Name: Pulcino Ex ovo Cultura e Ex ovo CAM saggio: Come funziona veramente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 17 min 23 s
Description: Scopri la cultura ex ovo del pulcino e il saggio CAM per studiare angiogenesi e tumorigenesi. Questo metodo facilita l'accessibilità e la documentazione in vivo degli effetti sperimentali.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gli autori desiderano ringraziare J. Kueper e J. Wittschier per un&#39;eccellente assistenza tecnica e il Prof. Ruebben generosamente per la fornitura di materiale tumorale.

Tutte le attrezzature ei reagenti devono essere acquistati sterile o ha bisogno di essere calore o vapore, sterilizzati o sterilizzati con il 70% ETOH. Gli autori affermano che gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le Comunità europee direttiva del Consiglio (86/609/CEE), seguendo le linee guida del NIH per quanto riguarda la cura e l'uso di animali nelle procedure sperimentali e le norme stabilite dalla Animal Istituzionale Cura e uso Comitato (IACUC) presso l'Università di Duisburg-Essen (Germania). Parte 1: incubazione di uova <ol><li> Uova fecondate possono essere conservati a 13 ° C per un massimo di una settimana. </li><li> Le uova vengono incubate per 72 ore, in posizione orizzontale in un incubatore con un vassoio in movimento, ruotando le uova 12 volte al giorno in continuo. L'umidità è mantenuto a 60 - 62%, temperatura di incubazione a 37,5 ° C. Nota: Prima di iniziare l'incubazione, la sporcizia, piume ed escrementi sono accuratamente rimosso dai gusci d'uovo meccanicamente da un'asciugatura con comuni, asciugamani in carta grigia a zig-zag, che hanno una ruvida piuttosto che una struttura di superficie morbida. Pulendo le uova con etanolo o disinfettante, tuttavia, ha ridotto significativamente il tasso di sopravvivenza degli embrioni, indipendentemente dal liquido utilizzato. </li></ol> Parte 2: Ex cultura ovo <ol><li> Dopo incubazione per 72 ore, le uova vengono rimossi dal termostato. Nota: Le uova sono incubate per 72 ore perché - secondo i nostri esperimenti - per motivi sconosciuti, ma in accordo con Auerbach et fasi di sviluppo al.1 prima avevano tassi di sopravvivenza significativamente più bassi. Nelle fasi successive di 72 ore il sacco vitellino non ancora coperti dalla CAM diventa più sottile e tende ad aderire al guscio dell'uovo leader (i) a piccole emorragie nella zona di aderenza e (ii) la rottura del tuorlo, sacco membrana. Pertanto, il metodo presentato non è applicabile agli embrioni più di 72 ore. </li><li> La parte superiore delle uova, dove risiede l'embrione, è segnato dalla matita perché l'embrione resiste rotazione in una certa misura. </li><li> L'uovo è tenuto in orizzontale con il segno a matita sulla parte superiore e screpolata ai margini di un bar 80 triangolare mescolare millimetri magnetica perpendicolare che orientato lungo l'asse dell'uovo. Nota: per un feeling migliore, senza guanti devono essere utilizzati, ma le mani devono essere disinfettati con il 70% EtOH. E 'importante che il guscio d'uovo così come la membrana dell'uovo si aprono. Perdite di albume d'uovo è un segno sicuro che la membrana dell'uovo è stata perforata. </li><li> L'uovo è mantenuto vicino al fondo della scatola di Petri per evitare perdite maggiori di albume. Nota: durante la procedura di apertura iniziale, è importante che il bianco d'uovo sul fondo della scatola di Petri è ancora collegato al resto dentro l'uovo come questo si traduce in un vuoto dentro l'uovo che contiene il tuorlo con l'embrione in alto all'interno l'uovo. Il vuoto può essere regolata sia per la pressione delle dita che controlla l'ingresso di aria nel uovo o sollevando l'uovo che aumenta la colonna collegati albume cioè il vuoto. </li><li> Delicatamente applicando una pressione al meridiano che passa attraverso la fessura e l'equatore l'uovo con il pollice e il medio, è possibile regolare il vuoto. Il contenuto dell'uovo possono poi essere trasferiti al Petri danneggiato, se l'uovo con il tuorlo viene delicatamente sollevato e le due metà della conchiglia sono accuratamente separati. L'embrione e il tuorlo vasi dovrebbe trovarsi in cima ad un tuorlo integro. Nota: se il segno di matita non viene tenuto in alto, l'embrione potrebbe essere male quando rottura del guscio. Se le uova non sono incrinate con sufficiente attenzione o gli embrioni sono più vecchi di 72 ore (vedi sopra), il sacco vitellino si attacca al guscio e spesso rotture. Lo stesso accade quando l'umidità del