Name: In vivo, come organotipica Cultura Murine Wholemount retina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-11T17:30:00.000+00:00
Duration: 25 min 26 s
Description: Impara a stabilire colture organotipiche di retina murina intera e il metodo cytospin per analizzare effetti esogeni. Questo sistema mantiene le interazioni neuronali preservate, superando i limiti dei modelli transgenici classici.

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Gli autori desiderano ringraziare E. de la Rosa e AI Valenciano di aiuto iniziale con l&#39;istituzione delle culture organotipica e U. Laub e U. Gerster per l&#39;assistenza tecnica.

Tutte le attrezzature ei reagenti devono essere acquistati sterile o ha bisogno di essere calore o vapore, sterilizzati o sterilizzati con il 70% ETOH. Gli autori affermano che gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le Comunità europee direttiva del Consiglio (86/609/CEE), seguendo le linee guida del NIH per quanto riguarda la cura e l'uso di animali nelle procedure sperimentali e le norme stabilite dalla Animal Istituzionale Cura e uso Comitato (IACUC) presso l'Università di Duisburg-Essen (Germania). Parte 1: enucleazione degli occhi murino di differenti stadi di sviluppo Enucleazione degli occhi embrionale <ol><li> Accoppiamenti tempo in stato di gravidanza sono istituiti e la mattina del giorno in cui viene rilevato un plug vaginale in accoppiamento le femmine è designato 0 gestazione giorno. </li><li> La femmina gravida, è stato immolato per dislocazione cervicale quando lo sviluppo degli embrioni ha raggiunto il livello desiderato (qui: giorno embrionale (E) 15) e fissato su un bordo di cera 6. </li><li> La parete addominale è inumidito con il 70% ETOH, tagliare lungo la linea mediana e la lembi cutanei vengono fissati lateralmente da pin 6. </li><li> Il uterusses vengono rimossi con l'addome, distaccato e trasferito in un bicchiere con PBS freddo 6. </li><li> Gli embrioni sono separati, trasferito in una piastra di Petri e la parete dell'utero e delle membrane embrionali vengono rimossi con attenzione con l'uso di forcipe 6. </li><li> Gli embrioni vengono uccisi per decapitazione. </li><li> Gli occhi sono enucleato essere l'uso di multa, pinze curve, "peeling" gli occhi dalle orbite. </li></ol> Enucleazione degli occhi postnatale e adulta <ol start="1" type="1"><li> Cuccioli sono uccisi per decapitazione, cuccioli e adulti più anziani con dislocazione cervicale. </li><li> Fino alla fase post-natale P15, il punto di tempo in cui i topi aprire gli occhi, fessure degli occhi devono essere aperti meccanicamente con l'uso di forcipe e ampliato da due tagli trasversali delle palpebre con le forbici a molla. </li><li> Gli occhi sono enucleato con l'aiuto di pinze curve, applicando una pressione al orbita. </li></ol> Nota: Come al giorno postnatale 2, le ossa orbitali sono ancora cartilagineo, è importante non applicare troppa pressione durante il tentativo di rimuovere gli occhi. Al contrario, nei topi adulti, le ossa orbitali sono ferme. Pertanto, al fine di enucleare gli occhi è sufficiente esercitare una pressione l'orbita senza allargare le fessure degli occhi in anticipo. Parte 2: dissezione di retine murini embrionali, postnatale e adulta Dissezione di retine <ol><li> Gli occhi sono posti in una piccola scatola di Petri con PBS sterile e gli strati occhio circostanti vengono rimossi al microscopio di dissezione. </li><li> Per rimuovere gli strati esterni dell'occhio, nelle fasi post-natale e gli occhi degli adulti il ​​nervo ottico deve essere tagliato con l'aiuto di forbici primavera o fuori pizzicato da pinze più vicino possibile alla base il più possibile. </li><li> Girare l'occhio, in modo che la parte posteriore con il foro in cui il nervo ottico originariamente risiedeva ti sta di fronte. Inserisci nello spazio sottoretinico tra retina e dell'epitelio pigmentato con la punta delle due pinze molto fine dal luogo in cui il nervo ottico penetrare gli strati dell'occhio. Nota: Di solito, l'epitelio pigmentato può essere facilmente identificato dal suo colore scuro. In alcuni ceppi di topi mutanti - soprattutto negli animali albini - questo strato di pigmento può tuttavia essere colorati e quindi non può essere facilmente rilevare. </li><li> Rimuovere l'epitelio pigmentato con la membrana coroide attaccato e nella sclera con attenzione strappi su entrambi i lati con entrambe le pinze. </li><li> Staccare gli strati fino al livello della cornea, quindi girare l'oculare verso l'obiettivo e rimuovere la cornea con epitelio pigmentato, coroide membrana e nella sclera, tenendo la tazza rimanente della retina dal forcipe altri. </li><li> Afferrare il vitreo insieme alla piccola lente e mentre strappo con le pinze, tenere il wholemount retina in posizione con le pinze secondo. Nota: Quando la dissezione occhi