Automatizzato Microfluidic Lysis protocollo di sangue per l'arricchimento di cellule nucleate circolanti

Per arricchire le cellule nucleate circolanti presenti nel sangue. Il dispositivo microfluidico viene innanzitutto condizionato con un XPBS per eliminare le bolle d'aria, quindi vengono fatti passare attraverso il dispositivo, mediante pompe a siringa, acqua deionizzata e 2% di paraformaldeide in due XPBS, prima del caricamento del campione di sangue. Il sangue viene quindi processato attraverso il dispositivo microfluidico e, dopo il processamento del campione, si procede con la centrifugazione e la rimozione del sopranatante.

Infine, il campione viene analizzato mediante citometria a flusso per produrre grafici dot plot. Ciao, sono William White del laboratorio di Biotecnologie Microscalari del Dipartimento di Ingegneria Biomedica dell'Università di Wool. Oggi vi mostreremo una procedura per l'arricchimento di cellule nucleari circolanti mediante lisi del sangue intero tramite microfluidica.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare l'infiammazione in vari processi patologici, al fine di garantire l'arricchimento dei leucociti e di altre cellule circolanti nucleate senza perdita o attivazione. Cominciamo dunque. Per iniziare questa procedura, inserire a pressione il tubo di accesso con un diametro leggermente maggiore rispetto ai fori di canale nei fori di ingresso e uscita.

Quindi, per fornire l'interfaccia tra macro e micro, collegare un ago da siringa da 30 gauge al tubo di ciascun ingresso. Successivamente, riempire una siringa da un millilitro con un XPBS, assicurandosi di eliminare le bolle d'aria. Collegare la siringa all'ingresso uno e spingere delicatamente la siringa a mano finché un XPBS non fuoriesce dall'ingresso due.

Poi bloccare immediatamente l'ingresso due con una graffetta da ufficio. Continuare a spingere la siringa finché una soluzione XPBS raggiunge il porto di uscita del dispositivo microfluidico. Una volta che la soluzione fuoriesce dall'uscita, bloccare il tubo di uscita con un'altra graffetta da ufficio.

Continuare a spingere la siringa da un millilitro finché non fuoriesce un XPBS dall'ingresso tre e chiudere il collegamento dell'ingresso tre con una terza graffetta da ufficio. Il dispositivo microfluidico è ora completamente condizionato. Iniziare la calibrazione delle pompe per siringa utilizzando la grande pompa per siringa Harvard, impostando la configurazione del diametro a 22,5 millimetri e la portata a 600 microlitri al minuto.

Per la piccola pompa per siringhe Harvard, impostare la configurazione del diametro a 4,61 millimetri e la velocità di flusso a 20 microlitri al minuto. Successivamente, riempire una siringa da 30 millilitri con acqua deionizzata prelevando direttamente la soluzione dal tubo conico da 50 millilitri.

Ricordarsi di etichettare la siringa, riempire un'altra siringa da 30 millilitri con due XPBS soluzione al 2% di paraformaldeide. Ancora una volta, aspirare direttamente da un tubo conico ed etichettare la siringa. Collegare ora la siringa contenente acqua all'ingresso due e la siringa con paraformaldeide al 2% in due XPBS all'ingresso tre, assicurandosi che non siano intrappolate bolle nella tubazione o nel dispositivo microfluidico.

Quindi rimuovere le pinze dal tubo di ingresso due, dal tubo di ingresso tre e dal tubo di uscita, mantenendo collegati tutti e tre i siringhe. Procedere unendo le due siringhe grandi sulla pompa per siringhe Harvard di grandi dimensioni e posizionare la siringa da un millilitro sulla pompa per siringhe Harvard piccola. Posizionare il tubo di uscita in un tubo conico da 50 millilitri per la raccolta dei rifiuti.

Ora accendere la pompa per siringa Harvard di grandi dimensioni che contiene le siringhe da 30 millilitri e farla funzionare per un minuto. Verificare che non ci siano bolle d'aria né perdite nel dispositivo o nei tubi. Successivamente, accendere la pompa per siringa Harvard di piccole dimensioni e farla funzionare per un minuto aggiuntivo.