incubatore è inferiore al 60% o le uova non vengono ruotate durante l'incubazione. </li><li> Ex ovo culture vengono restituiti in un incubatore e mantenuto a 37,5 ° 38,2 ° C e umidità 60%. CO 2 o O 2 alimentazione non è necessaria se l'incubatore non è chiuso ermeticamente (griglia di ventilazione parzialmente aperta!) E speciali piastre di Petri con distanziali tra coperchio e piatto vengono utilizzati. Nota: Lo spostamento degli embrioni dovrebbe essere ridotto al minimo durante i primi giorni di incubazione. Risultati agitazione troppo elevati tassi di mortalità. Da incubazione giorno 9 in poi, gli embrioni sono meno sensibili alla agitazione. Embrioni morti devono essere rimossi immediatamente per evitare infezioni. Se incubatori per colture cellulari vengono utilizzati, che sono ermeticamente chiusi, O 2 l'offerta è obbligatoria per gli embrioni non morire. L'umidità è essenziale per la CAM non si secchi e se la temperatura di incubazione è inferiore a 37 ° C, gli embrioni si sviluppano troppo lentamente. </li></ol> Parte 3: Applicazione di sostanze per saggi angiogenesi <ol><li> Autoclavato fogli piegati filtro (50,5 millimetri di diametro) vengono perforate da una perforatrice e utilizzato come materiale di supporto (carrier) per sostanze liquide applicate al CAM. Nota: Quasi ogni materiale di supporto (vedi tabella sotto) ha causato l'irritazione del CAM, soprattutto se applicata prima del giorno di incubazione 10, come ha cambiato la sviluppo dell'architettura nave CAM. Ciò riguarda anche le sostanze potenzialmente inerti come la pellicola di cellulosa idrossietil, spugne Teflon (PTFE-tamponi), spugne di collagene, foglio di collagene, garze sterili (tamponi), copri-rotondo, e anelli di silicio, che ha causato tutti i risultati falsi positivi. Carta da filtro sembrava provocare il minor irritazione ed è stata quindi utilizzata nei nostri test. </li><li> Quando la CAM è pienamente sviluppato, fino a 6 diversi campioni possono essere applicati e dei loro effetti possono essere confrontati su un singolo CAM. </li><li> Per evitare l'essiccamento dosi filtri aggiuntivi (3 mcg angiotropin nativo) o buffer (5 microlitri PBS) deve essere nuovamente applicata ogni giorno. </li><li> Dal 3 ° giorno dopo l'applicazione, i vasi sanguigni orientare verso le sostanze angiogenico sui filtri, mentre il modello dei vasi sanguigni circostanti controlli è invariato. Nota: La CAM non deve essere confuso con il tuorlo-sacco. Il CAM è una struttura dinamica di sviluppo, mentre il sacco vitellino è statico, con variazioni poco durante lo sviluppo. Il giorno di sviluppare tre il CAM di sviluppo possono essere riconosciuti per la prima volta alla fine caudale dell'embrione come una piccola vescicola. Tra tre giorni e dieci giorni di vescicola iniziale si espande, creando una piegato due strati di membrana overgrowing il sacco vitellino ad un tasso crescente. Il sito di applicazione dovrebbe essere a metà strada tra embrione e la piega del CAM (confine) altrimenti l'embrione ostacola l'osservazione microscopica di effetti in luce trasmessa. In alternativa, il filtro con la sostanza angiogenico è interiorizzato quando la CAM continua a crescere. </li></ol> Parte 4: inoculazione di cellule sul CAM 4.1.Preparation di cellule <ol><li> Cellule confluenti vengono trasferiti dal fiasco cultura ai tubi FALCON con l'uso di una pipetta sterile 25 ml in plastica con una pipetta di aiuto. </li><li> Per stimare il numero di cellulare, 15 ml di sospensione cellulare viene trasferito in una camera di Neubauer e le cellule vengono conteggiati manualmente al microscopio. </li><li> Falcon tubi vengono centrifugati per 3 min a 1000 rpm a temperatura ambiente e il supernatante viene scartato. </li><li> Per il monitoraggio delle cellule vive, le cellule sono diluiti con PBS alla concentrazione desiderata (qui: 2x10 7 cellule / ml) e colorati con ad esempio PKH26 (Sigma), un rosso fluorescente vivere membrana cellulare kit etichettatura, secondo i produttori 'protocollo. Le cellule sono risospese in terreno di coltura cellulare (preferibilmente medio Dulbecco modificato aquila; DMEM) alla concentrazione desiderata per l'iniezione (10 7 cellule / ml) o inoculazione (3x10 6 cellule / ml). Le concentrazioni di cellule differenti sono applicati per le iniezioni contro l'inoculazione in base alle concentrazioni già pubblicati in letteratura 15-17 e la nostra esperienza. </li></ol> 4,2 inoculazione di cellule sul CAM <ol><li> Anelli (~ spessore 1mm) sono tagliati da un puntale da 1 ml o un