Un Reporter Novel RFP per aiutare nella visualizzazione del Disco Eye immaginale in Drosophila

La nuova linea transgenica di Drosophila con reporter IRFP esprime la proteina fluorescente rossa, o RFP, in cellule specifiche del disco immaginale I. Questa linea transgenica può facilitare l'identificazione, la dissezione e l'etichettatura di tipi cellulari specifici nell'occhio in via di sviluppo. Per dissezionare il disco immaginale dell'occhio, larve vaganti in terzo stadio vengono prelevate dal lato di un flacone mediante una spatola.

I larvi vengono quindi posizionati in una goccia di PBS su una piastra di vetro. Le parti boccali con i dischi oculari adesi vengono rimossi dal resto del larva utilizzando pinzette; successivamente i dischi oculari vengono trasferiti su un vetrino, dove vengono dissezionati separatamente dalle parti boccali e dal cervello. Ciao, sono Amna Cole del laboratorio di Joseph Bateman presso il Wolfson Center for Age Related Diseases, King's College London.

Oggi vi mostreremo un procedimento per dissezionare i dischi immaginali dell'occhio da Drosophila. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare i geni coinvolti nella neurogenesi. Cominciamo dunque.

Per iniziare la dissezione dei dischi immaginali dell'occhio, posizionare una goccia di PBS su una piastra di Petri rivestita con Sylgard. Utilizzando un microscopio stereoscopico, il rivestimento in Sylgard aiuterà a proteggere le pinzette dai danni durante la dissezione. Successivamente, utilizzando una spatola, prendere una larva di terzo stadio in fase di erranza e posizionarla nella goccia di PBS. Tenendo una pinzetta in ciascuna mano, afferrare la larva a due terzi della lunghezza rispetto all'estremità posteriore con un paio di pinzette. A questo punto, utilizzare l'altro paio di pinzette per trattenere le parti boccali di colore scuro all'estremità anteriore della larva.

Separare delicatamente la larva muovendo la pinzetta in direzioni opposte. Le parti boccali dovrebbero staccarsi dal resto del corpo con il complesso occhio-cervello attaccato. Successivamente, posizionare una goccia di PBS su un vetrino e trasferire i dischi nella goccia di PBS tenendo le parti boccali.

Ora passare alla modalità di fluorescenza sul microscopio stereoscopico poiché solo i dischi immaginali dell'occhio esprimono RFP, che possono essere facilmente identificati come tessuto fluorescente rosso sovrapposto ai lobi ottici sferici per aumentare il contrasto dei dischi. Indirizzare la sorgente di luce fredda a fibra ottica ad un angolo obliquo rispetto al vetrino. I dischi immaginali dell'occhio sono attaccati ai lobi ottici tramite lo stelo ottico nella parte posteriore e alle parti boccali tramite uno stelo proveniente dal disco antennale nella parte anteriore.

Per dissezionare i dischi immaginali dell'occhio, tenere le parti utilizzando un paio di pinzette e usare l'altro paio per separare i dischi immaginali dell'occhio dal cervello della larva. Successivamente, separare i dischi immaginali dell'occhio dalle parti boccali. Una volta che le parti boccali sono state separate dai dischi immaginali dell'occhio, rimuoverle dal vetrino.

I dischi immaginali dell'occhio ora dovrebbero giacere piatti sul vetrino ed essere privi di qualsiasi tessuto estraneo, compreso il tessuto cerebrale. Continuare a dissezionare i dischi immaginali rimanenti. Una volta dissezionati tutti i dischi immaginali dell'occhio, inclinare delicatamente il vetrino e utilizzare un piccolo pezzo di carta da filtro per asciugare l'eccesso di PBS.

Ora aggiungere una goccia di mezzo di montaggio Vector Shield e posizionare delicatamente un coprioggetto sulla parte superiore. I dischetti sono ora pronti per essere analizzati mediante microscopia a fluorescenza in epifluorescenza o microscopia confocale. Se l'analisi verrà eseguita in un momento successivo, conservare il vetrino a quattro gradi Celsius.

L'RFP rimarrà visibile per almeno un anno durante l'acquisizione delle immagini della serie Z, che devono essere ottenute con un microscopio confocale o Zeiss aome con intervalli di un micrometro, utilizzando un obiettivo 20x o 40x; successivamente, le immagini di proiezione possono essere generate mediante il software del microscopio. I dischi immaginali di moscerini che esprimono IRFP sono stati dissezionati e colorati con Phin. L'analisi d'immagine è stata quindi eseguita con un microscopio zes aome con intervalli di un micrometro, utilizzando un obiettivo 20x. Le cellule del disco oculare, che esprimono RFP, sono mostrate in rosso.

La piega morfogenetica è visualizzata mediante foid e colorazione e appare in verde. I poli dorso-ventrali del disco oculare sono curvi e tendono a ripiegarsi. Queste sezioni possono essere escluse dall'immagine finale di proiezione.

Sebbene il disco sia un epitelio monostrato, le posizioni variabili dei nuclei richiedono una proiezione in serie Z per ottenere un'immagine complessiva del disco. Poiché il reporter IRFP è localizzato nel nucleo, il modello qui osservato rappresenta l'espressione nucleare di RFP. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire la procedura per dissezionare i dischi oculari vaginali da drosophila.

Quando si utilizza questa procedura, è preferibile usare una pinzetta fine ed è probabilmente consigliabile evitare anche il caffè. Grazie per aver guardato e buona fortuna con tutti i vostri esperimenti.