Misurare coefficienti di diffusione via a due fotoni di recupero fluorescenza Dopo photobleaching

La fluorescenza multifotonica. Il recupero dopo la procedura di fotosbiancamento è facilmente dimostrabile con un campione di molecole di colorante fluorescente che si diffonde liberamente. In primo luogo, un raggio laser a bassa intensità viene inviato nel campione per generare un livello di riferimento di fluorescenza dalle molecole D all'interno del volume focale del laser.

Successivamente, un breve flash laser ad alta intensità viene inviato per fotosbiancare una parte delle molecole di colorante all'interno del volume focale. Infine, il raggio laser viene attenuato al precedente livello di bassa intensità e la fluorescenza viene monitorata mentre le molecole fotosbiancate si diffondono verso l'esterno e vengono sostituite da molecole ancora fluorescenti provenienti dall'esterno del volume focale. La fluorescenza risultante in funzione della curva del tempo viene analizzata per ottenere il coefficiente di diffusione.

Ciao, sono Kelly Sullivan del Laboratorio di Edward Brown presso il Dipartimento di Ingegneria Biomedica dell'Università di Rochester. Oggi ti mostreremo come eseguire il recupero della fluorescenza multifotone dopo il fotosbiancamento. Utilizziamo questa tecnica nel nostro laboratorio per studiare la diffusione sia in sistemi biologici in vitro che in vivo.

Quindi iniziamo. Per iniziare, impostare la lunghezza d'onda del laser desiderata e inserire il filtro appropriato davanti al tubo moltiplicatore di foto o PMT. Successivamente, per evitare danni alla cella PCAL, regolare la potenza del laser su 200 milliwatt o meno.

Ci sono due specchi orientati in una figura quattro a monte della cella pcal. Questi specchi sono necessari e sufficienti per allineare il raggio laser attraverso la cella pcal. Impostare l'offset di tensione sul controller di polarizzazione della cella pcal su zero, regolare il percorso del laser attraverso la cella pcal in modo tale che il laser sia centrato nelle finestre anteriore e posteriore.

Utilizzare lo specchio a monte nella figura quattro per centrare il raggio nella finestra anteriore e lo specchio a valle nella figura quattro per centrare il raggio nel finestrino posteriore. Ora imposta la tensione attraverso il cristallo della cella pcal al valore massimo. Il valore appropriato dipende dalle lunghezze d'onda e può essere trovato nel manuale di istruzioni della cella pcal.

Regolare gli specchi nella figura quattro a monte della cella pcal fino a massimizzare la potenza di uscita dalla cella pcal. Ora porta la tensione attraverso il cristallo a zero e regola l'offset di tensione sul controller di polarizzazione per ridurre al minimo la potenza di uscita dalla cella pcal. Riportare la potenza laser incidente sulla cella pcal al valore richiesto per l'esperimento.

Passiamo ora al microscopio, otteniamo una buona messa a fuoco visiva su un campione fluorescente standardizzato. Qui stiamo usando granuli di polline fluorescenti fissi. Una volta messo a fuoco, sigillare il microscopio, regolare la potenza del laser a un livello appropriato per l'imaging del campione modificando la tensione attraverso il cristallo della cella pcal.

Infine, spegnere le luci e accendere il PMT. Avviare una scansione ripetuta dell'immagine del campione standardizzato e regolare gli specchi a valle della cella pcal fino a ottenere un'immagine nitida del campione. Ora diamo un'occhiata alla determinazione dei poteri di monitoraggio sicuri che le persone si concentrano all'interno del campione.

Ai fini di questo video, utilizzeremo un campione di colorante acquoso contenuto all'interno di una depressione in un vetrino e coperto con un vetrino. Attenuare il laser a una potenza bassa ma ragionevole per generare fluorescenza all'interno del campione. Sigillare il microscopio, deviare l'uscita dal PMT al contatore di fotoni.

Spegnere le luci, accendere il PMT e iniziare una scansione puntuale sul software del microscopio. Impostare il contatore di fotoni in modo che si integri su una scala temporale molto più lunga del tempo di recupero della fluorescenza previsto e registrare un numero ragionevole di punti dati. Aumenta la potenza e prendi un'altra serie di dati sul conteggio dei fotoni.