catetere venoso periferico (PVL) Tubo con l'uso di un bisturi tagliente e applicato al CAM di un E6-E14 pulcino ex ovo embrione in coltura. Nota: Cerca di non "visto" più volte, ma per tagliare la punta della pipetta o catetere con un taglio con un bisturi nuovo, molto forte per evitare spigoli vivi sugli anelli risultante. Controllare gli anelli sotto il microscopio di spigoli vivi che derivi dalla micro-fessure. </li><li> A seconda delle dimensioni degli anelli 20 l di 3x10 6 cellule / ml cellule sono pipettati in totale in un anello o come volumi divisi in anelli multipli. Nota: In alcuni casi traumatizzazione del CAM raschiando dolce è un pre-requisito, ad esempio, per facilitare l'inoculazione di cellule 17 e capillarizzazione degli innesti (vedi sotto). Se, invece, traumi della CAM non è destinato o contraindicative, ad esempio per lo studio del potenziale invasivo delle cellule tumorali, gli anelli non devono essere utilizzati per l'inoculazione, ma le cellule devono essere applicati direttamente come applicazione di anelli o anelli stessi potrebbe indurre lesioni micro . Se gli anelli sono utilizzati, questi devono essere tagliate il più sottile possibile per minimizzare il peso ed evitare il rientro del CAM. </li></ol> Parte 5: iniezione intravitreale di cellule <ol><li> Una siringa Hamilton microlitri è risciacquato più volte con EtOH 70% e infine con PBS sterile. </li><li> La siringa micro è riempito con la sospensione preparata cellula colorata o senza macchia (cfr. parte 4.1). Nota: il sito di iniezione deve essere scelto con cura, per non danneggiare i vasi sanguigni delle strutture CAM o adiacente dell'embrione (brain!) da più di penetrazione con l'ago. L'iniezione deve essere fatta sotto un binocolo dissezione. </li><li> Sotto il controllo microscopio, Con attenzione, ma rapidamente penetrare il CAM e strati occhio con l'ago della siringa e iniettare continuamente da 10 a massimo 20 microlitri sospensione cellulare (preferibilmente diluito in PBS) nel vitreo dei ovo embrione ex pulcino colta. Nota: se la CAM non può essere penetrato con l'ago, potrebbe essere rimossa in un sito con i vasi sanguigni poche o nessuna con delicatezza lacerando con due pinze. </li><li> L'ago deve rimanere 1-2 secondi in un occhio per evitare una perdita di sospensione cellulare iniettato da perdite. </li></ol> Parte 6: dissezione di gemme degli arti pollo <ol><li> Le uova sono ritirate dall 'incubatrice dopo 3 o 4 giorni di incubazione (E3/E4 = Hamburger Hamilton (HH) stage18-23) </li><li> Le uova sono rotto sul bordo di una barra triangolare ancoretta magnetica e trasferiti in una piastra di Petri (dettagli: si veda Parte 2) e l'embrione viene sezionato dai vasi tuorlo collegati da taglio un cerchio con le forbici a molla. </li><li> L'embrione viene trasferito in un piatto fresco Petri riempite con il freddo, sterile PBS con l'uso di un cucchiaio di scarico piccola e bagnata dal agitazione genere. </li><li> L'embrione viene trasferito in una piccola scatola di Petri riempite con PBS sterile e liberati dalle membrane circostanti, accuratamente lacerando con una pinza sottile. </li><li> Gemme degli arti si staccano da pinze microchirurgica più vicino al corpo il più possibile, colto e trasferito al CAM di un 8-10-giorno-vecchio ospitare ex ovo di pollo in coltura (vedi procedura di trapianto). </li></ol> Parte 7: Preparazione di gemme degli arti del mouse <ol><li> Accoppiamenti tempo in stato di gravidanza sono istituiti e la mattina del giorno in cui viene rilevato un plug vaginale in accoppiamento le femmine è designato 0 gestazione giorno. </li><li> La femmina gravida, è stato immolato per dislocazione cervicale quando lo sviluppo degli embrioni raggiunto giorni embrionale (E) 10 a 13 e fissato su un bordo di cera. </li><li> La parete addominale è inumidito con il 70% ETOH, tagliare lungo la linea mediana e la lembi cutanei vengono fissati lateralmente da perni. </li><li> Entrambe le corna dell'utero vengono rimossi con l'addome, distaccato e trasferito in un bicchiere con PBS freddo. </li><li> Gli embrioni sono separati, trasferito in una piastra di Petri e la parete dell'utero e delle membrane embrionali vengono rimossi con attenzione con l'uso di forcipe. </li><li> Gemme degli arti vengono tagliati con l'uso di forbici primavera o distaccato da una pinza sottile più vicino al corpo il più possibile, colto e trasferito al CAM di 8-10-giorno-vecchio ospitare ex ovo di pollo in coltura (vedi procedura di trapianto). </li></ol> Parte 8: Raccolta