Dissezione di vivere Drosophila Embrioni: Metodi semplificati per lo screening Collezioni Mutant dalla colorazione anticorpale

Qui vediamo la procedura per la raccolta degli embrioni. Trasferire le mosche dalle fiale nelle provette di una camera di raccolta a cinque fusti. Quindi mettere un piatto agricolo d'uva sopra la camera e lasciare che le mosche depongano le uova per alcune ore.

Quando gli embrioni sono allo stadio giusto, trasferiscili dall'aate d'uva al nastro biadesivo con un pennello. Ora arrotola gli embrioni dai loro coni e allineali su un blocco di agar con i lati ventrali. Al centro, vediamo un vetrino con un rettangolo di cera e un pezzo di nastro adesivo doppio A un'estremità, capovolgi il nastro adesivo doppio sul blocco con gli embrioni allineati e toccalo sugli embrioni per trasferirli sul vetrino.

Ora saranno immediatamente con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Aggiungere PBS all'area del vetrino racchiusa dal rettangolo di cera in modo da coprire gli embrioni. La parte superiore mostra una vista laterale della diapositiva e la parte inferiore mostra una vista dall'alto.

Tagliare una fessura lungo la membrana del viello con un ago da dissezione in vetro. Infilzare gli embrioni nella regione del cervello, sollevarli e spostarli in file sul vetro. Quindi seziona ogni embrione per fare un filetto.

Al termine della procedura, avrai una diapositiva con file di embrioni di filetto. Ora è pronto per essere riparato. Ciao, sono Peter Lee, un poster nel laboratorio Kaizens nella divisione di biologia del Caltech.

Ciao, sono Ashley Wright, una studentessa laureata del Caltech in Kaizens Lab. Sono Kaizen, professore al Caltech, e il mio gruppo di ricerca lavora sullo sviluppo del sistema nervoso nei moscerini della frutta. Oggi vi mostreremo una procedura per sezionare embrioni di opale vivi.

Abbiamo usato questi metodi per cercare ligandi dei recettori orfani. Lo facciamo esaminando raccolte di linee che esprimono proteine di superficie cellulare mediante colorazione in tempo reale di embrioni con proteine di fusione del recettore. Utilizziamo questa procedura anche in laboratorio per studiare i fenotipi embrionali e condurre screening genetici.

Ho condotto uno screening di carenza per gli atti motori sui fenotipi di guida. Quindi iniziamo. Peter ti mostrerà come si fa.

Per iniziare, utilizzare una spatola per posizionare una macchia di pasta di lievito su una piastra di raccolta delle uova di uva agri corrispondente a ciascuna delle botti di una camera di raccolta degli embrioni. Quindi, inietta il gas di anidride carbonica nelle fiale delle mosche per far addormentare le mosche. Trasferire alcune centinaia di mosche direttamente nella camera di raccolta.

Quindi coprire la camera con la piastra di raccolta delle uova e premere verso il basso: utilizzando una striscia di nastro adesivo lunga 20 pollici, legare insieme la camera e la piastra partendo dal centro della piastra di agar. Il nastro si sovrapporrà alla piastra di raccolta delle uova. Dopo che le mosche si sono svegliate, incubatele a temperatura ambiente al buio per due o tre ore in posizione orizzontale dopo l'incubazione, picchiettate le mosche verso il basso e sostituite la piastra di raccolta.

Se sono presenti meno di 100 embrioni su ciascun settore della piastra rimossa. Continua a eseguire raccolte di due ore fino a quando non sono stati raccolti abbastanza embrioni. Gli embrioni raccolti possono essere raggruppati secondo le specifiche del protocollo scritto allegato.

Per invecchiare gli embrioni, posizionare un pezzo di carta da filtro circolare bagnato da 90 millimetri nel coperchio di una capsula di Petri e posizionare la piastra di raccolta con gli embrioni capovolti su di essa. Incubare la piastra per la durata e la temperatura desiderate, preparare un vetrino per la stadiazione e lo smistamento dell'embrione posizionando del nastro biadesivo su un vetrino. Quindi posizionare una lastra rettangolare di agar d'uva sul vetrino a S.

L'egger dovrebbe essere abbastanza grande da contenere da cinque a 10 file di 10-15 embrioni. Una volta che gli embrioni hanno raggiunto lo stadio desiderato, rimuoverli dall'incubatrice. Trasferire gli embrioni invecchiati dalla piastra di raccolta al nastro biadesivo.

