Senza lenti on-chip Imaging di celle fornisce un nuovo strumento per High-throughput Cell-Biologia e diagnostica medica

In questo video viene mostrata la prova di concetto per un sistema di imaging su chip con lista di lenti denominato Lucas. Lucas è l'acronimo di lens list ultra wide field of view cell monitoring array platform based on shadow imaging. A differenza dei tradizionali sistemi di imaging, la piattaforma Lucas non richiede obiettivi microscopici né altri componenti ottici ingombranti.

Per Lucas, il campione di interesse viene posizionato su un vetrino da microscopio e delicatamente ricoperto con un'identica lamella. Utilizzando una penna a vuoto, il campione viene caricato sulla regione attiva dell'array di sensori optoelettronici. La piattaforma di imaging registra quindi le ombre o gli ologrammi digitali di tipo lente di ciascuna cellula di interesse all'interno del suo campo visivo.

L'elaborazione digitale automatizzata di queste ombre cellulari può determinare il tipo, il numero e le posizioni relative delle cellule all'interno della soluzione. Il campo visivo può estendersi fino a 18 centimetri quadrati con una profondità di campo di circa cinque millimetri. Le immagini di diffrazione acquisite vengono quindi elaborate digitalmente mediante un algoritmo decisionale sviluppato su misura, al fine di consentire sia la caratterizzazione che l'identificazione di cellule o particelle bersaglio.

Lucas offre una piattaforma miniaturizzata che riduce i costi e aumenta significativamente la produttività per esperimenti basati sull'acquisizione di immagini, rendendola compatibile con tecnologie avanzate e all'avanguardia nel campo della microfluidica e della ricerca biologica. Ciao, sono del Laboratorio ROM Bio e Nano del Dipartimento di Ingegneria Elettrica dell'Università della California, Los Angeles, e io sono Anthony Erlinger, anch'io del laboratorio di Nanofotonica e Biotecnologie fotoniche. Oggi vi mostreremo un procedimento per l'acquisizione di immagini ad alta produttività e senza lente di una soluzione SA eterogenea, come un campione di sangue intero.

Questa procedura nel nostro laboratorio utilizza una nuova tecnica di imaging, che chiamiamo piattaforma di monitoraggio di matrici cellulari a campo ultra-ampio basata sull'imaging dell'ombra, abbreviata in Lucas. Cominciamo dunque. Per iniziare il processo, procurarsi tre millilitri di sangue intero e microsfere di polistirene di diversi diametri, come 5, 10 e 20 micrometri, e portarli a temperatura ambiente per 30 minuti.

Utilizzando una pipetta serologica, aggiungere due millilitri di terreno liquido RPMI 1640 classico come diluente in un tubo sterile in polipropilene da cinque millilitri. Dopo un periodo di sedimentazione di 30 minuti, prelevare 10 microlitri di campione di eritrociti dal fondo del tubo per il prelievo di sangue intero e trasferirli nella soluzione di RPMI. Aggiungere un volume totale di 20 microlitri di microsfere di polistirene alla diluizione di eritrociti in RPMI e agitare la soluzione cellulare pipettando delicatamente. Trasferire da cinque a 15 microlitri della soluzione eterogenea su un coprioggetto utilizzando pinzette.

Posizionare un secondo coperchio identico sulla soluzione. Il campione deve essere uniformemente inserito tra i due coperchi. Successivamente, utilizzando una penna a vuoto, caricare il campione sulla regione attiva dell'array di sensori per l'acquisizione delle immagini.

Quindi preparare il reagente di colorazione acquoso mescolando al 0,1% tamponato come SNY e soluzione diluita di blu di metilene nuovo o NMB in un rapporto volumetrico di due a uno; fare riferimento al protocollo scritto allegato per i dettagli sulla preparazione delle soluzioni di SNY e di blu di metilene puro. Successivamente, in un becher di polipropilene, combinare il reagente di colorazione ACOA con il campione di sangue intero in un rapporto volumetrico di uno a uno, utilizzando un agitatore magnetico per due minuti. Quindi incubare ulteriormente per 10 minuti a temperatura ambiente dopo che la soluzione è stata incubata con 1,99 millilitri di soluzione liquida classica RPMI 1640 in un tubo di polipropilene da cinque millilitri.

Successivamente, trasferire 10 microlitri di soluzione di sangue colorata nell'RPMI per ottenere un rapporto volumetrico di uno a 200. Quindi vortexare la soluzione per 30 secondi ed aggiungere con una pipetta da 10 a 100 microlitri di soluzione di cellule colorate tra coprioggetti o all'interno di un serbatoio microfluidico. Poi, utilizzando una penna a vuoto, posizionare il campione sulla regione attiva dell'array di sensori.