dei campioni di tumore <ol><li> Biopsie del tumore sono raccolti in provette Eppendorf da 2 ml riempito con cellule tumorali specifici per mezzo di coltura (qui: media Leibovitz) e conservato a temperatura ambiente. </li><li> Biopsie del tumore sono tagliati in pezzi da 1-2 mm3 bisturi sterile. Nota: Se i campioni tumorali erano troppo piccoli, potrebbero non allegare alla CAM, se fossero troppo grandi, la CAM potrebbe essere ferito e l'embrione potrebbe morire. </li><li> Un pezzo dal nucleo del campione bioptico si innesta il CAM di 8-10-giorno-vecchio ospitare ex ovo di pollo in coltura (vedi procedura di trapianto). Nota: Prendendo materiale dalla superficie della biopsia aumenta il rischio di contaminazione con il muscolo o del tessuto connettivo. </li></ol> Parte 9: procedura di trapianto <ol><li> Per l'innesto di gemme arto o campioni di tumore, il pieno sviluppo della CAM 8-10-giorno-vecchi embrioni di pollo in coltura ex ovo viene utilizzato. </li><li> Gli innesti sono nella posizione ideale sulla CAM Y vicino ad una biforcazione di un vaso sanguigno. </li><li> Presso il sito di applicazione desiderata, la CAM è selettivamente traumatizzato da fuori raschiatura dolce (forcipe) la parte superiore peridermal del doppio strato epiteliale, lasciando intatto lo strato basale. Nota: è essenziale per evitare sanguinamenti o rottura di capillari visibili. </li><li> L'innesto è trasferito al CAM con il minimo PBS allegato. A seconda del trapianto, potrebbe essere inserito una o due volte su un sito del CAM, dove non è previsto alcun innesto finale di rimuovere eccessive PBS e poi finalmente innestato nel sito preparato CAM traumatizzati. </li><li> L'innesto viene afferrata da una pinza sottile e stratificato sul CAM. A seconda della sensibilità del trapianto, una leggera pressione potrebbe essere applicata (non adatto per gemme degli arti) per manovrare l'innesto in una rientranza risultante del CAM (adatto per campioni di tumore). Nota: Poiché il sistema immunitario sviluppa pulcino al giorno embrionale (E) 18, ex ovo xenotrapianti culture non deve essere prolungato al di là E17 come gli embrioni ospitare pulcino spesso muoiono. E 'importante avere a disposizione CAM ospitare, rispettivamente ex ovo embrioni di pollo in coltura, in coincidenza con una fonte di tessuti del donatore di vostra scelta. </li></ol> Parte 10: Re-trapianto <ol><li> L'embrione di pollo host viene ucciso per decapitazione. </li><li> Il CAM conl'innesto allegato viene rimosso mediante un taglio circolare con le forbici a punta e trasferito in una piastra di Petri riempita con PBS. </li><li> CAM eccessivo è tagliato dal trapianto di forbici a molla, tranne per il sito ex allegato. </li><li> In caso di campioni tumorali più grande, l'innesto viene tagliato a metà o più pezzi più piccoli e ri-innestati con il tagliente rivolto verso il CAM nuovo del secondo host. </li></ol> Parte 11: Risultati Rappresentante <img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Shell-meno pollo cultura Embrioni di pollo di diverse fasi di sviluppo ex ovo colto in piastre di Petri. <img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Ex ovo saggio dell'angiogenesi CAM Uova di gallina fecondate sono state incubate in orizzontale a 37 ° C e umidità del 60 - 62% e screpolata in piastre di Petri al giorno embrionale 4 (E4). L'incubazione è proseguita nelle stesse condizioni. A E10 carte filtro sterile (5,5 mm di diametro) sono state stratificate sulla parte superiore del CAM e imbevuto sia con 5 microlitri PBS o 3 mg nativo angiotropin6. Capillari ha mostrato evidenti allineamento verso la carta imbevuta angiotropin filtro E14. <img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Ovo Ex innesti di gemme degli arti Gemme degli arti da pulcino (E3/E4) e mouse (E13) sono stati innestati i CAM del guscio inferiore culture pollo. I vasi sanguigni dal CAM inseriti i germogli arto dopo due giorni. Lo sviluppo delle gemme degli arti continuato in queste culture ex ovo raggiungendo una falange in due fasi pulcino e la visualizzazione di riduzione delle reti interdigitali in gemme degli arti murini. <img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Ex ovo inoculazione del campione di tumore Un campione bioptico di carcinoma della vescica è stato inoculato sul CAM di un 10-pulcino ex ovo embrione in coltura. Dopo due giorni di cultura, il campione del tumore è stato collegato al sistema vascolare CAM e dopo 7 giorni, i vasi sanguigni più entrare nel trapianto sono stati osservati.