embrionale, assicurarsi di rimuovere completamente il triangolare, tenda-come plesso capillare sotto il corpo vitreo con il vitreo. Nell'occhio adulto, il vitreo va rilevato ai lati e la cura deve essere presa per non forare il vitreo con le punte della pinza, come il suo contenuto è viscoso e si attacca alla pinza, ostacolando la sua rimozione. </li><li> Per organotipica cultura wholemount le tazze della retina sono raccolti in una piastra da 96 pozzetti contenente 200 ul Dulbecco modificato aquila medio (vedi sotto). </li></ol> Nota: tra dissezione di retine individuale, mantenere la piastra a 96 pozzetti di raccolta contenente il terreno di coltura nell'incubatore, come il pH del terreno di coltura è innescata da CO 2 attraverso il sistema carbonato. Parte 3: murini wholemount organotipica retinacultura <ol><li> Preparare 500 ml di cultura medio peso 7.8g Dulbecco modificato aquila / miscela di nutrienti F-12 HAM (DMEM) e 0,6 g NaHCO 3 e dissoluzione sia in acqua MiIliQ. Regolare il pH a 7.15. Aggiungi 50mg apo-transferin, 50μl putrescin (stock: 60mg/ml), 50μl di selenio (stock: 52μg/ml), il progesterone (stock: 60μg/ml), e 2,5 ml di gentamicina (200 mm) sotto il cofano. Mescolare e filtrare attraverso un filtro superiore bottiglia. Immediatamente prima dell'uso aggiungere glutammina 10μl (200 mm) per mezzo di coltura ml. Nota: Questo terreno e siero-insulina-libero può essere conservato a 4 ° C per un massimo di 2 settimane e utilizzati per esperimenti di induzione dell'apoptosi, come l'insulina non contrasta gli effetti. Se incubazione di wholemounts per più di 24 ore è desiderato e tassi di morte cellulare non saranno valutate, siero insulina (es. siero fetale di vitello; FCS) o gli integratori dovrebbero essere aggiunti per migliorare i tassi di sopravvivenza. </li><li> Prima di iniziare la cultura, la wholemounts retina sono pre-incubate per 15 minuti a 37 ° C con 200 ul caldo, pH equilibrato DMEM contenente ialuronidasi 0.5mg/ml di pre-digerire la ialuronidasi contenenti interno ed esterno della membrana limitante della glia M ller cellule, facilitando la penetrazione di sostanze applicate esogena. </li><li> Retine sono trasferiti ad un 24-pozzetti con il minor numero possibile ialuronidasi e colto come wholemounts organotipica in 2ml chimica definita media Dulbecco modificato aquila. Nota: Per il trasferimento della retina, utilizzare una pipetta 1ml e tagliare la punta della pipetta di pochi millimetri per ampliare l'apertura. Per gli occhi embrionale, da 200 microlitri puntale è sufficiente. I bordi di taglio dovrebbe essere dai lisci inserimento e torsioni di punta della pipetta secondo. Per 24-48 ore a breve termine le culture, tutte le misure possono essere eseguite al banco, ma se la contaminazione delle culture si rivela essere un problema, si dovrebbe lavorare sotto il cofano. </li><li> Le culture sono mantenuti per 24 - 48 ore a 37 ° C in un 5% di CO 2 nell'atmosfera e ad esempio, sottoposti a trattamento farmacologico con fattori ricombinanti. </li></ol> Parte 4: dissociazione di coltura wholemounts retina <ol><li> Dopo il tempo desiderato cultura, retina sono raccolti in provette Eppendorf da 2 ml a fondo rotondo contenente 850 microlitri di PBS e 50 microlitri di siero albumina bovina (BSA; 30 mg / ml). </li><li> Luogo provette Eppendorf con retine in un blocco di riscaldamento, riscaldato a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 25 microlitri collagenasi (200 U / ml) e 25 microlitri ialuronidasi (20mg/ml) a ciascuna provetta Eppendorf e iniziare a dissociare la retina in sospensione singola cella da 3 passa attraverso una pipetta Pasteur siliconata. </li><li> Tripsina aggiungere 10 microlitri (1mg/ml), attendere per 3-5 minuti, e poi lentamente pipetta 3-5 volte su e giù con siliconato pipetta Pasteur di dissociarsi meccanicamente i tessuti. </li><li> Aggiungere 10 microlitri DNasi I (5mg/ml), ancora una volta attendere per 3-5 minuti, poi lentamente pipetta 3-5 volte su e giù con siliconata pipetta Pasteur. Nota: Il tempo di incubazione per la dissociazione enzimatica varia e dipende dalla dimensione degli occhi e la fase di sviluppo, rispettivamente. Controllare la fase di digestione enzimatica del tessuto pipettando gentilmente su e giù. </li><li> Se la sospensione cellulare non è omogenea ormai, ma contiene ancora aggregati di cellule grandi, aggiungere altri 10 microlitri tripsina e 10 microlitri DNasi I. </li><li> Quando la sospensione cellulare è omogeneo, la digestione del tessuto viene fermato con l'aggiunta di 10 microlitri EDTA (0,5 M), tubi Eppendorf vengono rimossi dalla stufa e le sospensioni cellulari sono fissati per 1h aggiungendo 1 ml fresca, paraformaldeide ghiacciata 8% (PFA) a temperatura ambiente su una rotazione shaker. </li></ol> Parte 5: Lavaggio delle sospensioni cellulari dissociato <ol><li> La sospensione