rimuovere il supporto di carta.Aggiungere la soluzione madre di CDNA e il buffer TE al param. Per diluire il CDNA, si raccomanda di utilizzare una concentrazione finale di CDNA inferiore a 200 nanogrammi per microlitro e un volume totale compreso tra 2 e 10 microlitri. Se la proteina codificata dal CDNA non è marcata, un plasmide reporter che codifica, ad esempio, EGFP, può essere co-iniettato insieme al CDNA sperimentale. Per confermare un'iniezione e un'espressione riuscite, mescolare le soluzioni di CDNA aspirando e dispensando più volte con la pipetta su perfil.Avendo cura di evitare l'introduzione di bolle d'aria, per sedimentare eventuali particelle nella soluzione di cDNA che potrebbero successivamente ostruire la pipetta di microiniezione. Utilizzare una punta di pipetta micro loader per trasferirla in un tubo per ematocrito preparato, che sia stato pulito, tagliato e sigillato a fiamma a un'estremità. Successivamente, inserire il tubo per ematocrito in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare per 15-30 minuti.10.000 GS a temperatura ambiente. Al termine della centrifugazione, mettere da parte il tubo contenente la soluzione di iniezione di cDNA. La soluzione può essere mantenuta a temperatura ambiente durante la sessione di iniezione per una o due ore.Dopo aver seminato le cellule, rimuovere i cilindri di vetro per clonazione. Quindi reinserire le cellule seminate nell'incubatore per il tempo rimanente di incubazione prima della sessione di iniezione. Per iniziare le iniezioni, prelevare innanzitutto una piastra di neuroni seminati dall'incubatore e posizionarla sul tavolo del microscopio di un sistema di iniezione.L'apparato è costituito da un microscopio a contrasto di fase invertito, da un iniettore a pressione collegato a un micromanipolatore e da un sistema di monitoraggio video. In condizioni di contrasto di fase, i neuroni appaiono come cellule sferiche con un nucleo chiaramente visibile, riconoscibile come un organulo centrale di forma rotonda con una membrana scura, e possono contenere uno o più nucleoli. Utilizzando una punta di pipetta micro loader, aspirare due microlitri del CD NA preparato dal tubo ematocrito.Avendo cura di evitare la soluzione vicino al fondo del tubo, dove le particelle potrebbero essersi depositate. Trasferire la soluzione in una pipetta per microiniezione. Il filamento presente all'interno della pipetta per microiniezione deve favorire il movimento della soluzione verso la punta.Tuttavia, se persistono piccole bolle d'aria, battere leggermente il lato del vetro per rimuoverle ed assicurarsi che il supporto del capillare dell'iniettore a pressione sia fissato con un angolo di 45 gradi. Inserire quindi la pipetta per microiniezione nel supporto del capillare e fissare il supporto al micromanipolatore. Successivamente, abbassare la pipetta per microiniezione nella piastra utilizzando il micromanipolatore; quando la pipetta entra nel mezzo di coltura, si forma un menisco che altera il percorso della luce attraverso il campione e riduce così la qualità dell'immagine dei neuroni.Per alleviare questo problema, regolare la torretta di messa a fuoco fino a quando i nuclei dei neuroni non risultano chiaramente visibili. Prima di iniziare le iniezioni, utilizzare la funzione di pulizia del sistema di iniezione a pressione per rimuovere eventuali detriti dalla pipetta e per verificare la qualità delle micropipette per iniezioni.La soluzione espulsa dovrebbe essere visibile sullo schermo. Utilizzando questa funzione, il liquido proveniente da una punta di pipetta di dimensioni ottimali viene espulso sotto forma di un sottile getto. Se la pipetta per microiniezione è ostruita o troppo stretta, non espellerà liquido quando viene utilizzata la funzione di pulizia.Se la punta è troppo larga o è stata rotta, il liquido verrà espulso dalla punta sotto forma di un flusso ampio. Se durante le iniezioni la punta appare non ottimale, sostituire ora la pipetta di iniezione e centrare la pipetta per microiniezione sul monitor di visualizzazione. Mantenendo il nucleo a fuoco, abbassare la punta della pipetta fino a quando non sarà a fuoco adiacente a un neurone.Impostare questa posizione come limite inferiore dell'asse Z sul micromanipolatore. Questa posizione corrisponde alla profondità alla quale la pipetta