<ol><li>Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+procedure+for+long-term+cultivation+of+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple procedure for long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).</li>
<li>Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shell-less+culture+of+the+chick+embryo+as+a+model+system+in+the+study+of+development+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of development neurobiology.</a> Neuroanatomy. 3, 8-11 (2004).</li>
<li>Deryugina, E. I., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+models+to+quantify+angiogenesis+induced+by+inflammatory+and+tumor+cells+or+purified+effector+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules.</a> Methods Enzymology. 444, 21-44 (2008).</li>
<li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+as+a+useful+tool+to+study+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis.</a> Int. Rev. Cell Mol. Biol. 270, 181-224 (2008).</li>
<li>Höckel, M., Sasse, J., Wissler, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+monocyte-derived+angiogenic+substance+%28angiotropin%29+stimulates+migration%2C+phenotypic+changes%2C+and+%22tube+formation%22+but+not+proliferation+of+capillary+endothelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Purified monocyte-derived angiogenic substance (angiotropin) stimulates migration, phenotypic changes, and "tube formation" but not proliferation of capillary endothelial cells in vitro.</a> J. Cell Physiol. 133, 1-13 (1987).</li>
<li>Wissler, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+blood+vessel+patterns+by+Angio+Morphogens+%5BAngiotropins%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Materialwiss.+Werkstofftech%22%5BJournal%5D)">Engineering of blood vessel patterns by Angio Morphogens [Angiotropins].</a> Materialwiss. Werkstofftech. 32, 984-1008 (2001).</li>
<li>Kistler, H. B. J. r., LaVail, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+horseradish+peroxidase+into+the+optic+nerve+after+vitreal+or+vascular+injections+in+the+developing+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Penetration of horseradish peroxidase into the optic nerve after vitreal or vascular injections in the developing chick.</a> Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 20, 705-716 (1981).</li>
<li>Halfter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Change+in+embryonic+eye+size+and+retinal+cell+proliferation+following+intravitreal+injection+of+glycosaminoglycans%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Change in embryonic eye size and retinal cell proliferation following intravitreal injection of glycosaminoglycans.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 3289-3298 (2008).</li>
<li>Oppitz, M., Busch, C., Shriek, G., Metzger, M., Just, L., Drews, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-malignant+migration+of+B16+mouse+melanoma+cells+in+the+neural+crest+and+invasive+growth+in+the+eye+cup+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">Non-malignant migration of B16 mouse melanoma cells in the neural crest and invasive growth in the eye cup of the chick embryo.</a> Melanoma Res. 17, 17-30 (2007).</li>
<li>Uchibayashi, T., Egawa, M., Nakajima, K., Hisazumi, H., Tanaka, M., Endo, Y., Sasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+tumour+cell+lines+implanted+onto+the+chorioallantoic+membrane+of+chick+embryo+to+anticancer+agents+in+combination+with+hyperthermia%5BTitle%5D)+AND+%22Urol.+Res%22%5BJournal%5D)">Responses of tumour cell lines implanted onto the chorioallantoic membrane of chick embryo to anticancer agents in combination with hyperthermia.</a> Urol. Res. 20, 237-239 (1992).</li>
<li>Demir, R., Naschberger, L., Demir, I., Melling, N., Dimmler, A., Papadopoulus, T., Sturzl, M., Klein, P., Hohenberger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+generates+a+more+invasive+phenotype+of+tumour+cells%3A+an+in+vivo+experimental+setup+based+on+the+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol.+Oncol.+Res%22%5BJournal%5D)">Hypoxia generates a more invasive phenotype of tumour cells: an in vivo experimental setup based on the chorioallantoic membrane.</a> Pathol. Oncol. Res. , (2008).</li>
<li>Kunzi-Rapp, K., Genze, F., Kufer, R., Reich, E., Hautmann, R. E., Gschwend, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chorioallantoic+membrane+assay%3A+vascularized+3-dimensional+cell+culture+system+for+human+prostate+cancer+cells+as+an+animal+substitute+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Chorioallantoic membrane assay: vascularized 3-dimensional cell culture system for human prostate cancer cells as an animal substitute model.</a> J. Urol. 166, 1502-1507 (2001).</li>
<li>Hall, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grafting+of+organs+and+tissues+to+the+chorioallantoic+membrane+of+the+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22TCA+Manual%22%5BJournal%5D)">Grafting of organs and tissues to the chorioallantoic membrane of the embryonic chick.</a> TCA Manual. 4 (3), 881-883 (1978).</li>
<li>Kunzi-Rapp, K., Kaskel, P., Steiner, R., Peter, R. U., Krahn, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+blood+levels+of+human+S100+in+melanoma+chick+embryo+xenografts%27+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Increased blood levels of human S100 in melanoma chick embryo xenografts' circulation.</a> Pigment Cell Res. 14, 9-13 (2001).</li>
<li>McFall, R. C., Sery, T. W., Makadon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+new+continuous+cell+line+derived+from+a+human+retinoblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of a new continuous cell line derived from a human retinoblastoma.</a> Cancer Research. 37, 1003-1010 (1977).</li>
<li>Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+effect+of+matrix+metalloproteinase+down-regulation+on+vascular+intravasation+and+metastasis+of+human+fibrosarcoma+cells+selected+in+vivo+for+high+rates+of+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination.</a> Cancer Research. 65, 10959-10969 (2005).</li>
<li>Kim, J., Kovalski, K., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((requirement+for+specific+proteases+in+cancer+cell+intravasation+as+revealed+by+a+novel+semiquantitative+PCR-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay.</a> Cell. 94, 353-362 (1998).</li>
</ol>