cellulare viene centrifugato per 5 minuti a 4 ° C e 0,2 rcf in una centrifuga di raffreddamento. </li><li> Il supernatante viene scartato e il pellet viene risospeso in 1ml PBS contenente BSA 3mg/ml. </li><li> Dopo aver ripetuto queste fasi di lavaggio due volte, il pellet viene infine risospeso in 500 microlitri di PBS contenente BSA 3mg/ml, 5mm EDTA e sodio azide allo 0,1%. </li></ol> Nota: L'aggiunta di acido di sodio consentire l'archiviazione di sospensione cellulare per diversi giorni a 4 ° C. Tuttavia, se una colorazione immunocitochimica seguirà, non aggiungere l'acido di sodio al buffer di risospensione, come questo si traduce in perdita di qualità colorazione. Parte 6: Cytospin di sospensioni cellulari per l'apoptosi e l'analisi quantitativa proliferazione <ol><li> Un satinato-end vetrino da microscopio, un filtro cytospin con uno o due fori e un imbuto cytospin vengono inseriti in una clip scivolo cytospin. La clip scorrevole è chiuso e posizionato nel rotore cytospin. </li><li> La sospensione cellulare dissociato è omogeneizzato pipettando gentilmente su e giù. Nota: A seconda della fase di sviluppo della retina, la sospensione cellulare dalla procedura di dissociazione potrebbe essere necessarioessere diluito con PBS per ottenere un numero numerabile di cellule. </li><li> Un'aliquota (100 l), della sospensione cellulare viene applicata a un imbuto cytospin. Nota: Quando pipettaggio la sospensione cellulare per l'imbuto, la punta della pipetta dovrebbe raggiungere tutta la strada fino al fondo dell'imbuto. E 'importante non far passare il punto di pressione secondo pipetta in quanto ciò crea bolle d'aria, che sarà visibile nel punto cella dopo la cytospin e ostacola conta delle cellule. </li><li> La sospensione cellulare è depositata su un vetrino a 700 rpm per 7 min. </li><li> Per la determinazione degli effetti di fattori esogeni applicata sui livelli di apoptosi cellule possono essere colorate con 4 ',6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI; 2μg/ml), montato con fluorescente mezzo di montaggio. Cambiamenti nella apoptosi delle cellule può essere determinata contando almeno 1000 cellule (di cui almeno 10 nuclei pycnotic) in punti cella cytospin e il tasso di morte cellulare è calcolato come percentuale di cellule totale conta 3,4. Nota: in alternativa, la distribuzione dei nuclei apoptotici possono essere valutati in flatmounts 3 o criostato sections4 di colture di wholemounts retina da TdT-mediata fine etichettatura dUTP nick (TUNEL). </li><li> Per il rilevamento della proliferazione delle cellule, BrdU (5 mM) possono essere aggiunte 6 ore prima della fine della cultura e della incorporazione di BrdU visualizzate in cytospins di omogenati cella colorazione immunocitochimica con un anticorpo anti-BrdU (ad esempio Developmental Studies Ibridoma Banca, Iowa, USA). </li><li> L'effetto del trattamento su diversi tipi di cellule della retina possono essere visualizzati in cytospins da anticorpi specifici come Brn3a neuroni (cellule gangliari marker) o opsina (fotorecettori marcatore) e di contrasto con DAPI. </li></ol> Parte 7: Risultati Rappresentante <img src="/files/ftp_upload/1634/1634fig1tmb.jpg" border="0" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Passi in preparazione della murino wholemounts organotipica retina Una testa di topo con entrambi gli occhi. B occhio murini con il lato alto lente, tutti i livelli ancora al suo posto. Dell'occhio C murini da parte posteriore con il nervo ottico ancora attaccato. Occhio D murini con sclera e dell'epitelio pigmentato parzialmente rimosso. E retina murini con epitelio della cornea, sclera e pigmento completamente rimossa, ma lenti e vitreo ancora al loro posto. F murini tazza retina wholemount con obiettivo e vitreo rimosso. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1634/1634fig1.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1634/1634fig2tmb.jpg" border="0" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: Analisi delle culture organotipica retina wholemount da cytospin e sezioni Per l'analisi di apoptosi, cytospins di sospensioni cellulari dissociate sono macchiati dal DAPI e nuclei pycnotic possono essere distinte dalla frammentazione nucleare o condensazione della cromatina (punte di freccia in A). In alternativa, sezioni wholemount (CE; giorni retina murina postnatale (P) 2) o flatmount retina (F) può essere sottoposto a un test TUNEL e di contrasto con DAPI (E). L'effetto del trattamento su diversi tipi di cellule della retina possono essere visualizzati in cytospins neurone da anticorpi specifici come la cellula gangliare marcatore Brn3a (frecce in B) GCL, strato di cellule gangliari;. INL, prospettico strato interno nucleare. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1634/1634fig2.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 2.

