Dissezione di vivere Drosophila Embrioni: Metodi semplificati per lo screening Collezioni Mutant dalla colorazione anticorpale

Qui vediamo la procedura per raccogliere gli embrioni. Trasferire le mosche dai vial nei tubi di una camera di raccolta a cinque canne. Quindi posizionare una piastra di agar all'uva sulla sommità della camera e lasciare che le mosche depongano le uova per alcune ore.

Quando gli embrioni hanno raggiunto lo stadio corretto, trasferirli dalla piastra di agar all'adesivo doppiofaccia con un pennello. Ora rotolare gli embrioni fuori dai loro corions e allinearli su un blocco di agar con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Al centro, vediamo un vetrino con un rettangolo di cera e un pezzo di nastro adesivo doppiofaccia a un'estremità. Ribaltare l'adesivo doppiofaccia sopra il blocco con gli embrioni allineati e toccare gli embrioni per trasferirli sul vetrino.

Ora saranno immediatamente con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Aggiungere PBS nell'area del vetrino delimitata dal rettangolo di cera in modo da coprire gli embrioni. L'immagine superiore mostra una vista laterale del vetrino e quella inferiore una vista dall'alto.

Praticare un'incisione lungo la membrana vellica con un ago da dissezione in vetro. Pungere gli embrioni nella regione cerebrale, sollevarli e disporli in file sul vetro. Quindi dissezionare ciascun embrione per ottenere un filetto.

Alla fine della procedura, si otterrà un vetrino con file di embrioni di filet. È ora pronto per la fissazione. Ciao, sono Peter Lee, un ricercatore del laboratorio Kaizens della divisione di biologia del Caltech.

Ciao, sono Ashley Wright, studente laureato al Caltech nel laboratorio di Kaizen. Sono Kaizen, professore al Caltech, e il mio gruppo di ricerca studia lo sviluppo del sistema nervoso nei moscerini della frutta. Oggi vi mostreremo una procedura per dissezionare embrioni di moscerino vivi.

Abbiamo utilizzato questi metodi per cercare ligandi di recettori orfani. Questo viene fatto esaminando collezioni di linee che sovraesprimono proteine di superficie cellulare mediante colorazione vitale di embrioni con proteine di fusione recettrici. Utilizziamo anche questa procedura in laboratorio per studiare fenotipi embrionali e condurre schermate genetiche.

Ho condotto uno screening di carenza per gli atti motori sui fenotipi di guidaggio. Cominciamo dunque. Peter vi mostrerà come si fa.

Per iniziare, utilizzare una spatola per applicare una goccia di pasta di lievito su una piastra di raccolta degli ovuli a base di uva corrispondente a ciascuno dei barattoli di una camera di raccolta degli embrioni. Successivamente, iniettare gas di anidride carbonica nei tubi delle mosche per addormentarle. Trasferire alcune centinaia di mosche direttamente nella camera di raccolta.

Quindi coprire la camera con la piastra di raccolta delle uova e premere verso il basso. Utilizzando un nastro adesivo lungo 20 pollici, fissare insieme la camera e la piastra a partire dal centro della piastra di agar. Il nastro si sovrapporrà sulla piastra di raccolta delle uova. Dopo che le mosche si saranno risvegliate, incubare a temperatura ambiente al buio per due o tre ore in posizione orizzontale; al termine dell'incubazione, battere delicatamente per far scendere le mosche e sostituire la piastra di raccolta.

Se sono presenti meno di 100 embrioni su ciascun settore della piastra rimossa, continuare a effettuare raccolte di due ore fino a quando non sono stati raccolti abbastanza embrioni. Gli embrioni raccolti possono essere raggruppati secondo le specifiche indicate nel protocollo scritto allegato.

Per far invecchiare gli embrioni, posizionare un pezzo bagnato di carta da filtro circolare da 90 millimetri nel coperchio di una piastra di Petri e appoggiare la piastra di raccolta con gli embrioni capovolta su di esso. Incubare la piastra per la durata desiderata e alla temperatura desiderata, quindi preparare un vetrino per la stadiazione e il raggruppamento degli embrioni posizionando del nastro adesivo doppio su un vetrino. Successivamente, posizionare una lastra rettangolare di agar all'uva sul vetrino S.

Il portapialle deve essere abbastanza grande da contenere da cinque a dieci file di 10-15 embrioni. Una volta che gli embrioni hanno raggiunto lo stadio desiderato, rimuoverli dall'incubatrice. Trasferire gli embrioni invecchiati dalla piastra di raccolta al nastro adesivo doppia faccia.