Innovativi o solo un altro protocollo cultura pulcino? Con l&#39;ex-shell meno protocolli di cultura 1-4 il tasso di sopravvivenza totale degli embrioni pulcino erano basse, ad esempio ca. 30% 1. Il raffinato protocollo cultura ex ovo descritto in questo articolo video, al contrario, permette di tassi di sopravvivenza oltre il 50%. Rispetto al classico nelle culture cultura ex ovo ovo di embrioni di pollo facilita in modo significativo l&#39;a...

<table><tbody><tr><td>Uova fecondate</td><td>Animale</td><td>Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Topi</td><td>Animale</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice modello 3000 con vassoio rotante per uova</td><td>Strumenti</td><td>Siemens AG</td><td>9503</td><td>Mantenere a 37&amp;#x00B0;C con umidità relativa impostata sopra il 60%</td></tr><tr><td>Incubatrice per uova BSS 160</td><td>Strumenti</td><td>Grumbach, Germania</td><td>8101</td><td>Mantenere a 37-38 °C con umidità relativa superiore al 60%</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Il PBS deve essere freddo (&lt;forte&gt;&amp;gt;&lt;/strong&gt; 4&amp;#x00B0;C) e sterile</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modificato di Eagle&amp;rsquo;mezzo s</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D 6429</td><td>mezzo di coltura DMEM</td></tr><tr><td>Leibovitz&amp;rsquo;s L-15 Medium</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>31415-029</td><td>qui: mezzo di raccolta per campioni tumorali</td></tr><tr><td>Mezzo specifico per cellule tumorali</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>ogni gruppo di ricerca dovrebbe utilizzare il mezzo in cui coltiva le proprie cellule tumorali o un mezzo di coltura comune, ad esempio Leibovitz&amp;rsquo;s Mezzo o Dulbecco&amp;rsquo;s modificato di Eagle&amp;rsquo;mezzo s&lt;br/&gt;supplementato con 15% di siero fetale bovino (FBS), 4 mM di L-glutammina e 50 &amp;#x03BC;M insulin</td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barra magnetica per agitazione, triangolare, 80 mm</td><td>Strumento</td><td>VWR international</td><td>442-0391</td><td>Una bacchetta magnetica triangolare è adatta per rompere il guscio delle uova.</td></tr><tr><td>Pinzetta DUMONT n. 5 </td><td>Strumento</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>punte molto fini arrotondate (punta 0,05 mm x 0,02 mm)</td></tr><tr><td>Pinzetta DUMONT n. 7</td><td>Strumento</td><td>Fine Science Tools</td><td>11271-30</td><td>gambo curvo (punta 0,07 mm x 0,10 mm)</td></tr><tr><td>Forbici a molla, dritte, 8 cm</td><td>Strumento</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td>lame sottili, piccole e dritte</td></tr><tr><td>Bisturi fini per iride, dritti</td><td>Strumento</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td>Utilizzare per tagliare la membrana corioallantoidea (CAM)</td></tr><tr><td>Forbici standard, dritte, affilate/ottuse</td><td>Strumento</td><td>Fine Science Tools</td><td>14007-14</td><td>Utilizzo per decapitazione o dislocazione cervicale</td></tr><tr><td>siringa microlitrica 1702 TLLX, 25 &amp;mu;l</td><td>Strumento</td><td>Hamilton Co</td><td>80222</td><td>Uso per iniezione nel vitreo</td></tr><tr><td>Ago Hamilton 33-G (15 mm)</td><td>Strumento</td><td>Fine Science Tools</td><td>18073-15</td><td>Uso per iniezione nel vitreo</td></tr><tr><td>Lame da bisturi sterili</td><td>Strumento</td><td></td><td></td><td>Utilizzo per la dissezione di campioni tumorali</td></tr><tr><td>Cucchiaio piccolo da drenaggio</td><td>Strumento</td><td>Geuder</td><td>15758</td><td>Utilizzare per il trasferimento di embrioni di pollo di piccole dimensioni</td></tr><tr><td>Tavola di cera con perni di fissaggio</td><td>Strumento</td><td>Fatto in casa</td><td></td><td>Utilizzare per la fissazione degli animali a scopo di dissezione</td></tr><tr><td>Pietre di Petri 60 x 15 mm</td><td>Strumento</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>Piastrine di Petri 92 x 16 mm</td><td>Strumento</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>82.1472</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di Petri sterile 100 x 20 mm</td><td>Strumento</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td>extra profondo, con distanziali per la ventilazione</td></tr><tr><td>Becher</td><td>Strumento</td><td></td><td></td><td>300-600 ml</td></tr><tr><td>FALCON tubes</td><td>Strumento</td><td>Falcon BD</td><td></td><td>15 ml e 50 ml</td></tr><tr><td>Tubi Eppendorf</td><td>Strumento</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>1,5 ml e 2 ml</td></tr><tr><td>Punte per pipetta da 1 ml</td><td>Strumento</td><td></td><td></td><td>Utilizzare per tagliare anelli di plastica per l'applicazione di sostanze/cellule</td></tr><tr><td>Catetere venoso periferico (PVL)</td><td>Strumento</td><td>Viggo&amp;#174;</td><td></td><td>Utilizzare per tagliare anelli di silicone dal tubo per l'applicazione di sostanze / cellule</td></tr><tr><td>Pipette e punte</td><td>Strumento</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtri piegati 595 1/2, diametro 110 mm, sterilizzati in autoclave</td><td>Strumento</td><td>Schleicher & Schuell</td><td>311643</td><td>Carrier, che ha causato il minore irritazione della membrana corioallantoinica; utilizzato nel documento</td></tr><tr><td>PTFE-Pledget, non riassorbibile, 6,3 x 152,4 x 1,6 mm</td><td>Strumento</td><td>santec-medical</td><td>REF 277, LOTTO 832/511-1</td><td>Vettore; ha causato risultati falsi positivi</td></tr><tr><td>Idrossietilcellulosa Tylose H 100000</td><td>Reagente</td><td></td><td></td><td>Supporto miscelato con Kollidon 17 PF; ha causato risultati falsi positivi</td></tr><tr><td>Kollidon 17 PF</td><td>Reagente</td><td>BASF</td><td>S30200</td><td>mescolato con idrossietilcellulosa; ha causato risultati falsi positivi</td></tr><tr><td>Collagen Biomatrix TissuDura</td><td>Strumento</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>REF B2246000999999</td><td>Vettore; ha causato risultati falsi positivi</td></tr><tr><td>Coprivetri rotondi in vetro, 11 mm</td><td>Strumento</td><td>Assistente Germania</td><td>1001/0011</td><td>Vettore; causa risultati falsi positivi</td></tr><tr><td>Spugna di collagene bovino</td><td>Strumento</td><td>Wyeth Animal Health</td><td></td><td>Vettore; ha causato risultati falsi positivi</td></tr><tr><td>Resodont Membrana Collagene Riassorbibile</td><td>Strumento</td><td>Resorba Woundcare Germany</td><td>LOT 280303</td><td>Vettore; ha causato risultati falsi positivi</td></tr><tr><td>Tamponi non tessuti</td><td>Strumento</td><td>Fink Walter GmbH</td><td>RIF 328132</td><td>Vettore; ha causato risultati falsi positivi</td></tr></tbody></table>