<ol><li>Rieke, M., Gottwald, E., Weibezahn, K. -F., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+reconstruction+in+3D-spheroids+from+rodent+retina+in+a+motion-free%2C+bioreactor-based+microstructure%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Tissue reconstruction in 3D-spheroids from rodent retina in a motion-free, bioreactor-based microstructure.</a> Lab. Chip. 8, 2006-2213 (2008).</li>
<li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature Protocols. 1, 2710-2718 (2006).</li>
<li>Duenker, N., Valenciano, A. I., Franke, A., Hernandez-Sanchez, C., Dressel, R., Behrendt, M., de Pablo, F., Krieglstein, K., de la Rosa, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balance+of+pro-apoptotic+transforming+growth+factor-beta+and+anti-apoptotic+insulin+effects+in+the+control+of+cell+death+in+the+postnatal+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Balance of pro-apoptotic transforming growth factor-beta and anti-apoptotic insulin effects in the control of cell death in the postnatal mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 22, 28-38 (2005).</li>
<li>Franke, A. G., Gubbe, C., Beier, M., Duenker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factors+beta+and+Bone+morphogenetic+proteins%3A+Cooperative+players+in+chick+and+murine+programmed+retinal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factors beta and Bone morphogenetic proteins: Cooperative players in chick and murine programmed retinal cell death.</a> J. Comp. Neurol. 495, 263-278 (2005).</li>
<li>de la Rosa, E. J., Díaz, B., De Pablo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoculture+of+the+chick+embryonic+neuroretina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Organoculture of the chick embryonic neuroretina.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 36, 133-144 (1998).</li>
<li>Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Duenker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay%3A+How+it+really+works%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: How it really works.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li>
</ol>