Verifica la presenza di bolle e perdite. Arrestare le pompe dopo due minuti. Poiché il dispositivo microfluidico è ora pronto per essere utilizzato con campioni di sangue, i campioni da analizzare sono stati raccolti come descritto nel protocollo scritto allegato e utilizzati entro un'ora dalla raccolta.

Il primo tubo di sangue raccolto viene scartato per eliminare risultati falsamente positivi. Rimuovere la siringa da un millilitro dalla piccola pompa per siringa Harvard, quindi iniettare un XPBS dalla siringa da un millilitro riempiendo l'ago della siringa. Per evitare l'introduzione di bolle d'aria, riempire una siringa da un millilitro con 50 microlitri di un XPBS senza intrappolare bolle d'aria.

Quindi riempire la siringa con 0,5 millilitri di sangue. Mantenere la siringa in posizione verticale durante il riempimento per evitare il mescolamento del PBS con il sangue. Successivamente, collegare la siringa contenente il sangue nuovamente all'ingresso uno.

Eliminare qualsiasi liquido in eccesso e montare la siringa verticalmente sulla piccola pompa per siringhe Harvard. Fare attenzione a non spingere il sangue attraverso il tubo fino al dispositivo. Rimuovere il tubo di uscita dal tubo di scarto e posizionarlo in una provetta da centrifuga pulita da 50 millilitri posta in un contenitore con ghiaccio.

Ora accendere per primo l'interruttore di avvio della pompa per siringhe Harvard di grandi dimensioni e farla funzionare per un minuto. Successivamente, accendere la pompa per siringhe Harvard di piccole dimensioni. Il campione inizierà a essere raccolto dal tubo di uscita nel tubo da centrifuga da 50 millilitri.

Fare in modo che il campione di sangue nella siringa da un millilitro scorra completamente attraverso il dispositivo, operazione che richiede circa 20 minuti. Quindi arrestare entrambe le pompe. Al termine della corsa, centrifugare il campione raccolto per cinque minuti a 350 ×g a temperatura ambiente con la frenata disattivata.

Rimuovere il soprannatante posizionando la punta della pipetta sul lato opposto al pellet bianco. Rimuovere la maggior quantità possibile di soprannatante, in particolare detriti di globuli rossi, senza disturbare il pellet bianco. Risospendere il campione in un millilitro di buffer per citofluorimetria contenente 1% BSA e 2% paraformaldeide in un XPBS mediante pipettaggio.

Su e giù, trasferire il campione in una microprovetta eppendorf da 1,5 millilitri e centrifugare il campione raccolto per cinque minuti a quattro volte g. A temperatura ambiente, rimuovere il soprannatante con la massima attenzione, come nel precedente passaggio di centrifugazione. Infine, aggiungere un millilitro di buffer per citofluorimetria e vortexare per risospendere il campione, quindi procedere all'analisi del campione mediante citofluorimetria.

Ora mostreremo alcuni risultati rappresentativi sotto forma di grafici fax ottenuti da un campione di sangue arricchito mediante il dispositivo microfluidico e analizzato tramite citometria a flusso. L'importanza dell'arricchimento mediante lisi può essere osservata in un grafico fax in cui i globuli rossi formano un alone. Il diagramma a dispersione prodotto dal protocollo di arricchimento microfluidico è pulito e presenta popolazioni cellulari nucleate ben definite presenti in circolo.

La regione rossa rappresenta i linfociti, quella verde i monociti, quella blu i granulociti, mentre la regione viola non è ancora stata caratterizzata. Il mancato allontanamento dei detriti eritrocitari nel protocollo produce un aggregato di eventi nel grafico fax visibile nella regione ciano. Le popolazioni cellulari possono essere visualizzate in grafici fax separati.

Linfociti mantenuti con CD3 e CD4. Monociti mantenuti con CD14 e granulociti mantenuti con CD66b. Abbiamo appena mostrato come impostare ed eseguire un campione di sangue con il dispositivo microfluidico per la lisi ematica. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di eseguire immediatamente il campione di sangue, evitando che il PBS si mescoli al sangue prima dell'ingresso nel dispositivo e prevenendo l'introduzione di bolle d'aria nei canali del dispositivo.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.