Utilizzando un pennello umido, distribuire uniformemente gli embrioni lungo il nastro. Sotto un microscopio stereoscopico GFP, selezionare gli embrioni SOAR con espressione GFP appropriata, che indica il genotipo. In questo esperimento, il genotipaggio viene effettuato selezionando gli embrioni che non mostrano espressione del marcatore GFP dell'armatura bilanciatrice curva.

Dato che il genotipaggio degli embrioni varierà a seconda del bilanciatore utilizzato, si prega di consultare il protocollo scritto allegato per ulteriori informazioni su come eseguire questo passaggio. Successivamente, utilizzando un ago da dissezione arrotondato, rivestire gli embrioni rotolandoli delicatamente sul nastro adesivo doppio-faccia. Allo stadio 16, l'intestino si è diviso in tre bande.

Dopo questo, l'intestino inizia a sviluppare bande diagonali vicino alla coda, quindi si avvolge e l'embrione diventa più nitido. Successivamente, utilizzare l'ago da dissezione per arrotolare ogni embrione sulla superficie della coriona o su altri embrioni. Evitando il contatto con il nastro, sollevare l'embrione e trasferirlo sul blocco di agar all'uva.

Allineare gli embrioni rivestiti su questa lastrina con i lati dorsali contro la piastra di agar e le estremità posteriori rivolte verso il basso. Successivamente, posizionare la lastrina in una capsula di Petri contenente carta da filtro bagnata e incubare gli embrioni a temperatura ambiente fino al raggiungimento dell'età desiderata. Per la dissezione, preparare una lastrina per dissezione in vivo tagliando un piccolo pezzo rettangolare di nastro adesivo doppiofaccia. Posizionare il nastro adesivo vicino a un'estremità di una lastrina super frost plus utilizzando una matita da vetrino.

Disegnare un rettangolo largo quanto il vetrino e lungo da 30 a 40 millimetri intorno al nastro. Tra la cera e il nastro deve rimanere uno spazio di circa tre millimetri. Successivamente, trasferire gli embrioni dalla piastra grande sul nastro capovolgendo il vetrino e abbassandolo delicatamente sugli embrioni allineati in modo che il nastro venga a contatto con essi.

Gli embrioni devono essere orientati con le estremità posteriori verso il basso. Dopo il trasferimento, posizionare gli embrioni con il lato dorsale rivolto verso l'alto sul vetrino e aggiungere immediatamente un XPBS sopra gli embrioni per riempire il rettangolo di cera utilizzando un ago da dissezione in vetro, preparato con un estrattore di aghi simile a un ago per iniezioni. Tagliare lungo la linea mediana dorsale partendo dall'estremità posteriore dell'embrione.

Ora punzecchiare l'estremità anteriore dell'embrione e sollevarla. Partendo dal basso, trasferire l'embrione a destra della striscia adesiva, mantenendolo nel buffer. Continuare a dissezionare e trasferire gli embrioni, formando una fila ordinata di embrioni sul vetrino che corrisponda a ciascuna fila della piastra agar.

Utilizzando l'ago da dissezione, premere delicatamente le lembra della parete corporea sul vetrino, evitando di stirare o rimuovere materiale dalla loro superficie. L'ago dovrebbe toccare soltanto gli angoli anteriore e posteriore ai margini dorsali della parete corporea.

Poiché gli assoni motori non si estendono così lontano dorsalmente, evitare di toccare gli aghi del vetrino poiché si romperanno dopo che tutti gli embrioni sono stati trasferiti e fissati sul vetrino. Rimuovere l'intestino da ciascun embrione recidendo i quattro tratti intestinali dalla regione cerebrale e tirando l'intero intestino lontano dall'embrione.

Spostare l'intestino posteriore sul vetrino. Una volta completate tutte le dissezioni, utilizzare due pipette Pasteur per aggiungere contemporaneamente, in un angolo del rettangolo di cera, formaldeide al 5% a temperatura ambiente e rimuovere la soluzione dall'angolo opposto. Cambiare il fissativo tre volte utilizzando un volume totale di circa sei millilitri.

Incubare gli embrioni nella soluzione fissativa per 45 minuti. È molto importante evitare che il menisco entri in contatto con gli embrioni, poiché ciò li distruggerebbe. Utilizzare una pipetta Pasteur per rimuovere la maggior parte della soluzione fissativa.