Il vantaggio di murine organotipica retina 2-5 wholemount culture più di dissociazione, monostrato, culture 3D retinospheroid o ri-aggregati sferoidali 1 risiede nella conservazione delle interazioni e connessioni neuronali, imitando la situazione in vivo. Rispetto ai rapporti precedenti 2, il nostro articolo video fornisce una dimostrazione dettagliata delle peculiarità di enucleazione degli occhi murini e la dissezione di retine di varie fasi di sviluppo tra cui la rimozione d...

<table><tbody><tr><td>Topi</td><td>Animale</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio per dissezione</td><td>Strumento</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Il PBS deve essere freddo (&amp;gt; 4&amp;#x00B0;C) e sterile</td></tr><tr><td>Mezzo di Eagle modificato di Dulbecco / miscela nutriente F-12 di Ham</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D 8900</td><td>DMEM / F-12</td></tr><tr><td>Apo-transferina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T 1147</td><td></td></tr><tr><td>Putrescina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P 5780</td><td></td></tr><tr><td>Selenito di sodio</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S 9133</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P 6149</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td>200 mM (100X), liquido</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Reagente</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>8076.3</td><td>30 mg/ml</td></tr><tr><td>Collagenasi</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C 0773</td><td>200 U/ml</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4799</td><td>Da pancreas di suino; 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Ialuronidasi</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H 3884</td><td>200 mg/ml</td></tr><tr><td>DNasi I</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>1 284 932</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E 6511</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione al silicone</td><td>Reagente</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>35130</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>8% PFA in tampone fosfato 0,1 M (pH 7,4).</td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-diammidino-2-fenilindolo diidrocloruro</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D 0542</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio fluorescente</td><td>Reagente</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>BrDU</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B 9285</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 96 pozzetti</td><td>Strumento</td><td>Falcon BD</td><td>3072</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 24 pozzetti</td><td>Strumento</td><td>Falcon BD</td><td>3047</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di Pasteur</td><td>Strumento</td><td>Brand GmbH</td><td>747720</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette DUMONT n. 5</td><td>Strumento</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>steli molto fini smussati (punta 0,05 mm x 0,02 mm)</td></tr><tr><td>Pinzette DUMONT n. 7</td><td>Strumento</td><td>Fine Science Tools</td><td>11271-30</td><td>steli curvi (punta 0,07 mm x 0,10 mm)</td></tr><tr><td>Forbici a molla, dritte, 8 cm</td><td>Strumento</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td>lame sottili e piccole, dritte</td></tr><tr><td>Forbici standard, dritte, affilate/ottuse</td><td>Strumento</td><td>Fine Science Tools</td><td>14007-14</td><td>Da utilizzare per decapitazione o dislocazione cervicale</td></tr><tr><td>Tubi Eppendorf</td><td>Strumento</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>2 ml; fondo rotondo per una migliore precipitazione del pellet durante la centrifugazione / cytospin</td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata</td><td>Strumento</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitatore rotatorio</td><td>Strumento</td><td>CAT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytospin</td><td>Strumento</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo, come organotipica cultura murine wholemount retina