pulcino ex ovo cultura e ex ovo cam saggio: come funziona veramente

Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works

Uova di gallina nella prima fase di allevamento sono tra dati in vitro e in vivo e sistemi di fornire un ambiente di test vascolare non solo per studiare l&#39;angiogenesi, ma anche per studiare tumorigenesi. Dopo la membrana pulcino corioallantoidea (CAM) ha sviluppato, la sua rete di vasi sanguigni possono essere facilmente accessibili, manipolato e osservato e quindi fornisce un ambiente ottimale per le analisi angiogenesi. Dato che il sistema linfatico non è completamente sviluppato fino ultime fasi di incubazione, l&#39;embrione di pollo serve come ospiti naturali immunodeficienti in grado di sostenere i tessuti e le cellule senza innestato specie-specifiche restrizioni. Oltre a coltivare lo sviluppo di allo-e xenotrapianti, la rete di vasi sanguigni CAM offre un ambiente unico e di sostegno per intravasation delle cellule tumorali, la diffusione e l&#39;arresto vascolare e un archivio in cui le cellule arrestato stravaso di formare micro foci metastatici. A fini sperimentali, nella maggior parte degli studi recenti la CAM è stata esposta dal taglio di una finestra attraverso il guscio dell&#39;uovo e gli esperimenti sono stati condotti in ovo, con conseguente limitazione significativa l&#39;accessibilità del CAM e le possibilità di osservazione e documentazione fotografica degli effetti. Quando la shell-less culture del embrione di pollo sono stati usati 1-4, nessun dettaglio sperimentale sono state fornite e, se pubblicate in tutti, i tassi di sopravvivenza di queste culture erano basse. Abbiamo raffinato il metodo della cultura ex ovo di embrioni di pollo in modo significativo, introducendo un estrusione razionalmente controllata del contenuto dell&#39;uovo. Queste culture ex ovo migliorare l&#39;accessibilità dell&#39;embrione CAM e pulcino, consentendo un facile nella documentazione in vivo degli effetti e facilitare la manipolazione sperimentale dell&#39;embrione. Questo consente l&#39;applicazione di successo a un gran numero di questioni scientifiche: (1) Come un saggio angiogenesi migliorato 5,6, (2) un set up sperimentale per preparazioni iniettabili facilitato nel vitreo dell&#39;occhio embrione di pollo 7-9, (3) come ambiente di test per la diffusione e intravasation di dispersi cellule tumorali da linee cellulari stabilizzate inoculati sul CAM 10-12, (4), un sistema migliore per sostenere il trapianto di successo e la cultura delle gemme degli arti di pollo e topi 13 come pure (5 ) per l&#39;innesto, propagazione, e ri-innesto di solido tessuto tumorale primaria ottenute da biopsie sulla superficie del CAM 14. In questo articolo video che descrivono la creazione di una cultura raffinata ex pulcino ovo e test CAM con tassi di sopravvivenza oltre il 50%. Oltre che fornire una dimostrazione passo passo per l&#39;applicazione di successo della cultura ex ovo per un gran numero di applicazioni scientifiche. Daniel S. Dohle, Susanne D. Pasa, e Sebastian Gustmann contribuito in maniera uguale a questo studio.

Il pulcino corioallantoidea membrana (CAM) è un ambiente unico e naturalmente immunodeficienti cultura di sostegno allo studio dell&#39;angiogenesi e tumorigenesi. In questo articolo video mostra le varie fasi pulcino<em&gt; Ex ovo</emCultura&gt;, l&#39;applicazione di sostanze potenzialmente angiogenici e inoculazione di successo delle cellule tumorali e tessuti sulla superficie del CAM.

Pulcino Ex ovo Cultura e Ex ovo CAM saggio: Come funziona veramente

Le uova di pollo nelle prime fasi di incubazione si collocano tra i sistemi in vitro e in vivo e forniscono un ambiente di test vascolarizzato non solo per studiare...