Lavare con PBS 3 volte utilizzando il metodo delle pipette Pasteur. Successivamente, lavare con PBT tre volte per permeabilizzare gli embrioni. Questo passaggio rende anche gli embrioni meno sensibili al menisco.

Dopo il lavaggio finale, rimuovere con attenzione il PBT inclinando il vetrino e toccando brevemente con un fazzoletto Kim il bordo dell'area delimitata dalla cera per eliminare la soluzione in eccesso. Utilizzando una pipetta pre-caricata, aggiungere immediatamente 200 microlitri di soluzione bloccante per 10-30 minuti. A temperatura ambiente, rimuovere la soluzione bloccante utilizzando un fazzoletto Kim.

Quindi aggiungere immediatamente 200 microlitri dell'anticorpo primario desiderato diluito nella soluzione di blocco. Posizionare il vetrino in una piastra umidificata e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius. In questo esperimento, l'anticorpo monoclonale 1D four viene utilizzato per etichettare gli assoni motori.

Il giorno successivo, rimuovere le piastre da quattro gradi Celsius e lavare gli embrioni tre volte su una piattaforma oscillante con PBT per almeno 15 minuti per ogni lavaggio. Per tutti i passaggi di lavaggio, assicurarsi che ci sia abbastanza PBT da immergere completamente il vetrino durante l'oscillazione. Dopo aver lavato gli embrioni, eseguire il blocco del vetrino come in precedenza.

Dopo il blocco, aggiungere immediatamente 200 microlitri di soluzione del secondo anticorpo e di blocco e incubare per due ore a temperatura ambiente; qui viene utilizzato un secondo anticorpo Alexa 488 anti-US congiuntamente a Rodine Phin per etichettare le fibre muscolari. Lavare nuovamente tre volte con PBT sulla piattaforma oscillante, per almeno 15 minuti per ogni lavaggio.

Trasferire i vetrini su un'altra piastra per rimuovere il detergente residuo. Quindi lavare due volte con PBS per cinque minuti. Rimuovere il vetrino dalla piastra PBS, asportare la maggior parte del PBS rimanente dal pozzetto con un fazzoletto chimico e aggiungere immediatamente 500 microlitri di glicerolo al 70%.

Poiché il glicerolo ha lo stesso indice di rifrazione dell'embrione, l'esecuzione di questo passaggio renderà la colorazione più visibile; schiarire gli embrioni per due ore a temperatura ambiente o per tutta la notte a quattro gradi Celsius. Quindi rimuovere il glicerolo con un fazzoletto di carta kimwipe. La rimozione della quasi totalità del glicerolo appiattirà gli embrioni, mentre una rimozione parziale del glicerolo porterà a una struttura più tridimensionale.

Dopo aver rimosso la glicerolo, applicare un coprioggetto numero uno. Gli embrioni sono pronti per l'analisi; gli embrioni dissecati e colorati possono essere visualizzati mediante microscopia a fluorescenza. Qui, un embrione disseccato è stato colorato con l'anticorpo 1D quattro, specifico per l'etichettatura degli assoni motori.

Questa immagine è simile nell'aspetto alle immagini più comunemente osservate in cui la immunohistochemica con HRP è stata utilizzata per la visualizzazione mediante immunofluorescenza. È possibile ottenere immagini di qualità superiore in cui i dettagli dei rami dell'assone motorio sono visibili più chiaramente. La colorazione concomitante con rho domine marcato con phin, che si lega all'actina, consente la visualizzazione simultanea dei muscoli.

Questo fornisce un'immagine più chiara della stratificazione e dell'organizzazione muscolare rispetto a quella ottenibile con la colorazione HRP. Qui, gli assoni motori 1D four sono mostrati in verde, mentre il muscolo Fein è mostrato in rosso. Abbiamo appena dimostrato come dissezionare embrioni di Drosophila vivi da collezioni di linee mutanti. Quando si eseguono queste procedure, è importante iniziare con linee semplici come lio, armadillo, GFP, ceppi bilanciati, e analizzarne solo alcune alla volta.

Man mano che acquisirete maggiore esperienza e velocità nelle dissezioni, potrete eseguire fino a 10 linee al giorno, consentendovi di analizzare una collezione di circa 200 linee mutanti nell'arco di circa 20 giorni. Pertanto, si tratta davvero di una procedura molto efficiente una volta acquisita padronanza nell'esecuzione di tutti i passaggi. È tutto, grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.