Usando un pennello bagnato, distribuisci gli embrioni in modo uniforme sul nastro. Sotto un microscopio da dissezione GFP gli embrioni SOAR per un'espressione GFP appropriata, che indica il genotipo. In questo esperimento, la genotipizzazione viene eseguita selezionando embrioni che mancano di espressione del braccio riccio bilanciatore, GFP.

Poiché la genotipizzazione degli embrioni varia a seconda del bilanciatore utilizzato, si prega di fare riferimento al protocollo scritto allegato per ulteriori informazioni su come eseguire questa operazione. Passo. Successivamente, utilizzando un ago da dissezione smussato, rivestire gli embrioni facendoli rotolare delicatamente sul nastro biadesivo. Al punto 16, il budello si è diviso in tre fasce.

Dopodiché, l'intestino inizia a sviluppare bande diagonali vicino alla coda e poi si avvolge e l'embrione diventa più chiaro. Quindi, usa l'ago da dissezione per arrotolare ogni embrione sopra il corion o altri embrioni. Evitando il contatto con il nastro, sollevare l'embrione e trasferirlo sulla lastra di agar d'uva.

Allineare gli embrioni rivestiti su questa lastra con i lati dorsali contro la lastra di agar e le estremità posteriori rivolte verso il basso. Quindi posizionare il vetrino in una capsula di Petri con carta da filtro bagnata e incubare gli embrioni a temperatura ambiente fino a raggiungere l'età desiderata Per la dissezione, preparare un vetrino per la dissezione dal vivo tagliando un piccolo pezzo rettangolare di nastro biadesivo. Posiziona il nastro vicino a un'estremità di un vetrino super frost plus usando una penna a cera.

Disegna un rettangolo della larghezza della diapositiva e lungo da 30 a 40 millimetri attorno al nastro. Dovrebbero esserci circa tre millimetri di spazio tra la cera e il nastro. Quindi trasferisci gli embrioni dalla grande lastra di lastra sul nastro capovolgendo il vetrino e abbassandolo delicatamente sugli embrioni allineati in modo che il nastro entri in contatto con essi.

Gli embrioni devono essere orientati con le estremità posteriori verso il basso. Dopo il trasferimento, gli embrioni saranno posizionati con il lato dorsale rivolto verso l'alto sul vetrino, aggiungere immediatamente un XPBS sugli embrioni per riempire il rettangolo di cera utilizzando un ago da dissezione di vetro, che viene realizzato su un estrattore di aghi come un ago per iniezione. Tagliare lungo la linea mediana dorsale a partire dall'estremità posteriore dell'embrione.

Ora infilzare l'estremità anteriore dell'embrione e sollevarlo. Partendo dal basso, trasferisci l'embrione a destra della striscia di nastro, tenendolo nel tampone. Continuare a sezionare e trasferire gli embrioni, creando una fila ordinata di embrioni sul vetrino che corrisponda a ciascuna fila della lastra agricola.

Utilizzando l'ago da dissezione, spingere delicatamente verso il basso i lembi della parete del corpo sul vetrino. Evitare di allungare o rimuovere materiale dalla loro superficie. L'ago deve entrare in contatto solo con gli angoli anteriori e posteriori in corrispondenza dei bordi dorsali della parete corporea.

Poiché gli assoni del motore non si estendono così lontano. Dorsalmente, evitare di toccare gli aghi del vetrino poiché si romperà dopo che tutti gli embrioni sono stati trasferiti e fissati al vetrino. Rimuovi l'intestino da ogni embrione recidendo i quattro intestini dall'area del cervello e tirando via l'intero intestino dall'embrione.

Sposta il budello posteriore sul carrello. Una volta completate tutte le dissezioni, utilizzare due pipette passate per erogare contemporaneamente il 5% di formaldeide a temperatura ambiente in un angolo della cera, il rettangolo e rimuovere la soluzione dall'angolo opposto. Sostituire la soluzione fissativa tre volte utilizzando un volume totale di circa sei millilitri.

Incubare gli embrioni nella soluzione fissativa per 45 minuti. È molto importante non permettere al menisco di entrare in contatto con gli embrioni poiché ciò li distruggerà. Utilizzare una pipetta passata per rimuovere la maggior parte della soluzione fissativa.