Ciao, sono Susan Paa. Sono dell'Istituto di Chimica Fisiologica, dipartimento di Endocrinologia Biochimica presso l'Università di Burg Esen in Germania. Ciao, sono Daniel Ze Basian Dole.Sono della stessa istituzione di Susan. Ciao, sono Mann dell'Istituto di Anatomia, Dipartimento di Neuro, dell'Università di Burg. Vi mostreremo come funzionano effettivamente la coltura CH X e il saggio con membrana co.Andiamo dunque in laboratorio. Nella maggior parte degli studi sperimentali recenti, la CAM, cioè la membrana corioallantoidea, è stata esposta praticando una finestra attraverso il guscio dell'uovo, e gli esperimenti sono stati condotti in ovo, determinando significative limitazioni nell'accessibilità della CAM e nelle possibilità di osservazione e documentazione fotografica degli effetti. Le colture ex ovo degli embrioni di pollo facilitano in modo significativo l'accessibilità della CAM e dell'embrione di pollo.Si prega di osservare il cuore in battito che consente una facile documentazione in vivo degli effetti e la manipolazione sperimentale dell'embrione. Nel nostro articolo video, forniremo una dimostrazione passo dopo passo dell'applicazione con successo della coltura X ovo p

chick-ex-ovo-culture-and-ex-ovo-cam-assay-how-it-really-works

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo video dimostra nuova cultura, un metodo con cui sono coltivati ​​embrioni di pollo al di fuori l'uovo per un massimo di 24 ore. Questo metodo permette di studiare lo sviluppo precoce (stria primitiva a 14 som.), Un periodo corrispondente a E7-9 nel topo. Le applicazioni di questa tecnica sono elettroporazione, ibridazione in situ e immunoistochimica.

Metodo per la Cultura di Chick primi embrioni ex vivo (Nuova Cultura)

In questo articolo presentiamo una metodologia semplice per permettere a lungo...

Un Ex-ovo Sistema di embrioni di pollo Cultura Adatto per applicazioni di imaging e Microchirurgia

Gli<em&gt; In ovo</em&gt; CAM-saggio come Xenograftmodel per Sarcoma

Pulcino colture di cellule della retina embrionali costituiscono validi strumenti per lo studio della biologia dei fotorecettori. Abbiamo sviluppato una tecnica di trasferimento genico efficace sulla base di ex ovo plasmide elettroporazione delle retine precedenti alla cultura. Questa tecnica aumenta considerevolmente l'efficienza di transfezione su protocolli attualmente disponibili, rendendo la manipolazione genetica fattibile per questo sistema.

Trasferimento efficiente Gene in Chick retine per cellulari primarie Cultura Studies: An Ex-ovo Elettroporazione Approach

Visualizzare e accedere all'embrione di pollo durante lo sviluppo può essere impegnativo. Abbiamo sviluppato un metodo ex ovo che è semplice, economico e può essere facilmente utilizzato in classe o in un ambiente di ricerca. Questo metodo consente l'accesso all'embrione nelle fasi avanzate dello sviluppo embrionale (HH 40).

Ottimizzato Ex-ovo Coltura di Chick embrioni a stadi avanzati di sviluppo

La membrana corioallantoidea del pulcino (CAM) è immunodeficiente e altamente vascolarizzata, il che la rende un modello naturale in vivo di crescita tumorale e angiogenesi. In questo protocollo, descriviamo un metodo affidabile per la crescita di tumori di carcinoma epatocellulare (HCC) tridimensionali e vascolarizzati utilizzando il test CAM.

Il<em&gt; In Ovo</em&gt; Chick corioallantoidea membrana (CAM) Saggio come un efficiente dello xenotrapianto Modello di carcinoma epatocellulare

Qui, vi presentiamo un protocollo per studiare l'invasione delle cellule tumorali in viventi frammenti di tessuto normale in tre dimensioni. Questa tecnica cultura organo è applicata principalmente per testare farmaci potenzialmente anti-invasive in vitro.

Invasione Chick Cuore Saggio per il test l&#39;invasività delle cellule tumorali e l&#39;attività di composti potenzialmente anti-invasive

Qui, presentiamo una nuova tecnica per coltivare embrioni di pollo ex ovo per l'imaging time-lapse utilizzando la luce trasmessa e la microscopia a fluorescenza. Il sandwich di carta da filtro sommerso è una variante della consolidata tecnica di supporto della carta da filtro1 che consente la coltura di embrioni di pollo completamente immersi in un terreno di coltura liquido.

Un sommerso Sandwich carta da filtro per il lungo termine Ex Ovo Time-lapse imaging di Chick primi embrioni

La membrana corioallantoica (CAM) dell'embrione aviario è uno strumento molto utile e applicabile per varie aree di ricerca. Uno speciale modello ex ovo di quaglia giapponese CAM è adatto per l'indagine del trattamento fotodinamico.

Quaglia Membrana corioallantoica - uno strumento per la diagnosi fotodinamica e la terapia

Qui, descriviamo un protocollo per lo sviluppo di un modello di xenotrapianto di membrana corioallantoica (CAM) di pulcino per il tessuto ovarico umano e dimostriamo l'efficacia della tecnica, il tempo di rivascolarizzazione dell'innesto e la vitalità del tessuto in un periodo di innesto di 6 giorni.

Il modello di membrana corioallantoica del pulcino (CAM) come strumento per lo studio del trapianto di tessuto ovarico

Scopri la cultura ex ovo del pulcino e il saggio CAM per studiare angiogenesi e tumorigenesi. Questo metodo facilita l'accessibilità e la documentazione in vivo degli effetti sperimentali.

Pulcino Ex ovo Cultura e Ex ovo CAM saggio: Come funziona veramente

Esplora altri video