Continuare ad aumentare la potenza fino a quando l'aumento del numero di fotoni sembra diminuire in modo significativo. Per quanto riguarda il grafico dell'aumento di potenza, il log di fotone conta in funzione del log di potenza. Qualsiasi deviazione da una pendenza di due indica lo sbiancamento.

Durante il monitor, selezionare una potenza del monitor ragionevole che sia inferiore a questa interruzione. Determiniamo ora i parametri di input per lo scaler multicanale e il generatore di impulsi. Sul generatore di impulsi.

Impostare il tempo di pre-apprendimento in modo che sia da una a due volte maggiore del tempo di recupero previsto e che il tempo di candeggina sia un decimo del tempo di recupero previsto sull'ablatore a metà tempo. Imposta la larghezza del raccoglitore a circa la metà della durata della candeggina e imposta il numero di raccoglitori per record, in modo che il prodotto della larghezza del raccoglitore selezionato e dei contenitori per record sia maggiore del tempo di recupero completo previsto. Più i tempi di preble e bleach tornano al generatore di impulsi e impostano la frequenza della sequenza di preble e bleach uguale a un valore appena inferiore all'inverso del prodotto della larghezza del bin moltiplicato per il numero di bin per record.

Infine, impostare il numero di record per scansione sullo scaler in base all'intensità del segnale alla potenza del monitor scelta. Ora imposta la potenza del monitor su un livello sicuro e imposta la potenza della candeggina a circa 200 milliwatt al di sopra del limite di sbiancamento determinato durante il test di sbiancamento del monitor. Queste potenze sono entrambe impostate come tensioni diverse attraverso la tenuta cristallina della cella al, il microscopio spegne le luci.

Accendere il PMT. Avviare una scansione del punto sul software di imaging. Quindi avviare il generatore di impulsi e l'ablatore.

Per analizzare la curva di recupero risultante, segnare tre punti importanti. La fluorescenza prebola, la fluorescenza immediatamente dopo la candeggina e la fluorescenza alla fine del set di dati. Utilizzare i valori di fluorescenza pre e immediatamente dopo la decolorazione per stimare meglio il tempo di recupero dimezzato.

Ora, utilizza le regole descritte nei passaggi precedenti per aggiornare i valori per la decolorazione preble e le durate della larghezza iniziale. Prendi una nuova curva e continua a modificare i parametri fino a quando la curva risultante non mostra una forte decolorazione e un recupero regolare. Verificare la saturazione dell'eccitazione tracciando il log del parametro di profondità della candeggina in funzione del log di potenza.

Qualsiasi deviazione da una pendenza di due indica la saturazione dell'eccitazione. Scegli un potere di candeggina che produca una candeggina forte ma non causi saturazione. Infine, con i parametri appropriati determinati, continuare a eseguire il recupero della fluorescenza multifotone dopo il fotobleaching o le curve MP FP del campione di interesse.

Ora mostreremo i risultati rappresentativi di entrambi i dati grezzi di MP frap a una curva di mp F wrapp normalizzata che è stata adattata, il coefficiente di diffusione, i dati grezzi di MP F frap, una forte candeggina e un recupero regolare. Con il recupero completo riportato per la seconda metà dei dati per adattarli ai dati. Per prima cosa normalizziamo il recupero alla fluorescenza media preble e poi eseguiamo un adattamento non lineare dei quadrati affittati.

Rispetto al modello appropriato. Entrambi i set di dati sono stati presi in fluoresceina acquosa e coefficienti di diffusione della resa. Coerentemente con la letteratura Vi abbiamo appena mostrato come eseguire un recupero di fluorescenza multi fotone dopo un esperimento di fotobleaching.

Quando si esegue questa procedura, è importante prestare attenzione e impostare i parametri sperimentali, in particolare la durata della candeggina e i poteri di sbiancamento e monitoraggio ai limiti di sicurezza definiti nel protocollo. Quindi grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.