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Ablazioni mirata di geni e l&#39;analisi di modelli animali è la strategia classica per la funzione dell&#39;iscrizione gene specifico della retina. Tuttavia, transgenici, retina specifici o condizionale modelli di topo knockout spesso mostrano mortalità precoce o soffre di malformazioni gravi, impedendo l&#39;analisi al di là fasi embrionali o postnatale precoce. Colture di cellule primarie è un&#39;alternativa per studiare gli effetti di fattori applicata ricombinante esogena, l&#39;iperespressione di geni o di siRNA-mediato knockdown gene in un ambiente controllato. Colture di cellule dissociate ha il vantaggio che i segnali endogeni raggiungere le cellule bersaglio sono ridotte, facilitando l&#39;identificazione di effetti esogenamente attivato dopo manipolazione farmacologica. Tuttavia, importanti interazioni cellula-cellula sono inizialmente distrutte per digestione enzimatica o dissociazione meccanica, anche se le culture retinospheroid riaggregati 1 sono utilizzati. Al contrario, organotipica culture retina wholemount fornire un sistema vicino al fisiologico in situazione vivo con le interazioni e le connessioni neuronali 2-5 ancora conservati. In questo articolo abbiamo video di fornire una dimostrazione passo passo (1) l&#39;istituzione di in vivo, come organotipica culture wholemount della retina, comprese particolarità dissezione degli occhi murini embrionale, postnatale e adulta e (2) una procedura di dissociazione e cytospin per l&#39;analisi dei neuroni apoptosi e la proliferazione delle cellule della retina in wholemounts organotipica, ad esempio dopo coltura in presenza di fattori esogeni applicata ricombinante.

In questo articolo video dimostra la creazione di organotipica culture retina wholemount cytospin e una procedura per l&#39;analisi di esogenamente effetti indotti. Organotipica culture retina wholemount imitare il<em&gt; In vivo</em&gt; Situazione e favorire in modo significativo l&#39;accessibilità di retina murini per le manipolazioni sperimentali che aggirano gli svantaggi dei classici modelli animali murini.

In vivo, come organotipica Cultura Murine Wholemount retina

Le ablazioni mirate di geni e l'analisi di modelli animali rappresentano la strategia classica per determinare la funzione di specifici geni retinici. Tuttavia, i modelli transgenici, ...

Ciao, mi chiamo Nicole Dunca. Sono a capo del Dipartimento di Neuro presso l'Istituto di Anatomia dell'Università di D book ASIN in Germania. Ciao, sono uno studente di dottorato nel laboratorio della Professoressa Dunca presso il Dipartimento di Neuroanatomia.Oggi vi mostreremo un sistema pratico per coltivare retine neurosensoriali in condizioni simili a quelle in vivo come organotipi retinici. Cominciamo dunque. L'ablazione mirata di geni e l'analisi di modelli animali rappresentano una strategia classica per determinare la funzione specifica di geni retinici.Tuttavia, i modelli di topo transgenico spesso mostrano una litogenesi precoce o presentano gravi malformazioni che impediscono un'analisi oltre le fasi embrionali o postnatali precoci. La coltura primaria di cellule rappresenta un'alternativa per studiare gli effetti di fattori ricombinanti esogeni in un ambiente controllato. La coltura di cellule dissociate presenta il vantaggio di ridurre i segnali endogeni che raggiungono le cellule bersaglio, facilitando così l'identificazione degli effetti indotti esogenamente.Tuttavia, le interazioni tra cellula e cellula vengono distrutte nelle colture dissociate. Al contrario, le c

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Questo articolo dimostra la dissezione e l'incubazione di retina di coniglio e di particelle-mediato trasferimento genico di plasmidi codifica GFP o una varietà di marcatori subcellulari in cellule gangliari della retina.

Cultura organotipica di Retina Coniglio adulti

Qui si descrive una soluzione economica per la cultura tecnica organotipica di retina suini adulti per sette giorni. In breve, una carta sterile filtro è stato usato per sollevare la retina neurale fuori dal RPE e fotorecettori lato posto su un inserto sollevata da una misura stand.