Lavare con PB S3 volte utilizzando il metodo delle due pipette da pascolo. Quindi lavare con PBT tre volte per permeare gli embrioni. Questo passaggio rende anche gli embrioni meno sensibili al menisco.

Dopo il lavaggio finale, rimuovere con cautela il PBT inclinando il vetrino e toccare brevemente una salvietta Kim sull'angolo dell'area racchiusa dalla cera per rimuovere la soluzione in eccesso. Utilizzando un pipettatore precaricato, aggiungere immediatamente 200 microlitri di blocco di soluzione bloccante per 10-30 minuti. A temperatura ambiente, rimuovere la soluzione bloccante utilizzando una salvietta Kim.

Quindi aggiungere immediatamente 200 microlitri dell'anticorpo primario desiderato diluito in soluzione bloccante. Posizionare il vetrino in una piastra umidificata e incubare per una notte a quattro gradi Celsius. In questo esperimento, l'anticorpo monoclonale 1D four viene utilizzato per marcare gli assoni motori.

Il giorno successivo, rimuovere le stoviglie da quattro gradi Celsius e lavare gli embrioni tre volte su una piattaforma a dondolo con PBT per almeno 15 minuti per lavaggio. Per tutte le fasi di lavaggio, assicurarsi che ci sia abbastanza PBT per immergere completamente la guida durante l'oscillazione. Dopo che gli embrioni sono stati lavati, bloccare il vetrino come prima.

Dopo il blocco, aggiungere immediatamente 200 microlitri di anticorpi secondari e soluzione bloccante e incubare due ore a temperatura ambiente qui un Alexa 4 88 go anti-US. Il secondario viene utilizzato in combinazione con Rodine Phin per marcare le fibre muscolari. Anche in questo caso, lavare tre volte con PBT sulla piattaforma oscillante per almeno 15 minuti per lavaggio.

Trasferire i vetrini in un vassoio diverso per rimuovere i residui di detersivo. Quindi lavare due volte con PBS per cinque minuti. Rimuovere il vetrino dal PBS, tracciare la maggior parte del PBS rimanente dal pozzetto con una salvietta chimica e aggiungere immediatamente 500 microlitri di glicerolo al 70%.

Poiché il glicerolo ha lo stesso indice di rifrazione dell'embrione, l'esecuzione di questo passaggio renderà la colorazione più visibile, eliminare gli embrioni per due ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Quindi rimuovere il glicerolo con una salvietta kim. La rimozione di quasi tutto il glicerolo appiattirà gli embrioni, mentre la rimozione di meno glicerolo si tradurrà in una struttura più tridimensionale.

Una volta rimosso il glicerolo, applicare un vetrino coprioggetti numero uno. Gli embrioni sono pronti per l'imaging, gli embrioni sezionati e colorati possono essere visualizzati mediante microscopia a immunofluorescenza. Qui un embrione sezionato è stato colorato con l'anticorpo 1D four che marcava l'assone motore.

Questa immagine è simile nell'aspetto alle immagini più comunemente viste in cui l'immunoistochimica HRP è stata utilizzata per la visualizzazione utilizzando l'immunofluorescenza. È possibile ottenere immagini di qualità superiore in cui i dettagli dei rami dell'assone del motore sono più chiaramente visibili. La colorazione con phin marcata con rho domine, che lega l'actina, consente la visualizzazione simultanea dei muscoli.

Questo fornisce un quadro più chiaro della stratificazione e dell'organizzazione muscolare rispetto a quello che può essere ottenuto con la colorazione HRP Qui, 1D quattro o assoni motori sono mostrati in verde Fein o il muscolo è mostrato in rosso. Abbiamo appena dimostrato come sezionare embrioni vivi di drosofila da collezioni di linee mutanti. Quando si eseguono queste procedure, è importante iniziare con linee semplici come lio, armadillo, GFP, azioni bilanciate e fare solo poche linee alla volta.

Man mano che diventi più esperto e veloce con le dissezioni, puoi fare fino a 10 linee al giorno e questo ti permetterà di esaminare una collezione di circa 200 linee mutanti in un periodo di circa 20 giorni o giù di lì. Quindi questa è davvero una procedura molto efficiente una volta che diventi esperto nell'esecuzione di tutti i passaggi. Quindi questo è tutto, e grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.