La piattaforma Lucas utilizza un array di sensori optoelettronici per registrare digitalmente ologrammi di cellule in assenza di supporto. A tale scopo, vengono impiegati dispositivi a accoppiamento di carica, o CCD, al fine di consentire un'illuminazione a lunghezza d'onda regolabile, un monocromatore con lampada allo xenon e una fibra di silice fusa di grado standard, costituita da un fascio di fibre e da un foro di circa 100 micrometri di diametro posizionato a circa cinque-dieci centimetri sopra la superficie del sensore, che può essere utilizzato per l'illuminazione a lunghezza d'onda regolabile. L'illuminazione fornisce una piattaforma flessibile in cui le firme olografiche delle cellule possono essere finemente regolate e firme digitali ibride possono essere sintetizzate unendo più lunghezze d'onda, migliorando così il rapporto segnale-rumore e il contrasto dell'immagine Lucas.

Per una migliore caratterizzazione, campioni di precisione posizionati tra due coprioggetti vengono caricati sulla regione attiva dell'array di sensori, illuminati uniformemente dalla sorgente luminosa. Gli ologrammi di diffrazione di ogni cellula o microoggetto all'interno di una soluzione eterogenea vengono proiettati sull'array di sensori formando un'immagine Lucas. Le immagini di diffrazione Lucas acquisite vengono elaborate mediante un algoritmo decisionale sviluppato su misura, che utilizza una libreria statistica di immagini di diffrazione per la caratterizzazione e l'identificazione automatica delle cellule bersaglio o dei microoggetti.

Questa figura mostra un'immagine ottenuta con un obiettivo convenzionale 40x di una soluzione eterogenea composta da microsferette di polistirene e globuli rossi, con dimensioni di cinque, dieci e venti micrometri. La morfologia 3D, l'indice di rifrazione e il grado di complessità intercomparativa di queste particelle sono tutti diversi tra loro.

Alcune di queste caratteristiche possono essere distinte mediante un microscopio convenzionale, ma su un campo visivo molto limitato, inferiore a 0,5 millimetri quadrati sulla piattaforma Lucas. Tutte queste microparticelle presentano pattern olografici univocamente differenti, simili a impronte digitali. Pertanto, possono essere caratterizzate senza alcuna ambiguità sulla base delle loro texture 2D.

Lucas può monitorare un campo visivo estremamente ampio che può raggiungere dimensioni fino a 10-20 centimetri quadrati, di diversi ordini di grandezza più grande rispetto ai microscopi standard basati su lenti. Questa è un'immagine ottenuta con un obiettivo 40x di un campione di sangue intero colorato, acquisita utilizzando la piattaforma Lucas.

Le caratteristiche interne dei globuli bianchi colorati variano efficacemente modificando l'indice di rifrazione e le proprietà di scattering dei nuclei cellulari. L'array di sensori registra schemi di diffrazione distintivi per ciascuna singola cellula. Ciò evidenzia un ulteriore vantaggio della piattaforma Lucas come strumento potente per la citometria e scopi diagnostici al punto di cura.

Come piattaforma completamente automatizzata per la caratterizzazione rapida di cellule di interesse, le immagini di diffrazione di Lucas vengono elaborate digitalmente mediante un software decisionale sviluppato su misura. In questa figura, un'interfaccia elabora una miscela eterogenea di globuli rossi e microsfere. L'algoritmo è robusto nel rilevare regioni ad alta densità nonché particelle con basso rapporto segnale-rumore, come le microsfere di tre micrometri.

Un'immagine elaborata nell'interfaccia personalizzata di Lucas è mostrata qui. Il software consente l'inserimento di diverse specifiche, come la dimensione del pixel del sensore o la lunghezza d'onda dell'illuminazione. Inoltre, è possibile effettuare selezioni sull'immagine e definire modelli cellulari.

Il campione viene contato sulla base di questi dati e l'immagine marcata viene mostrata all'utente. Abbiamo appena mostrato come acquisire immagini e caratterizzare cellule utilizzando la piattaforma ad alto rendimento di Lucas. Nell'eseguire questa procedura, è importante ricordare che gli esperimenti dimostrati possono essere applicati a una vasta gamma di cellule e microparticelle.

Permette inoltre una caratterizzazione cellulare ad alto rendimento e con campo ultra ampio di una soluzione eterogenea. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.