Cultura organotipica di tutto spessore Retina suina adulti

Il protocollo qui descritto è per la valutazione strutturale di una preparazione retinica a montaggio intero. Ciò include le descrizioni della dissezione tissutale, il montaggio su un inserto di membrana in politetrafluoroetilene idrofilizzato (PTFE), il caricamento del bolo con marcatori fluorescenti e un confronto della fissazione con carbodiimmide e paraformaldeide per l'analisi immunoistochimica dei componenti cellulari e sinaptici.

Protocollo ottimizzato per la preparazione dell'intero montaggio retinico per l'imaging e l'immunoistochimica

la rigenerazione della retina zebrafish è stato per lo più studiata utilizzando retine fissi. Tuttavia, i processi dinamici come la migrazione nucleare interkinetic si verificano durante la risposta rigenerativa e richiedono live-cell imaging per studiare i meccanismi alla base. Qui, descriviamo condizioni di coltura e di imaging per monitorare Interkinetic migrazione nucleare (INM) in tempo reale utilizzando la microscopia multiphoton.

Cultura di adulti transgenici Zebrafish retina espianti per live-cell imaging per Multiphoton Microscopia

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Coltivazione a lungo termine e priva di siero di estipe di retina di topo organotipico con epitelio pigmentato retinico intatto

L'imaging in vivo è un potente strumento per lo studio della biologia in salute e malattia. Questo protocollo descrive l'imaging transpupillare della retina del topo con un microscopio standard a due fotoni. Dimostra anche diversi metodi di imaging in vivoimaging per marcare in modo fluorescente più coorti cellulari della retina.

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

Questo studio mira a sviluppare un nuovo modello di coltura retinica organotipica umana (HORC) che impedisce di compromettere l'integrità retinica durante la manipolazione dell'espianto. Ciò si ottiene coltivando la retina con il vitreo sovrastante e il pigmento retinico sottostante epitelio-coroide (RPE-coroide) e sclera.

Caratterizzazione di una nuova tecnica di coltura retinica organotipica umana

Questo protocollo presenta e descrive i passaggi per l'isolamento, la dissezione, la coltivazione e la colorazione degli espianti retinici ottenuti da un topo adulto. Questo metodo è utile come modello ex vivo per lo studio di diverse malattie neurovascolari retiniche come la retinopatia diabetica.

Espianto retinico della retina del topo adulto come modello ex vivo per lo studio delle malattie neurovascolari retiniche

Gli espianti retinici ottenuti da macachi selvatici sono stati coltivati in vitro. La degenerazione retinica e la via di segnalazione cGMP-PKG sono state indotte utilizzando l'inibitore della PDE6 zaprinast. L'accumulo di cGMP negli espianti a diverse concentrazioni di zaprinast è stato verificato utilizzando l'immunofluorescenza.

Colture organotipiche di espianti retinici da scimmia macaco

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) agisce come una barriera cruciale tra la coroide e la retina, promuovendo la salute e la funzione dei tipi di cellule retiniche, come i fotorecettori. In questo articolo, descriviamo un protocollo semplice ed efficace per isolare e coltivare l'EPR murino adulto.

Un metodo semplificato per l'isolamento e la coltura di cellule epiteliali pigmentate retiniche da topi adulti

Qui, forniamo una metodologia dettagliata per isolare la retina dall'occhio del topo per una sperimentazione ex vivo estesa. Questo protocollo sottolinea l'importanza di rendere accessibile questo approccio tecnicamente impegnativo per i ricercatori che desiderano sfruttare le vie di ricerca offerte dal mantenimento della glia retinica in situ nel tessuto vivo.

Un modello di espianto ex vivo per lo studio delle interazioni gliali nella retina del topo

Impara a stabilire colture organotipiche di retina murina intera e il metodo cytospin per analizzare effetti esogeni. Questo sistema mantiene le interazioni neuronali preservate, superando i limiti dei modelli transgenici classici.

In vivo, come organotipica Cultura Murine Wholemount retina

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