per microiniezione avanzerà durante le iniezioni. Successivamente, posizionare la punta a circa 30 micrometri sopra questo punto.Pertanto, la pipetta per microiniezione supera la parte superiore dei neuroni. Ora programmare le impostazioni del micromanipolatore per le microiniezioni. Impostare la modalità di iniezione di un micromanipolatore einor su on e la funzione di impalamento su off per minimizzare i danni cellulari.Durante la microiniezione, designare un percorso diagonale di iniezione selezionando la modalità assiale. Impostare la velocità di iniezione a 300 micrometri al secondo e sincronizzare l'accumulo di pressione al limite. Prossimo programma.Le impostazioni dell'injectore a pressione stabiliscono la pressione di iniezione o PI tra 100 e 200 hPa, la durata dell'iniezione o ti a 0,3 secondi e la pressione di compensazione o PC a 30 hPa. Una volta regolate le impostazioni del manipolatore, è possibile effettuare iniezioni intranucleari. Utilizzando il controllo della posizione del palchetto lungo gli assi XY del microscopio, posizionare il neurone sotto la punta della pipetta per microiniezione.Allineare la punta della pipetta sopra il centro del nucleo focalizzando in alto e in basso tra la punta e il nucleo. Iniettare il nucleo premendo il pulsante di iniezione sul micromanipolatore. L'iniezione della viscosità relativamente bassa.La soluzione di cDNA appare spesso come una nuvola bianca nel nucleo, quando osservata con ottica a contrasto di fase. Continuare a iniettare nei neuroni riposizionando il tavolo del microscopio in modo da allineare il neurone successivo sotto la pipetta di microiniezione.Navigare sistematicamente attraverso la piastra. Continuare a iniettare nuclei. Utilizzare la funzione di pulizia descritta in precedenza ogni 10-15 iniezioni per verificare la qualità della pipetta per microiniezione.Se la pipetta è ostruita o danneggiata, sostituirla con una nuova iniezione. L'irregolarità della superficie inferiore delle piastre per colture cellulari può causare il mancato raggiungimento della cellula da parte della pipetta di iniezione o impedire la visibilità del pennacchio bianco nel nucleo. In questi casi, regolare semplicemente la punta della pipetta per microiniezione sullo stesso piano di fuoco del nucleo e impostare questo come nuovo limite dell'asse x.Quindi continuare ad iniettare nei neuroni. A volte la pipetta per microiniezione non penetra la membrana nucleare e semplicemente sposta il nucleo. Se ciò accade, un secondo tentativo di iniezione nella stessa posizione può portare a un'iniezione riuscita del DNA all'interno del nucleo.L'ingrossamento della cellula di solito indica un'iniezione citoplasmatica involontaria. Una volta iniettati da 50 a cento nuclei, riposizionare la piastra di neuroni nell'incubatore per un'incubazione notturna. Dopo 16 ore, i neuroni correttamente iniettati possono essere identificati mediante l'espressione di un gene reporter.In questo campo, un neurone del ganglio cervicale superiore (SCG) è stato iniettato e può essere identificato dall'espressione di EGFP. I neuroni SCG non iniettati, che non possiedono canali del potassio rettificanti entranti accoppiati a proteine G endogeni o canali grk, non generano correnti misurabili durante una rampa di tensione. Quando invece vengono esposti all'agonista del recettore accoppiato a proteina G, la noradrenalina, l'iniezione riuscita di un plasmide CD NA codificante un canale grk funzionale induce l'insorgenza di correnti elevate durante una rampa di tensione in presenza di noradrenalina.Le correnti misurate qui sono tipiche dei canali Kir e sono caratterizzate dall'attivazione da parte della noradrenalina, dalla rettificazione entrante e dall'inibizione da parte del presunto bloccante del canale Kir. Il bario. Abbiamo appena mostrato come iniettare il DNAc nel nucleo dei neuroni. Quando si esegue questa tecnica, è importante ricordare quattro cose.Uno, far ruotare il DNA prima dell'iniezione. Due, assicurarsi che il nucleo sia chiaramente visibile. Tre, riregolare il limite dell'asse Z durante la navigazione intorno alla piastra.E quattro, controllare regolarmente la qualità del capillare tra un'iniezione e l'altra. Grazie per aver guardato e buona fortuna con il vostro esperimento.

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